CC BY
111
6. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Киреев М.П., Федорова В.А., Аленкина Т.В. и др. Новый способ получения О-антигена холерного, очищенного с целью создания холерных диагностических антисывороток. Биотехнология. 2002; 2: 42-6.
7. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патоген-ности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285—03. Бюллетень нормативных и методических документов. М.: Госсанэпиднадзор; 2003; 3 (13): 61—144.
REFERENCES
1. Letter of Rospotrebnadzor from 06.04.2012 № 01/3540-12-32 "On the epidemic situation of cholera in the world and to predict the incidence of cholera in 2012". Avaible at: http://rospotrebnadzor.ru/ rss_all/-/asset_publisher/Kq6J/content/id/1211733/ fin Russian).
2. Laboratory diagnosis of cholera: Methodical instructions MUK 4.2.2218—07. Moscow: Federal'nyy tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora; 2007. (in Russian)
3. Jin Da-Zhi, Xu Xiao-Jing, Chen Su-Hong, Wen Si-Yuan, Ma Xue-En, Zhang Zheng et al. Detection and identification of enterohemorrhagic
Escherichia coli O157:H7 and Vibrio cholerae O139 using oligonucleotide microarray. Infectious Agents and Cancer. 2007; 2: 23—33.
4. Panicker G., Call D.R., Krug M.J., Bej A.K. Detection of Pathogenic Vibrio spp. In Shellfish by Using Multiplex PCR and DNA Microarrays. Appl. and Environmental Microbiology. 2004; 70 (12): 7436—44.
5. Vora G.J., Meador C.E., Bird M.M., Bopp C.A., Andreadis J.D., Stenger D.A. Microarray-based detection of genetic heterogeneity, antimicrobial resistance, and the viable but nonculturable state in human pathogenic Vibrio spp. PNAS. 2005; 102 (52): 19 109—14.
6. Gromova O.V., Dzhaparidze M.N., Dyatlov I.A., Kireev M.P., Fedo-rova V.A., Alenkina T.V. et al. A new method of obtaining O-antigen of cholera and purified with the purpose of creation of cholera diagnostic antiserum. Biotekhnologiya. 2002; 2: 42—6. (in Russian)
7. Safety of work with microorganisms of I-II groups of pathogenicity. Sanitary-epidemiological rules SP 1.3.1285-03. Bulleten' norma-tivnykh i metodicheskikh dokumentov. Moscow: Gossanepidnadzor; 2003; 3 (13): 61—144. (in Russian)
Поступила 26.03.14 Received 26.03.14
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2015 УДК 579.873.13:579.253]:615.281
Беляева Е.А.1, Червинец Ю.в.1, Червинец в.М.1, Трошин А.Б.1, Миронов А.Ю.2, Незаметдинова в.З.3, Аверина О.в.3, Даниленко в.Н.3
ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОБИОТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ РОДА BIFIDOBACTERIUM, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЖИТЕЛЕЙ ЦЕНТРАЛЬНОГО РЕГИОНА РОССИИ
1ГБОУ вПО «Тверская ГМА» Минздрава России, 170100, Тверь; 2ГБОУ вПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва; 3«Институт общей генетики им. Н.И. вавилова» РАН, 119991, Москва
Из 156 образцов фекалий, полученный: от здоровыо: коренный: жителей Центрального региона России, сформирована коллекция из 87 штаммов бифидобактерий, из который: отобрано 5 штаммов с широкой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Отобранные штаммы характеризуются высоким пробиотическим потенциалом; обладают адгезивными свойствами и чувствительностью к антибиотикам и химиопрепаратам, соответствующими основным требованиям общих фармакопейный: статей к штаммам микроорганизмов, используемых в производстве пробиотиков для медицинского применения. Данные штаммы бифидобактерий могут быть рекомендованы для создания эффективных пробиотических лекарственных препаратов, ориентированных на жителей Центрального региона России.
Ключевые слова: бифидобактерии; региональные пробиотические фармпрепараты.
BeliaevaE.A.1, Chervinetz YuV.1, Chervinetz V.M.1, TroshinA.V1, MironovA.Yu.2, Nezametdinova V.Z.3, Averina O.V3, Danilenko V.N.3
THE CHARACTERISTICS OF PROBIOTIC PROPERTIES OF STRAINS OF GENUS OF BIFIDOBACTERIUM SEPARATED FROM GASTROINTESTINAL TRACT OF RESIDENTS OF THE CENTRAL REGION OF RUSSIA
1 The Tver state medical academy of Minzdrav of Russia, 170100, Tver, Russia; 2 The G.N. Gabrichevskii Moscow research institute of epidemiology and microbiology, 125212, Moscow, Russia; 3 The N.I. Vavilov institute of general genetics of the Russian academy of sciences, 119991, Moscow, Russia
The 156 samples of feces separatedfrom healthy residents of the Central region ofRussia were used to compose collection of 87 strains of Bifidobacterium out of which 5 strains with wide antagonistic activity related to pathogenic and opportunistic microorganisms were .selected. The .selected strains are characterized by high probiotic potentials. They have adhesive properties and sensitivity to antibiotics and preparations corresponding to main requirements of common pharmacopoeia articles to strains of microorganisms used in production of probiotics for medicinal application. The given strains of Bifidobacterium can be recommended for development of effective probiotic pharmaceuticals directed to residents of the Central region of Russia.
