CC BY
80
УДК 579.61, 579.62
Здвижкова И.А., Андрющенко С.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г Оренбург, Россия
E-mail: rattus000@gmail.com
СКРИНИНГ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ ПАТОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
В настоящее время для определения микробиологической безопасности объектов окружающей среды необходима экспертиза, проведение которой занимает несколько суток в случае бактериологического метода. В результате проведения исследований по существующим методикам проводится только видовая идентификация микроорганизмов или, в лучшем случае, определение факторов вирулентности, безусловно-патогенных микроорганизмов. Поэтому в настоящее время актуальной задачей становится не только выявление патогенных и условно-патогенных видов микроорганизмов, но и одномоментное определение их болезнетворного потенциала; прежде всего - основных факторов персистенции микроорганизмов по отношению к организму хозяина.
Проведение скрининга исследуемых генетических детерминант среди 30 штаммов Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae выявило 1 штамм Escherichia coli, несущий оба гена детерминанты гемолитической активности, а также ген энтеротоксина С, 3 штамма Escherichia coli, несущих выявляемые в нашей работе маркеры продукции аэробактина и 1 штамм-носитель маркерных генов колибактина. Установлено, что три штамма Klebsiella pneumoniae, охарактеризованные ранее как носители мегаплазмиды вирулентности, демонстрируют одновременное наличие всех выявляемых генов трех детерминант персистенции: аэробактина, колибактина и периплазматического ингибитора лизоцима. Проведенные исследования позволили установить, что распространенность известных штаммов-носителей генетических маркеров известных детерминант персистенции и патогенности энтеробактерий в кишечной микробиоте клинически здоровых обследуемых лиц не превышает 10%. При этом наблюдается сцепленность нескольких детерминант различной природы у выявленных штаммов-носителей, включая маркер гемолитической активности. Последний факт дополняет данные, полученные в отношении факторов вирулентности диареегенных эшерихий, позволяя разделить перечень маркеров высоковирулентных и условно-патогенных генетических профилей энтеробактерий.
Кроме того, разработанная тест-система позволит одновременно выявлять генетические маркеры пяти известных детерминант персистенции условно-патогенных энтеробактерий с использованием единого алгоритма амплификации, что существенно упрощает процедуру анализа.
Ключевые слова: энтеробактерии, ПЦР-анализ, патогенный потенциал.
В настоящее время для определения микробиологической безопасности объектов окружающей среды необходима экспертиза, проведение которой занимает несколько суток в случае бактериологического метода. В результате проведения исследований по существующим методиках проводится только видовая идентификация микроорганизмов или, в лучшем случае, определение факторов вирулентности, безусловно-патогенных микроорганизмов. Поэтому существенное значение имеет как ускорение анализа, так и повышение его информативности. На сегодняшний день системы экспресс-анализа генетического профиля патогенности широко распространенных инфекционных агентов в нашей стране все еще достаточно редки. В роли экспресс-критерия отбора «подозрительных» в плане патоген-ности энтеробактерий в бактериологической практике традиционно применялась гемолитическая активность изолята и отсутствие у него
способности метаболизировать лактозу. В связи с этим, группой исследователей в 2010 году была произведена оценка информативности отбора штаммов Е.еоН по этим критериям в отношении диареегенных кишечных палочек, продемонстрировавшая неудовлетворительную валидность этого метода даже для цели первичного скрининга на ДГКП [1]. Вместе с тем, за последнее десятилетие был определён целый ряд генетических детерминант, обеспечивающих персистентный и патогенный потенциал условно-патогенных бактерий [2], [3]. Поэтому в настоящее время актуальной задачей становится не только выявление патогенных и условно-патогенных видов микроорганизмов, но и одномоментное определение их болезнетворного потенциала; прежде всего - основных факторов персистенции микроорганизмов по отношению к организму хозяина: сидерофоров, ингибиторов лизоцима и сериновых протеаз, их распространенности и распределения среди
штаммов, выделяемых как из окружающей среды, так и из биоматериалов обследуемых лиц.
