CC BY
191
ОТБОР БАКТЕРИЙ-СИМБИОНТОВ РОДА LACTOBACILLUS И BIFIDOBACTERIUM ПО ИХ СПОСОБНОСТИ СИНТЕЗИРОВАТЬ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНУЮ КИСЛОТУ -ОДИН ИЗ ПОДХОДОВ В ПОЛУЧЕНИИ ПСИХОБИОТИКОВ
Р.А. Юнес1'2, Е.У. Полуэктова1, М.С. Дьячкова1, Ю.Е. Козловский3, В.С. Орлова2, В.Н. Даниленко1
1 Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова РАН ул. Губкина, д. 3, Москва, Россия, 119991 2 Российский университет дружбы народов Подольское шоссе, 8/5, Москва, Россия, 113093 3 НИИ морфологии человека ул. Цюрупы, д. 3, Москва, Россия, 117418
Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) является активным биогенным веществом; она синтезируется в организме растений, грибов, бактерий, основными ее продуцентами среди бактерий являются молочнокислые бактерии. ГАМК обладает антигипертензивными, аналь-гетическими и антидепрессантными свойствами. Лактобациллы — продуценты ГАМК — выделены из многих пищевых продуктов (сыров, йогуртов, заквасок); они обусловливают пищевые и биоактивные свойства этих продуктов. Такие штаммы рассматриваются как вектор доставки ГАМК в нужное место в кишечнике, они могут быть использованы как средство, способствующее адаптации человека на Крайнем Севере. Способность синтезировать ГАМК лактобациллами и бифидобактериями, явлющимися компонентами микробиоты человека, практически не изучена. В данной работе была проверена коллекция из 114 штаммов лакто-бацилл и бифидобактерий; показано, что способностью синтезировать ГАМК обладают все представители видов L.plantarum, L.brevis, B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium (58 штаммов). Наибольшее количество ГАМК продуцировали штаммы бифидобактерий (до 6 г/л). Отобран один ГАМК-продуцирующий штамм L.plantarum 90sk, и показано, что его прием крысами линии Спрэг-Доули приводит к повышению в их крови уровня ГАМК и снижению уровня гормона стресса пролактина.
Ключевые слова: гамма-аминомасляная кислота, пробиотики, психобиотики, лактобациллы, бифидобактерии, депрессия
Стрессы при продолжительном воздействии на организм человека приводят к развитию ряда неврологических заболеваний, в частности депрессии и тревожным расстройствам [16]. Экологические стрессоры (низкие температуры, изменение фотопериодизма, магнитного поля и излучения), характерные для Крайнего Севера, являются одной из причин развития у человека так называемого синдрома полярного напряжения. Это состояние характеризуется глубокими нарушениями процессов на клеточном уровне и выражается утомляемостью, нарушением сна, депрессией, тревожным состоянием и др. Депрессивное состояние сопровождается рядом физиологических изменений: активизацией вегетативной нервной системы, изменением гормонального статуса, активизацией гипотала-мо-гипофизарно-адреналовой системы, изменениями в составе кишечной микробиоты, увеличением количества адреналина, снижением активности ГАМК-рецепторов, снижением количества инсулина в крови [1].
Применение лекарств-антидепрессантов, несмотря на их эффективность, имеет ряд недостатков: эффект привыкания, побочные эффекты. Поиск новых лекарственных средств крайне важен. Такими принципиально новыми лекарственными средствами являются пробиотические бактерии, преимущественно лакто-бациллы и бифидобактерии, в достаточных количествах способные оказывать благоприятное воздействие на здоровье пациентов. Пробиотики все чаще используются в комбинированном лечении начальных стадий различных соматических заболеваний [2]. Преимуществом использования пробиотиков в качестве лекарственных средств является их относительная безвредность и физиологич-ность по сравнению с химическими препаратами.
Совокупность населяющих тело человека микроорганизмов (преимущественно бактерий) — микробиом (микробиота) — играет чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма [18]. Бактерии кишечного микробиома участвуют не только в регуляции общего метаболизма и иммунитета, но и в функционировании нервной системы хозяина [5; 14]. Кишечный микробиом рассматривается в настоящее время как часть так называемой оси «кишечник — мозг (gut — brain axis)» — двунаправленной коммуникационной системы, обеспечивающей сложное функционирование ЦНС и ЖКТ [9; 10]. Отдельные штаммы пробиотических бактерий способны положительно влиять на эмоциональное поведение, восприятие боли, стресса у лабораторных животных [4]. Есть данные о подобном действии пробиотиков, так называемых психобиотиков на людей [8; 13; 15]. Взаимодействие бактерий кишечной микробиоты и нервной системы организма-хозяина осуществляется посредством синтезируемых бактериями низкомолекулярных веществ, нейромедиаторов и гормоноподобных веществ; к ним относятся аце-тилхолин и другие холины, серотонин, норадреналин, гистамин и другие амины, жирные кислоты с короткими цепями, гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) [10]. Секретируемые бактериями нейротрансмиттеры могут непосредственно действовать на нервные окончания в ЖКТ, а также стимулировать эпителиальные клетки кишечника, которые в ответ высвобождают молекулы, модулирующие нейропередачу в энтеральной нервной системе, оказывая влияние на мозг и поведение человека. Такого рода бактерии следует рассматривать как систему доставки нейроактивных соединений в нужное место (клетки энтеральной нервной системы), обладающую профилактическим и терапевтическим потенциалом в отношении неврологических и нейрофизиологических расстройств.