Keywords: Bifidobacterium; regional probiotic pharmaceutical
Для корреспонденции:
Беляева Екатерина Андреевна (Belyaeva Ekaterina Andreevna), ассистент каф. микробиологии. Адрес: 170100, Тверь, ул. Советская, 4 E-mail: eabelyaeva1@mail.ru
Праймеры
Введение. В последние годы наблюдается повышенный интерес к изучению бифидобактерий в связи с их пробиоти-ческими свойствами и способностью положительно влиять на здоровье человека [1]. Бифидобактерии являются важнейшим компонентом микробиоты человека [2]. Они играют важную роль в процессах переваривания и усвоения пищи, синтезируют биологически активные вещества, подавляют патогенную микрофлору, оказывают выраженное иммуностимулирующее действие [3-9]. Сегодня большое внимание уделяется созданию новых фармпрепаратов на основе проби-отических штаммов лактобацилл и бифидобактерий [10-13]. Минздравом РФ в 2013 г. разработан новый комплекс общих фармакопейных статей (ОФС) (http://www.rosminzdrav.ru/ docs/mzsr/regulation/81), определяющих основные требования к штаммам микроорганизмов, используемых в производстве пробиотиков для медицинского применения. Это должны быть производственные штаммы, выделенные из организма человека, с подтвержденным клиническим эффектом, депонированные в национальной или международной коллекции, идентифицированные до вида по фено-и генотипическим признакам, охарактеризованные по физиолого-биохимическим свойствам, спектру антагонистической активности к тест-штаммам патогенных и условно-патогенных культур; должны быть апатогенны и безопасны, не продуцировать ферменты патогенности [14-16]. Отбор новых перспективных пробиотических штаммов следует вести в соответствии с данными требованиями.
Важно, чтобы штаммы были генетически стабильны и сохраняли важные пробиотические свойства в процессе культивирования и производства пробиотиков для медицинского применения. Производственные штаммы, созданные несколько десятилетий назад, могут терять ряд генов в процессе многолетнего нахождения в лаборатории без соответствующего генетического и биологического контроля их свойств. При отборе новых штаммов рекомендуется проводить полногеномное секвенирование и контролировать генетическую стабильность [17, 18].
Ведутся интенсивные исследования микробио-ма человека, установлено существование трех энте-ротипов микробиома в желудочно-кишечном тракте человека [19]. В результате исследований, проведенных в России, выявлены и другие энтеротипы, специфичные для российского населения [20]. Применение пробиотических препаратов может быть более эффективным при большей персонификации. Микробиота человека неодинакова у людей разных континентов, стран, регионов, так как существует тесная взаимосвязь между индигенной микрофлорой человека, его организмом и экзогенными факторами окружающей среды. Она зависит от генотипа, образа жизни, питания [19-21]. Показана связь между изменениями в микробиоте человека и развитием различных заболеваний [22, 23]. Создание эффективных пробиотиков, направленных на коррекцию микрофлоры как здоровых, так и больных людей, проживающих в определенном регионе, является актуальной задачей.
Приведенные данные позволяют сформулировать новый подход к получению пробиотических штаммов, в том числе бифидобактерий. Необходимо формировать новые коллекции штаммов бифидобактерий, выделенных от людей, проживающих в разных регионах России, проводить детальную характеристику штаммов современными биохимическими, генетическими, молекулярно-биологическими и иммунобиологическими методами, включая полногеномное секвенирование и аннотацию генома по комплексу ключевых генов. Отбирать перспективные для производства
пробиотических фармпрепаратов штаммы, предназначенные для жителей разных регионов нашей страны. На базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН в сотрудничестве с ГБОУ ВПО "Тверская ГМА" Минздрава России ведется работа по созданию криобанка образцов микробиоты кишечника человека, формируется коллекция штаммов бифидобактерий, выделенных от жителей различных регионов России, с целью получения новых пробиотических штаммов для производства современных лекарственных препаратов, адаптированных для населения конкретных регионов (региональные пробиотические фармпрепараты). Данная работа является первым этапом в осуществлении этой программы.