Целью настоящего исследования стало осуществление скрининга генетических детерминант известных факторов персистенции условно-патогенных энтеробактерий методом полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы
Для исследования были использованы модельные штаммы и клинические изоляты наиболее часто встречающихся при дисбиозе кишечника видов энтеробактерий: Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae из коллекции штаммов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза, ранее выделенные из кишечника клинически здоровых лиц и идентифицированные по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам с помощью тест-системы «ENTEROtest 24» («ЬаСЬеша», Чехия).
Был составлен перечень изученных генов с доказанной ролью в инфекционных процессах, но до настоящего времени не нашедших широкого применения в массовых тест-системах и в отношении которых до настоящего времени не показано влияние на секретируемые фенотипи-ческие маркеры персистенции (см. табл. 1).
Периплазматический ингибитор лизоцима инактивирует один из ключевых гуморальных (внеклеточных, растворимых) факторов врождённого иммунитета хозяина. Этот гомодимер-ный белок кодируется гомологами гена pliC хромосомы сальмонелл и мегаплазмиды вирулентности клебсиелл, сильно различающимися по первичной аминокислотной последовательности [3]. Поэтому каждый из них требует разработки специфичной праймерной пары [4].
Гемолизин - токсин, образующий поры в мембране клеток хозяина. Этот порообразую-щий белковый токсин кодируется генами hlyA
и hlyC хромосомы кишечной палочки, которые обеспечивают синтез токсина и выделение его из клетки [5].
Аэробактин - сидерофор, связывающий железо для дальнейшего переноса внутрь бактериальной клетки с целью его накопления в биотопах, бедных железом (таких как мочевы-водящий тракт), повышая устойчивость к действию антимикробного белка лактоферрина. Аэробактин представляет собой низкомолекулярное производное лизина и лимонной кислоты, продукция которого кодируется опероном шсАВСБш1А, локализованным в хромосоме кишечной палочки и клебсиел и включающим 5 генов, из которых два - iucB и iucC - непосредственно участвуют в синтезе сидерофора [6].
Колибактин - сидерофор поликетидной природы, способный проникать в ядро клетки хозяина и связываться там с ДНК, нарушая нормальный процесс репликации, становясь фактором риска развития злокачественных опухолей (прежде всего - прямой кишки). Синтез этого пептид-поликетида обеспечивается кластером поликетидсинтазного генного островка рк8, первичными краевыми маркерами которого являются гены clbB и clbN [7], [8].
Энтеротоксин типа С - самотранспортирующийся токсин острой диареи, обладающий способностью инактивировать лизоцим - важный фермент защиты хозяина. Самосекретируе-мая сериновая протеаза кодируется гомологами гена espC хромосомной или плазмидной локализации кишечной палочки [9].
С целью создания экспресс тест-системы скринингового выявления вышеуказанных детерминант методом ПЦР, был осуществлен подбор праймеров видоспецифичного диапазона таким образом, чтобы их отжиг происходил при одном температурном режиме. Автоматизированный синтез праймеров и их после-
Таблица 1 - Тест-система скрининга патогенного потенциала энтеробактерий
Гены Фенотипическая детерминанта Виды-продуценты Пояснение
pliCp Ингибитор лизоцима Klebsiella pneumoniae Фактор антилизоцимной активности
espP Энтеротоксин Escherichia coli
hlvA hJyjC Гемолизин Фактор цитотоксичности
iucB iucC Аэробактин Klebsiella pneumoniae Escherichia, coli Сидерофоры
clbB Колибактин Klebsiella pneumoniae Escherichia coli
clbN Фактор генотоксичности
Здвижкова И.А., Андрющенко С.В.
Скрининг генетических детерминант..
дующая очистка методом полиакриламидного гель-электрофореза выполнены ООО «Синтол» (Россия).