Материалы и методы
Штаммы бактерий и условия культивирования. В работе были использованы 114 штаммов 16 видов лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из фекалий, слюны и вагинального содержимого жителей центрального региона РФ, а также 3 штамма из коллекции ATCC. Лактобациллы и бифидобактерии выращивали в жидкой и на агаризованной среде MRS [6] при 37 °С в течение 24—48 час. в анаэробных условиях, обеспечивающих атмосферу, содержащую 10% СО2 (HiAnaerobic System — Mark III, HiMedia, India). Для бифидобактерий в среду добавляли 0,05% цистеина. При проверке способности штаммов к синтезу ГАМК в среду добав-
ляли 1% предшественника ГАМК мононатриевой соли глютаминовой кислоты. PLP добавляли в MRS в концентрации 0,5 мМ.
Тонкослойная хроматография и определение количества ГАМК. Для разделения аминокислот в культуральной жидкости штаммов и идентификации ГАМК проводили тонкослойную хроматографию на стеклянных пластинах со слоем сили-кагеля (TLC plates Silica gel 60 F254 Merck, Germany). В качестве растворителя использовали н-бутанол, уксусную кислоту и воду (4:1:1). Нингидрин добавляли в элюирующую смесь в концентрации 0,2%. Для измерения количества ГАМК в образцах использовали двумерное сканирование пластинок на денситометре Shimadzu CS-930, Japan (k = 512).
Опыты на крысах линии Спрэг-Доули. Опыты на животных проводили на крысах линии Спрэг-Доули; штаммом сравнения был пробиотический штамм L.rhamnosus GG, неспособным к синтезу ГАМК. В течение 15 дней 3 группы крыс (по 10 крыс в группе) получали соответственно стерильную питательную среду MRS, пробиотичесикй штамм L.rhamnosus GG и штамм L.plantarum 90sk. Первые две группы служили контролем. Бактериальные штаммы вводили ежедневно крысам через зонд в количестве 109 степени КОЕ. Стрессовым фактором служил хо-лодовой шок, индуцированный у крыс в результате снижения температуры до —40 °С в течение 45 сек. в последние 10 дней опыта. После этого крыс умерщвляли и удаляли из них кровь для измерения в ней уровня ГАМК и гормона стресса про-лактина.
Результаты и обсуждение
Используя хроматографию на силикагеле, мы проверили коллекцию из 13 видов лактобацилл и 3 видов бифидобактерий, выделенных из организма людей, на способность синтезировать и секретировать в среду ГАМК (табл. 1). Способностью секретировать ГАМК обладали 58 штаммов из 114 проверенных. Эта способность была видоспецифична, ею обладали виды L.plantarum, L.brevis и B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium. Из 21 проверенного штамма L.fermentum, 28 штаммов L.rhamnosus и 11 штаммов L.casei ни один не секретировал ГАМК; не секретиро-вали ГАМК и единичные проверенные штаммы L.buchneri, L.helveticus, L.salivarius, L.sakei, L.reuteri, L.mucosa, L.crispatus, L.gasseri.
Таблица 1
Скрининг штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезу ГАМК
Вид лактобацилл и бифидобактерии Количество проверенных штаммов Количество штаммов-продуцентов ГАМК
L. fermentum 21 0
L. rhamnosus 28 0
L. plantarum 30 30
L. brevis 3 3
L. casei 11 0
L. helveticus 2 0
L. salivarius 4 0
L. sakei 1 0
L. reuteri 3 0
L. mucosa 1 0
Окончание табл. 1
Вид лактобацилл и бифидобактерии Количество проверенных штаммов Количество штаммов-продуцентов ГАМК
L. crispatus 2 0
L. buchneri 3 0
L. gasseri 1 0
B. adolescentis 21 21
B. angulatum 3 3
B. dentium 1 1
Total 114 58
Концентрация ГАМК в среде роста колебалась от 50 до 6000 мкг/мл. У лакто-бацилл она была больше у штаммов L.brevis (до 675 мкг/мл), чем у L. plantarum (до 300 мкг/мл); у бифидобактерий она была значительно выше (2500—6000 мкг/ мл) (табл. 2).