Цель исследования - выделить штаммы бифидобактерий от здоровых людей, проживающих в Центральном федеральном округе (ЦФО), сформировать коллекцию штаммов би-фидобактерий, провести отбор антагонистически активных безопасных штаммов и их анализ в соответствии с требованиями ОФС по пробиотическим свойствам.
Таблица 1
для генотипирования и определения пробиотических генов
Олигонук-леотид Структура олигонуклеотида 5'—3' Ожидаемый размер ПЦР фрагмента, нуклеотиды
Праймеры для видотипирования
16SLN GTG GAG GGT ТСС ATT СТО ОСТ 1550
16SLC AGA AAG GAG GTG АТС СAG ^G
Гидролиз олиго- и полисахаридов
aeg N AGT TCG GСG TTA ТСС TTG С
aeg С TCG TGG GСA TAС A^ TTG G 248
eara N СAA GСA СAG СAС СGA CTA СС
eara С GAA СGT СAT СТС GAС СТТ GС 214
xynD N GTGAAGTAGСTСGGTGTСTGС
xynD С AGG GTG СТТ ACT СGT ATG AAG G 176
bglC N GTG СТС ATC AGС ТСС AAG С
bglC С GAA GGT GAT СGG СAG TCG 201
glu N AСA AGС СAT ТСС TGT TCA СС
glu С AAG TCG СAG AGG ТТС СAT A^ 172
Адгезия
lex N TAС СAС AСA GСA GCT СAT СG
lex С GAA AСG GTC AСG AAС AGA СС 195
cpaF N GTA ^G ТСС AGG CTG ATT ТС
cpaF С ^A GTT СAС СAT GTG CTA С 167
Иммуномодуляция
sor N СAС TTG GAA СAG AСС TСA CTA СС
sor С СAG TTG TTT GGС ATС AGT СG 207
epr N СAG TTG TTT GGС ATС AGT СG
epr С ТСС TСG ТСС AСA AAG AAT GС 183
ser N TAС ТСТ ССТ GCT TCG ATG TGG
ser С ТСТ ТСТ TGA СGG TGG ATT GG 244
Синтез экзополисахаридов
mrcB2 N TGA ATG TGT GGG CTA ТСТ GG
mrcB2 С TGT TGG TGT TGT TGG AСA GG 249
Антиканцерогенная активность
but N CTG GAG AAG GСG ATG AAG G
but С GGT GTT СGT GGA СAG AAT СG 246
Таблица 2
Биохимические характеристики штаммов бифидобактерий
Биохимиче- B. longum B. longum B. bifidum B. adolescentis B. angulatum
ские свойства 201 264 172 191 212
Утилизация - - - - -
триптофана
Синтез - - - - -
уреазы
Утилизация + + + + +
глюкозы
Утилизация - +- - +
маннитола
Утилизация + + + + +
лактозы
Утилизация + +- + +
сахарозы
Утилизация + +- + +
мальтозы
Утилизация - -- - +
салицина
Утилизация + - + - +
ксилозы
Утилизация + +- + +
арабинозы
Разжижение - -- - -
желатина
Утилизация - -- - -
эскулина
Утилизация - -- - -
глицерола
Утилизация - -- - -
целлюлозы
Утилизация + -- - -
маннозы
Утилизация + +- + -
мелезитозы
Утилизация + +- + +
раффинозы
Утилизация - +- - -
сорбитола
Утилизация - -- - -
рамнозы
Утилизация - -- - -
трегалозы
Синтез ката- - -- - -
лазы
Материалы и методы. Материал для исследования - образцы фекалий 156 здоровых людей в возрасте от 18 лет до 21 года (120 девушек и 36 юношей), коренных жителей ЦФО (Тверская, Московская, Ярославская, Брянская и другие области). У всех испытуемых проводилось анкетирование с целью сбора информации о родословной, личных параметрах, месте проживания, типе питания. Все люди на момент обследования были клинически здоровы, не имели в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний желудочно-кишечного тракта. Для выделения бифидобактерий использован Schae-dler Agar (BBL®) с кровью с последующим культивированием в анаэробных условиях, посевом на селективную среду, содержащую антибиотик мупироцин (100 мкг/мл), и микроскопией для определения морфологических и тинкториаль-ных свойств. Чистые культуры бифидобактерий выращивали
в Bifidobacterium Broth («HiMedia», Индия), на MRS-агаре («HiMedia», Индия) с добавлением 0,5 г/л цистеина («HiMedia», Индия). Культивирование проводили в анаэробных условиях (HiAnaerobic System - Mark III, AnaeroHiGas Pack 3,5 L; «HiMedia», Индия) при температуре 37oC в течение 24-48 ч.
Для выделения антагонистически активных штаммов бифидобактерий проведено первичное изучение их антагонизма по отношению к индикаторному штамму Escherichia coli BVK 083 методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде с отбором штаммов.