Выделение матричной ДНК для амплификации проводилось путем внесения 2-10 мкл бактериальной массы чистой культуры каждого исследуемого штамма в 0,1 мл смеси реагентов «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Россия) с последующим нагреванием до температуры 98°С в течение 20 мин в программируемом твердотельном термостате «Терцик МС-2» (НПФ «ДНК-тенология», Россия). Затем от раствора ДНК отделялся осадок центрифугированием при 16100 g в течение 2 мин при комнатной температуре. Полученный супернатант вносился в предварительно подготовленную реакционную смесь для ПЦР в объеме 5 мкл [10].
Реакционная смесь для ПЦР в объеме 15 мкл приготовлялась из набора праймеров и реагентов ООО «Синтол» в составе: 2 мкл 25 мМ раствора магния хлорида, 2 мкл 10-кратного ПЦР-буфера Б, 1,6 мкл 2,5 мМ раствора дезок-сирибонуклеотидтрифосфатов, 0,5 мкл 10 мкМ смеси праймеров, 0,2 мкл 5 ед/мкл раствора Тад-полимеразы и 8,7 мкл деионизованной воды. С целью предотвращения испарения воды из реакционной смеси, на её поверхность наносилось 20-30 мкл стерильного парафинового масла для наборов "М1КЯОЬЛТБ8Т" («БгЬа ЬаеЬеша», Чехия).
Реакция проводилась в ДНК-амплификаторе «Терцик МС-2» в режиме ускоренного регулирования температуры по единому оптимизированному трехфазному алгоритму с температурой отжига 65°C для праймерных пар ко всем вышеуказанным маркерным последовательностям длительностью 30 циклов (рис. 1).
Получаемые ампликоны подвергались ага-розному гель-электрофорезу [11]. Регистрация результатов производилась на основе присутствия полос люминесценции бромида этидия в агарозном геле, расположенных в диапазоне молекулярных масс, соответствующих локализации маркерных фрагментов.
Результаты и обсуждение
Электрофоретическое разделение результатов реакций амплификации подтвердило работоспособность системы и специфичность получаемых результатов, выявив наличие единичных ампликонов в области ожидаемого диапазона молекулярных масс.
Проведение скрининга исследуемых генетических детерминант среди 30 штаммов Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae выявило 1 штамм Escherichia coli, несущий оба гена детерминанты гемолитической активности, а также ген энтеротоксина С (рис. 2), 3 штамма Escherichia coli, несущих выявляемые в нашей работе маркеры продукции аэробактина (рис. 3) и 1 штамм-носитель маркерных генов коли-
Рисунок 1 - Экспериментально подобранная программа амплификации
бактина (рис. 4). Установлено, что три штамма Klebsiella pneumoniae, охарактеризованные ранее как носители мегаплазмиды вирулентности, демонстрируют одновременное наличие всех выявляемых генов трех детерминант персистенции: аэробактина, колибактина и периплазмати-ческого ингибитора лизоцима.
Кроме того, в случае аэробактина удалось совместить праймеры для выявления обоих маркеров в одной пробе в виде мультиплекс-теста (рис. 5).
Таким образом, разработанная тест-система позволит одновременно выявлять генетические маркеры пяти известных детерминант перси-стенции условно-патогенных энтеробактерий с использованием единого алгоритма ампли-
фикации, что существенно упрощает процедуру анализа.
Установлено, что распространенность известных штаммов-носителей генетических маркеров известных детерминант персистен-ции и патогенности энтеробактерий в кишечной микробиоте клинически здоровых обследуе-
217 276 277 278
Рисунок 2 - Фореграмма результатов разделения
ампликонов генов hlyA, hlyC и espP штамма E. coli ICIS-61 в агарозном геле вместе с маркером молекулярных масс pBS/MspI.
Рисунок 4 - Фореграмма результатов реакции амплификации двух маркерных генов колибактина clbB, clbN клебсиелл-носителей мегаплазмиды вирулентности и штамма E. coli ICIS-217.