Таблица 2
Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами и бифидобактериями
Виды бактерий Штаммы Уровень ГАМК, цд/мл
Lactobacillus plantarum 29st, 50/2, k13, 75sk, 14/4, 36st, 19/1A, 106zv, 38/1 До 50
46sk, 3/1, 7/1, 52/1, CS396, K9L, 50st3, 43/3, 119, 43/2, 56/1 51 — 100
8-PA-3, 46k, 42/2, 191g, 57/1 101 — 150
43/5, 32sk, 43/4, 90sk, 29sk 151—300
Lactobacillus brevis 47st,52st, 50—100
15f 675
Bifidobacterium adolescentis 56, 174, 191, 104, 76,S11 До 900
108, 282, 48-2, 110, 44, S14, km4, 277, 44-2 901—3000
57, 48, Tv29, km5-1, 152, 150 3001—6000
Bifidobacterium angulatum 334-1, 212, GT102 2616—3469
Bifidobacterium dentium 9 2465
Лактобациллы, выделенные из продуктов питания (сыров, йогуртов, заквасок, традиционных продуктов корейской и китайской кухонь kimchi и paocai), демонстрировали высокий уровень синтеза ГАМК. Максимальное количество ГАМК — 129 г/л — было получено у штамма L.buchneri WP2001 [19]. Для L.brevis максимальное количество ГАМК демонстрировали штаммы NCL912 и K203, 35,6 и 44,4 г/л соответственно [11; 19]. Для L.plantarum наибольшее количество ГАМК составило 0,5 г/л [3] и 1,16 г/л для штамма, содержащего дополнительный клонированный на плазмиде ген gadB [17]. Продукция ГАМК штаммами лактобацилл и бифидобактерий, выделенными из организма человека, была описана только в статье Barrett et al., 2012 и составила 32 г/л для L.brevis и 2,0—8,6 г/л для B.infantis, B.angulatum, B.dentium. Среди выделенных нами штаммов наблюдался значительный разброс в количестве синтезируемой ГАМК. Для L.plantarum эти цифры были сходны с теми, которые были получены для штаммов, выделенных из продуктов питания, для L.brevis они были ниже; наибольшее количество ГАМК продуцировали штаммы бифидобактерий (B.angulatum, B.adolescentis, B.dentium) — до 6 г/л.
На основе способности синтезировать ГАМК и других пробиотичнеских свойствах (антагонистическая, антиоксидантная активность) был отобран штамм Ь.р!аШагыт 90зк. Для проверки предполагаемого антидепрессивного эффекта ГАМК-продуцирующего штамма Ь.р!аШагыт 90зк были проведены опыты на крысах линии Спрэг-Доули (см. Материалы и методы, рис. 1).
Рис. 1. Схема опыта по определению влияния штамма L.plantarum 90sk на крыс в условиях холодового шока
1 mol/L 2,5
2
1,5
1
0,5
0
MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90sk Рис. 2. Количество ГАМК в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опыта
Уровень ГАМК в крови крыс, получавших ГАМК-продуцирующий штамм, был достоверно выше по сравнению с двумя контрольными группами (MRS и L.rhamnosus GG) (см. рис. 2).
Количество измеренного гормона стресса пролактина в крови крыс, получавших штамм L.plantarum 90sk, было достоверно ниже, чем у крыс, получающих стерильную среду MRS и штамм L.rhamnosus GG (рис. 3).
ng/ml
16 -,
14-
12 -
10 -
8 -
6 -
4-
2 -
0 -
p < 0,05
p < 0,05
MRS L.rhamnosus GG L.plantarum 90sk Рис. 3. Количество пролактина в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опыта
Увеличение содержания ГАМК в крови крыс опытной группы свидетельствует о том, что штамм L.plantarum 90sk синтезировал ГАМК в кишечнике, которая затем попала в русло крови. Снижение уровня пролактина в крови крыс опытной группы говорит об адаптации крыс к стрессу, что хорошо описано в литературе [12]. Штамм L.plantarum 90sk является потенциальным психобиотиком, способным облегчить синдром полярного напряжения, тем самым способствуя адаптации человека в условиях Крайнего Севера.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Казначеев В.П. Современные аспекты адаптации. Новосибирск: Наука, 1980. 191 с.
[2] Сапов И.А., Новиков В.С. Неспецифические механизмы адаптации человека. Л.: Наука, 1984. 146 с.
[3] Binh T.T., Ju W.T., Jung W.J., Park R.D. Optimization of y-amino butyric acid production in a newly isolated Lactobacillus brevis // Biotechnol Lett 2014. № 36. P. 93—98.
[4] Carabotti M., Scirocco A., Maselli M.A., and Severi C. The gut-brain axis: interactions between enteric microbiota, central and enteric nervous systems // Ann Gastroenterol. 2015. 28(2). P. 203—209.