Биохимическая идентификация проводилась с помощью тест-системы api® 20А (bio Mérieux) и программного обеспечения API WEB.
Видотипирование и определение пробио-тических генов проводились на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Родовое и видовое генетическое типирование бифидобактерий проводилось методом амплификации (ПЦР) и последующего секвенирова-ния последовательности гена 16S рРНК. Наличие пробиотических генов изучали методом ПЦР. Праймеры для ПЦР синтезированы в ЗАО "Синтол" (Москва, Россия) (табл. 1). Амплификация ДНК проводилась с использованием набора реактивов "Амплификация" (Dialat Ltd., Москва, Россия) на приборе Терцик ТП 4-ПЦР 01 («ДНК-Технология», Россия). Реакционная смесь ПЦР для каждого гена (объем 25 мкл) содержала 50-75 нг геномной ДНК и по 5 пкМ каждого из соответствующей пары праймеров, а также 1,25 мкл DMSO и 2 мкл 50 мM MgCl2 Режим амплификации: нагрев в течение 5 мин при 95oC, затем 30 циклов - денатурация 1 мин при 94oC, отжиг 1 мин при 54-66oC (температура отжига подбиралась для каждой пары праймеров), достройка цепи 1 мин при 72oc, финальная достройка 5 мин при 72oC. Электрофорез продуктов амплификации ДНК проводили в горизонтальном агарозном геле в трис-боратном буфере. Использованы маркеры молекулярной массы Gene Ruler 100 bp Plus DNA Ladder («Fermentas», Литва). Нуклеотидную последовательность ДНК определяли методом Сэнгера на приборе Applied Biosystem Genetic Analysator 3100.
Антагонистическая активность бифидобак-терий изучена методом отсроченного антагонизма по отношению к тест-штаммам: Staphylococcus aureus 25923, Candida albicans 885-653, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534 [24].
Для выявления факторов патогенности би-фидобактерий определялось наличие лецитиназной, казеи-нолитической, уреазной, желатиназной, нуклеазной, каталаз-ной, гемолитической активности [15].
Для определения факторов персистентности устанавливали степень адгезии микроорганизмов, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) [15] на эритроцитах человека 0 (I) группы Rh+.
Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам (цефуроксиму, цефаклору, ципрофлоксацину, ван-комицину, фузидину, цефалотину, цефазолину, цефалексину, рокситромицину, клиндамицину, линезолиду, меропенему, оксациллину, эритромицину, линкомицину, рифампицину, бензилпенициллину, амикацину и гентамицину) определяли методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton в соответствии с методиками, рекомендованными NCCLS, с помощью
Таблица 3
Пробиотические гены в геноме штаммов B. longum 201 и B. longum 264
Пробиотические гены B. longum 201 B. longum 264
Гидролиз олиго- и полисахаридов
Арабиногалактанэндо-ß-галактозидаза aeg - -
Эндо-1,4-в-ксиланаза D xynD + +
Эндо-1,5-а-1-арабинозидаза eara + +
Эндоглюканазы bglC + +
ß-глюкуронидаза glu + +
Адгезия
Белок, образующий flp-пили АТФазы cpaF + +
Большой экзопротеин, вовлеченный в адгезию lex + +
Иммуномодуляция
Внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию ксиланов и арабинана epr + +
Сортазаподобный белок sor + +
Ингибитор сериновой протеазы ser + +
Синтез экзополисахаридов
Мембранные карбокси-пептидазы mrcB2 + +
Антиканцерогенная активность
Бутирил-CoA-дегидрогеназа but + +
стандартных дисков фирмы BBL [25].
Для систематизации и обработки полученных данных создана база данных в формате Excel. Вычисляли средние значения, стандартное отклонение, стандартную ошибку.
Результаты и обсуждение. Из 156 образцов фекалий на основании морфологических, тинкториальных, культураль-ных свойств выделено 87 штаммов бифидобактерий. Сформирована коллекция штаммов бифидобактерий, полученных от здоровых жителей ЦФО России. Из 87 штаммов отобрано 5 антагонистически активных штаммов бифидобактерий, проявляющих антагонизм к индикаторному штамму E. coli BVK083. Генетическая идентификация определила видовую принадлежность данных штаммов как Bifidobacterium longum 201, Bifidobacterium longum 264, Bifidobacterium bi-fidum 172, Bifidobacterium adolescentis 191, Bifidobacterium angulatum 212. Биохимическая идентификация показала, что отобранные штаммы имеют разнообразные биохимические характеристики (табл. 2).