Рисунок 3 - Фореграмма результатов реакции амплификации двух гомологов генов аэробактина iucB, iucC исследуемых штаммов E.coli
Рисунок 5 - Фореграмма результатов множественной ПЦР двух гомологов генов аэробактина iucB, iucC клебсиелл-носителей мегаплазмиды вирулентности
Здвижкова И.А., Андрющенко С.В._
мых лиц не превышает 10%. При этом наблюдается сцепленность нескольких детерминант различной природы у выявленных штаммов-носителей, включая маркер гемолитической активности. Последний факт дополняет данные,
_Скрининг генетических детерминант...
полученные в отношении факторов вирулентности диареегенных эшерихий, позволяя разделить перечень маркеров высоковирулентных и условно-патогенных генетических профилей энтеробактерий.
03.10.2017
Работа выполнена в рамках проекта Программы УрО РАН: «Фундаментальные науки - медицине» проект № 15-3-4-36 «Механизмы микробной регуляции ассоциативного симбиоза при инфекции»
Список литературы:
1. Результаты применения методов амплификации нуклеиновых кислот для выявления диарогенных E.coli / Т.А. Коновалова, А.В. Бондарева, А.Т. Подколзин [и др.] - Молекулярная диагностика - 2010.VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, Москва. - 2010. - Т. 2. - С. 348-350.
2. Aerobactin, but not yersiniabactin, salmochelin, or enterobactin, enables the growth/survival of hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae ex vivo and in vivo / A. Thomas, A. Russo, R. Olson [et al] // Infection and Immunity. - 2015.- V.83 (8) - P. 3325-3333.
3. Callewaert, L. New family of lysozyme inhibitors contributing to lysozyme tolerance in gram-negative bacteria / L. Callewaert, A. Aertsen, D. Deckers // PLoS Pathog., 2008. - №3 - С.1-9.
4. Перунова, Н.Б. Генетические детерминанты секретируемых ингибиторов лизоцима и антилизоцимный фенотип энтеробактерий / Н.Б. Перунова, С.В. Андрющенко, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012.
- № 6. - С.8-12
5. Lepek, G. Relation between the hemolytic property and iron metabolism in Escherichia coli / G. Lepek.,Hans-Martin Gruenig // Infection and immunity, 1985. - №3 - P. 682-686.
6. Williams, P.H. Iron, siderophores, and the pursuit of virulence: independence of the aerobactin and enterochelin iron uptake systems in Escherichia coli / P.H. Williams, N.H. Carbonetti // Infect Immun. - 1986. - Vol. 51. - No. 3. - P. 942-947.
7. Interplay between siderophores and colibactin genotoxin biosynthetic pathways in Escherichia coli / P. Martin , I. Marcq, G. Magistro [et al] // PLOS Pathogens. - 2013.- №7 - P. 1-14
8. Molecular epidemiology and phylogenetic distribution of the Escherichia coli pks genomic island / R. James, J. Johnson, J. Brian [et al] // Journal of clinical microbiology. - 2008. -№12 - P. 3906-3911.
9. Seema, K. Identification and molecular characterization of eatA, an autotransporter protein of enterotoxigenic Escherichia coli / K. Seema, J. Dotson, P. Kenneth // Infection and Immunity. - 2004. -№3 - P.1786 -1794.
10. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени» /Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов [др.] / под ред. д.б.н. Д.В.Ребрикова.
- М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. - 233 с.
11. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир, 1984. - С. 159-168.
Сведения об авторах:
Здвижкова Ирина Александровна, лаборант-исследователь Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел. (3532)775417; e-mail: zdvizhkova.irina@gmail.com
Андрющенко Сергей Валерьевич, старший научный сотрудник Института клеточного
и внутриклеточного симбиоза УрО РАН; к.м.н. 460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, тел. (3532)775417; e-mail: rattus000@gmail.com