Для штаммов B. longum 201 и B. longum 264 поведен поиск важных генов, определяющих пробиотические свойства. Это гены, кодирующие эндо- и экзогликозидазы, участвующие в гидролизе олиго- и полисахаридов; гены, определяющие адгезивные и иммуномодулирующие свойства бактерий; гены, участвующие в снижении риска развития онкологических заболеваний. На основе базы данных аннотированных секве-нированных геномов (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) методами биоинформатического анализа в составе геномов штаммов бифидобактерий, относящихся к виду B. longum, выявлен и отобран для анализа ряд пробиотических генов, к которым подобраны праймеры, комплементарные к консервативным участкам генов (см. табл. 1).
Бифидобактерии имеют мощную ферментную систему, участвующую в процессах разрушения и утилизации олиго-и полисахаридов, входящих в состав пищевых растительных субстратов, не переваренных в верхних отделах желудочно-кишечного тракта человека [2]. Наиболее важными являются секретируемые гликозидазы, которые дают бактериям преимущество в конкуренции за пищевые субстраты в пределах занимаемой экологической ниши [26]. Наличие генов, кодирующих секретируемые гликозидазы, участвующие в гидролизе олиго- и полисахаридов, является важным фактором при отборе активных штаммов бифидобактерий. В исследуемых геномах проведен поиск генов: арабиногалактан эндо-в-галактозидазы (aeg), эндо-1,4-в-ксиланазы (xynD), эндо-1,5-а-1-арабинозидазы (eara); эндоглюканазы (bglC) и ß-тюкуронидаза (glu). В обоих геномах найдены все исследуемые гены, кроме гена, кодирующего эндо-в-галактозидазу (табл. 3).
Способность к адгезии может рассматриваться как селективный критерий для отбора пробиотиков, поскольку позволяет им конкурировать с патогенными бактериями, вытесняя их с поверхности эпителия кишечника [27]. В проявлении способностей к адгезии у бифидобактерий участвует ряд генов. Для быстрого скрининга отобраны гены, кодирующие: белок, образующий flp-пили (cpaF) и большой экзопротеин, вовлеченный в адгезию (lex). ПЦР-анализ показал наличие обоих генов в составе исследуемых геномов (см. табл. 3).
Важным пробиотическим свойством является способность бактерий к иммуномодуляции. Иммуномодулирую-щим свойством обладают секретируемые или находящиеся на поверхности бактерий молекулы [28]. К ним можно отнести ген, участвующий в образовании пилей, мембранные карбоксипептидазы, участвующие в синтезе экзополисаха-ридов (mrcB2), гены, кодирующие секретируемые молекулы: внеклеточный белок, вовлеченный в деградацию ксиланов и арабинана (epr), сортазаподобный белок (sor), ингибитор сериновой протеазы (ser). Данные гены найдены в составе исследуемых геномов (см. табл. 3).
Важным пробиотическим свойством бактерий является их способность участвовать в снижении риска развития онкологических заболеваний человека. Масляная кислота, продуцируемая пробиотическими бактериями, является важным антиканцерогенным агентом [29]. Ген, кодирующий бутирил-CoA-дегидрогеназу (but), найден в исследуемых штаммах (см. табл. 3).
Рис. 1. Антагонистическая активность бифидобактерий (Б. longum 201, B. longum 264, B. bifidum 172) по отношению к B. suЫШs 534. Для других штаммов бифидобактерий результаты аналогичные.
se
Таблица 4
Антагонистическая активность бифидобактерий
Штаммы Штаммы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов
бифидобактерий C. albicans ATCC 885-653 S. typhimurium 415 S. sonnei I фазы 941 B. subtilis 534 E. coli BVK083 P. aeruginosa ATCC9027 S. aureus 25923
B. bifidum 172 0 22±1* 35±2* 35±2* 35±2* 35±2* 35±2*
B. adolescentis 191 0 35±2* 35±2* 35±2* 35±2* 35±2* 30±1*
B. longum 201 0 35±2* 30±1* 35±2* 30±1* 35±2* 35±2*
B. angulatum 212 0 35±2* 34±2* 35±2* 30±1* 35±2* 25±1*
B. longum 264 0 21±1* 25±1* 21±1* 21±1* 21±1* 28±1*
Примечание. * - зона отсутствия роста (в мм).
Микробиота человека неодинакова у людей разных континентов, стран, регионов. Как показал сравнительный анализ нуклеотидной последовательности полностью секвенированных геномов штаммов бифидобактерий B. longum, выделенных в различных странах, в том числе в России, несмотря на высокую степень гомологии, каждый геном содержит уникальные гены, не имеющие гомологов. Только в геномах российских штаммов выявлено 9 уникальных генов, из которых 5 генов обнаружены в штамме B. longum 264. Это гены, кодирующие: гликозилтрансфе-разу 1-й группы семейства протеинов, гликозилтрансфе-разу 2-й группы семейства протеинов, ацетилтрансферазу, аспартат-аммоний-лигазу, гидантоиназную субъединицу бета. Это свидетельствует о наличии региональной связи между отечественными штаммами и указывает на необходимость их использования для населения того региона, где они выделены.
Проведенные исследования позволили выявить в исследуемых штаммах B. longum 201 и B. longum 264 важные про-биотические гены, что позволяет рекомендовать их в качестве региональных, эффективных пробиотиков.
Все штаммы проявили высокую антагонистическую активность по отношению к S. aureus 25923, P. aeruginosa ATCC 9027, S. typhimurium 415, S. sonnei I фазы 941, B. subtilis 534 (рис. 1), E. coli BVK 083. Ни один из штаммов бифидобактерий не оказал влияния на Candida albicans 885-653 (табл. 4).
При исследовании пяти антагонистически активных штаммов бифидобактерий лецитиназной, казеинолитиче-ской, уреазной, желатиназной, нуклеазной, каталазной, гемолитической активности у данных бактерий не обнаружено
Гентамицин Амикацин Бензилпенициллин Оксациллин Рифампицин Эритромицин Линкомицин Ванкомицин Рокситромицин Клиндамицин Меропенем Линезолид Цефапексин Цефазолин Цефалотин Фузидин Ципрофлоксацин Цефаклор Цефуроксин
'////////////////////////////Л ////////////////////////////////////////I
///////////////////////////////////////Л ■///////////////////////////////////////А
ю о о.
'///////////////////////////////////////Л '///////////////////////////////////////Л '///////////////////////////////////////X
'//////////////////////////////////////л
//////////////////////////////////////////////7777,1 //////////////////////////////////////////////7777}
//////////////////////////////////////////////7777\ /////////////////////////////////////////////77777)
'////////// //////////////////// ////////////////77771 '//////////////////////////////////////////////77771
У////////////////////////////////////////////^7Я //////////////////////////////////////////////7777Л
//////////////////////////////////////////////7777* //////////////////////////////////////////////7777i //////////////////////////////////////////////77771
о
20
40
60
80 100%
вышеупомянутой активности. Все штаммы не имеют указанных фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов патогенности.
Средний показатель адгезии (СПА) бифидобактерий кишечника колебался от 1,24 до 2,12, в среднем составил 1,74±0,2. Пять штаммов бифидобактерий имели значение ад-гезивности (табл. 5), удовлетворяющее требованиям ОФС к штаммам микроорганизмов, используемых для производства пробиотических фармпрепаратов [15].
Все штаммы бифидобактерий проявили чувствительность к цефуроксиму, цефаклору, ципрофлоксацину, ванко-мицину, фузидину, цефалотину, цефазолину, цефалексину, рокситромицину, клиндамицину, линезолиду, меропенему, 4 штамма - к оксациллину, эритромицину, линкомицину, ри-фампицину, бензилпенициллину и амикацину, 3 штамма - к гентамицину (рис. 2).
Заключение. Сформирована коллекция из 87 штаммов бифидобактерий, характерных для жителей ЦФО России. Отобраны 5 штаммов бифидобактерий: B. longum 201, B. longum 264, B. bifidum 172, B. adolescentis 191, B. angulatum 212. Проведены их видотипирование и первичный анализ в соответствии с требованиями ОФС по пробиотическим свойствам. Штаммы обладают высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. По чувствительности к антибиотикам, адгезивным свойствам, безопасности, непатогенности они соответствуют основным требованиям ОФС к штаммам микроорганизмов, используемых для производства пробиотиков для медицинского применения. Отобранные штаммы несут широкий спектр полезных пробиотических признаков. Они могут быть рекомендованы в качестве основы для создания фармпрепаратов. Планируется провести исследование иммуномодулирующих свойств штаммов в соответствии с международными требованиями, изучить другие пробио-тические характеристики и в зависимости от полученных результатов использовать данные штаммы для разработки на их основе фармабиотиков для лечения гастроэнтерологических, иммунологических, онкологических, нейродеге-неративных и других заболеваний [30-34].
Таблица 5
Средний показатель адгезии штаммов бифидобактерий (X±m)
Рис. 2. Чувствительность бифидобактерий к антимикробным препаратам.
Штаммы бифидобактерий СПА (M±m)
B. bufidum 172 2,12±0,21
B. adolescentis191 1,24±0,19
B. longum 201 2,08±0,16
B. angulatum 212 1,56±0,22
B. longum 264 1,68±0,24
ЛИТЕРАТУРА
7. Червинец Ю.В., Беляева Е.А., Червинец В.М., Самоукина А.М., Михайлова Е.С., Пятова А.И., Червинец А.В. Нарушения микро-биоты желудочно-кишечного тракта здоровых людей. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2013; 3: 55-8.
8. Червинец В.М., Червинец Ю.В., Михайлова Е.С., Самоукина А.М., Беляева Е.А., Миронов А.Ю. Микробиоценоз кишечника и иммунный статус у детей младшего школьного возраста. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 1: 49-51.
9. Червинец Ю.В., Ботина С.Г., Глазова А.А., Коробан Н.В., Червинец
B.М., Самоукина А.М., Гаврилова О.А., Лебедев Д.В., Миронов А.Ю. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лактобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей. Клиническая лабораторная диагностика. 2011; 2: 44-6.
10. Червинец Ю.В., Червинец В.М., Миронов А.Ю., Ботина С.Г., Гагарина Е.Ю., Самоукина А.М., Михайлова Е.С. Индигенные лак-тобациллы полости рта человека - кандидаты в пробиотические штаммы. Курский научно-практический вестник «Человек и здоровье». 2012; 1: 131-7.
13. 7 ОФС Пробиотики для медицинского применения. Общие фармакопейные статьи и фармакопейные статьи на иммунобиологические лекарственные средства и методы оценки их качества, Минздрав России, http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81.
14. 8 ОФС Требования к штаммам микроорганизмов, используемые для производства пробиотиков для медицинского применения. Общие фармакопейные статьи и фармакопейные статьи на иммунобиологические лекарственные средства и методы оценки их качества, Минздрав России, http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/ regulation/81.
15. 13 ОФС Бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения. Общие фармакопейные статьи и фармакопейные статьи на иммунобиологические лекарственные средства и методы оценки их качества, Минздрав России, http://www.rosminzdrav.ru/docs/ mzsr/regulation/81.
23. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова Н.А., Самоукина А.М., Червинец В.М. Бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл. Журнал микробиологии. 2006; 7: 78-82.
REFERENCES
1. Ventura М., O'Flaherty S., Claesson M. J., Turroni F., Klaenhammer T. R., van Sinderen D., O'Toole P. W. Genome-scale analyses of health-promoting bacteria: probiogenomics. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7: 61-71.
2. Turroni F., Ribbera A., Foroni E., van Sinderen D., Ventura M. Human gut microbiota and bifidobacteria: from composition to functionality. A van Leeuw J. Microb. 2008; 94: 35-50.
3. Imaoka A. et al. Anti-inflammatory activity of probiotic Bifidobacterium: enhancement of IL-10 production in peripheral blood mononuclear cells from ulcerative colitis patients and inhibition of IL-8 secretion in HT-29 cells. World J. Gastroenterol. 2008; 14 (16): 2511-6.
4. Ewaschuk J.B. et al. Secreted bioactive factors from Bifidobacterium-infantis enhance epithelial cell barrier function. Am. J. Physiol. Gastro-intest. Liver Physiol. 2008; 295: 1025-34.
5. Turroni F., van Sinderen D., Ventura M. Genomics and ecological overview ofthe genus Bifidobacterium. Int. J. Food Microbiol. 2011; 149: 37-44.
6. Hidalgo-Cantabrana C., Lopez P., Gueimonde M., de los Reyes-Gavilan
C.G., Suarez A., Margolles A., Ruas-Madiedo P. Immune Modulation capability of exopolysaccharides synthesised by lactic acid bacteria and Bifidobacteria. Probiotics & Antimicro Prot. 2012; 4: 227-37.
7. Chervinets Yu.V., Belyaeva E.A., Chervinets V.M., Samoukina A.M., Mikhaulova E.S., Pyatova A.I., Chervinets A.V. Disturbances micro-biota of the gastrointestinal tract of healthy humans. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fundamental'nykh issledovaniy. 2013; 3: 55-8. (in Russian)
8. Chervinets V.M., Chervinets Yu.V., Mikhaylova E.S., Samoukina A.M., Belyaeva E.A., Mironov A.Yu. Microbiocenosis of intestine and immune status of children of primary school age. Klinicheskaya labora-tornaya diagnostika. 2013; 1: 49-51. (in Russian)
9. Chervinets Yu.V., Botina S.G., Glazova A.A., Koroban N.V., Chervinets V.M., Samoukina A.M., Gavrilova O.A., Lebedev D.V., Mironov A.Yu. Genetic study of certification and the ability to form biofilms lac-tobacilli isolated from the oral cavity of healthy humans. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2011; 2: 44-6. (in Russian)
10. Chervinets Yu.V., Chervinets V.M., Mironov A.Yu., Botina S.G., Ga-garina E.Yu., Samoukina A.M., Mikhaylova E.S. Indigenous human oral lactobacilli - candidate probiotic strains. Kurskiy nauchno-prakticheskiy vestnik "Chelovek i zdorov'e". 2012; 1: 131-7. (in Russian)
11. Lyte M. Probiotics function mechanistically as delivery vehicles for neuroactive compounds: Microbial endocrinology in the design and use of probiotics. Bioessays. 2011; 33: 574-81.
12. Quigley E. Gut microbiota and the role of probiotics in therapy. Current Opinion in Pharmacology. 2011; 11: 593-603.
13. 7 GPA Probiotics for medical use. General pharmacopoeia articles and pharmacopoeia articles on immunobiological drugs and methods for evaluating their quality, Russian Ministry of Health, http://www.ros-minzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81.
14. 8 GPA Requirements to the strains of microorganisms used in probiotics production for medical use. General pharmacopoeia articles and pharmacopoeia articles on immunobiological drugs and methods for evaluating their quality, Russian Ministry of Health, http://www.ros-minzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81.
15. 13 GPA Bifidobacteria probiotics for medical use. General pharmacopoeia articles and pharmacopoeia articles on immunobiological drugs and methods for evaluating their quality, Russian Ministry of Health, http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81.
16. Lee J.H., Karamychev V.N., Kozyavkin S.A. et al. Comparative ge-nomic analysis of the gut bacterium Bifidobacterium longum reveals loci susceptible to deletion during pure culture growth. BMC Genom-ics. 2008; 27:247. doi:10.1186/1471-2164-9-247.
17. Averina O.V., Nezametdinova V.Z., Alekseeva M.G., Danilenko V.N. Genetic instability of probiotic characteristics in the Bifidobacterium longum subsp. longum B379M strain during cultivation and maintenance. Russ. J. Genet. 2012; 48: 1103-11. (in Russian)
18. Arumugam M., Raes J., Pelletier E., Paslier D.Le, Yamada T., Mende D.R. et al. Enterotypes of the human gut microbiome. Nature. 2011; 473: 174-80.
19. Tyakht A.V., Kostryukova E.S., Popenko A.S., Belenikin M.S., Pavlen-ko A.V., Larin A.K. et al. Human gut microbiota community structures in urban and rural populations in Russia. NATURE COMMUNICATIONS. 2013. DOI: 10.1038/ncomms3469 www.nature.com/nature-communications.
20. Yatsunenko T., Rey F.E., Manary M.J., Trehan I., Dominguez-Bello M.G., Contreras M. et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 2012; 486 (7402): 222-7. doi:10.1038/na-ture11053.
21. Vincent B. Young The intestinal microbiota in health and disease. Curr. Opin Gastroenterol. 2012; 28 (1): 63-9. doi:10.1097/ MOG.0b013e32834d61e9.
22. Elaine Holmes, Jia V.Li, Thanos Athanasiou, Hutan Ashrafian, Jeremy K. Nicholson Understanding the role of gut microbiome-host metabolic signal disruption in health and disease. Trends in Microbiology. 2011; 19 (7): 349-59.
23. Chervinets Yu.V., Bondarenko V.M., Shabanova N.A., Samoukina A.M., Chervinets V.M. Bacteriocinogenic highly antagonistic strains of Lactobacilli. Zhurnal mikrobiologii. 2006; 7: 78-82. (in Russian)
24. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Test; Approved Standard-Seventh Edition. NCCLS document M2-A7 (ISBN 1-56238393-0). NCCLS, Wayne, PA 19087-1898, 2000.
25. Pokusaeva K., Fitzgerald G. F., van Sinderen D. Carbohydrate metabolism in Bifidobacteria. Genes Nutr. 2011; 6: 285-306.
26. Collado M.C., Gueimonde M., Herna'ndez M. Sanz., Salminen S. Adhesion of selected Bifidobacterium strains to human intestinal mucus and the role of adhesion in enteropathogen exclusion. Journal of Food Protection. 2005; 12: 2502-720.
27. Fanning S., Hall L. J., Cronin M., Zomer A., Mac Sharry J., Goulding D. et al. Bifidobacterial surface exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2012; 109: 2108-13.
28. McIntyre A., Gibson, P. R., Young, G. P. Butyrate production from dietary fiber and protection against large bowel cancer in a rat model. Gut. 1993; 34: 386-91.
29. Cani P.D., Delzenne N.M. The gut microbiome as therapeutic target. Pharmacology & Therapeutics. 2011; 130: 202-12.
30. Qin J., Li Y., Cai Z. et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature. 2012; 490: 55-60.
31. Greiner T., Backhed F. Effects of the gut microbiota on obesity and glucose homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism. 2011; 22 (4): 117-23.
32. Karlsson F.H., Fеk F., Nookaew I., Tremaroli V., Fagerberg B., Petra-novic D., BaЁckhed F., Nielsen J. Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nature Communications. 2012; 3: 1245/ DOI: 10.1038/ncomms 2266.
33. Zhu Y., Luo T.M., Jobin C., Young H. A. Gut microbiota and probiotics in colon tumorigenesis. Cancer Letters. 2011; 309: 119-27.
Поступила 26.03.14 Received 26.03.14