[5] Cryan J.F., Dinan T.G. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behaviour // Nat Rev Neurosci. 2012. 13(10). P. 701—712.
[6] De Man J.C., Rogosa M. & Sharpe M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli // J Appl Bacteriol 1960. 23. P. 130—135.
[7] Di Cagno R., Mazzacane F, Rizzello C.G., Angelis M.D.E., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D.E., Marco G. and Synthesis of y-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications // Appl.Microbiol. Biotechnol. 2010. 86. P. 731—741.
[8] Dinan T.G., Stanton C., Cryan J.F. Psychobiotics: a novel class of psychotropic // Biol Psychiatry. 2013. 74(10). P. 720—726.
[9] Douglas-Escobar M., Elliott E, Neu J. Effect of intestinal microbial ecology on the developing brain // JAMA Pediatr. 2013. 167(4). P. 374—379.
[10] Foster J.A., McVey Neufeld K.A. Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression // Trends Neurosci. 2013. 36(5). P. 305—312.
[11] Li H., Li W, Liu X., Cao Y., gadA gene locus in Lactobacillus brevis NCL912 and its expression during fed-batch fermentation // FEMS Microbiol Lett. 2013. 349(2). P. 108—116.
[12] MaurizioF, GuaraldiG.P. Proclactin and stress // Medicine 1987. Jul-Sep 1987. 3(3). P. 211—216.
[13] MessaoudiM., Lalonde R., ViolleN., JavelotH., DesorD., NejdiA., Bisson J.F., RougeotC., Pichelin M., Cazaubiel M., Cazaubiel J.M. Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats and human subjects // Br J Nutr. 2011 Mar. 105(5). P. 755—764.
[14] Nicholson J.K., Holmes E., Kinross J., Burcelin R., Gibson G., Jia W. et al. Host-gut microbiota metabolic interactions // Science 2012. 336. P. 1262—1267.
[15] Rao A.V., Bested A.C., Beaulne T.M., Katzman M.A., lorio C., Berardi J.M., Logan A.C. A r and omized, double-blind, placebo-controlled pilot study of a probiotic in emotional symptoms of chronic fatigue syndrome // Gut Pathog. 2009. 1(1). P. 1—6.
[16] Schneiderman N., Gail I., Scott S. Stress and health: Psychological, behavioral, and biological determinants // Annu Rev Clin Psychol. 2005. 1. P. 607—628.
[17] TajabadiN., BaradaranA., Ebrahimpour A., RahimR.A., BakarF.A., ManapM.Y., Mohammed A.S., Saari N. Overexpression and optimization of glutamate decarboxylase in Lactobacillus plantarum Taj-Apis362 for high gamma-aminobutyric acid production // Microb Biotechnol. 2015. 8(4). P. 623—632.
[18] Walter J. Ecological role of lactobacilli in the gastrointestinal tract: implications for fundamental and biomedical research // Appl Environ Microbiol. 2008. 74(16). P. 4985—4996.
[19] Zhao A., Hu X., Pan L., Wang X. Isolation and characterization of a gamma-aminobutyric acid producing strain Lactobacillus buchneri WPZ001 that could efficiently utilize xylose and corncob hydrolysate // Appl Microbiol Biotechnol. 2015. 99(7). P. 3191—3200.
SELECTION OF GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID PRODUCING LACTOBACILLUS AND BIFIDOBACTERIUM SYMBIONT STRAINS AS POTENTIAL PSYCHOBIOTICS
R.A. Yunes12, E.U. Poluektova1, M.S. Dyachkova1, Y.E. Kozlovski3, V.S. Orlova2, V.N. Danilenko1
1 Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences Gubkin str., 3, Moscow, Russia, 119991 2 Peoples' Friendship University of Russia Podolskoe shosse, 8/5, Moscow, Russia, 113093 3 Research Institute of Human Morphology Tsyurupy str., 3, Moscow, Russia, 117418
Gamma-amino butyric acid (GABA) is an active biogenic substance, synthesized in the organisms of plants, fungi, vertebrate animals and bacteria. GABA is used in food and drugs exhibiting antihypertensive, analgesic and antidepressant properties. GABA-producing strains can be considered as delivery vehicles of GABA to specific sites of the gut. Such strains are potential antidepressants promoting adaptation in the extreme north. Lactic acid bacteria (LAB) are considered the main producers of GABA among bacteria. GABA-producing Lactobacilli are isolated from food products
such as cheese, yogurt, sourdough etc. and are the source of bioactive properties assigned to those foods. The ability of Human-derived Lactobacilli and Bifidobacteria to synthesize GABA remains poorly characterized. In this paper, we screened our collection of 114 Human-derived Lactobacillus and Bifidobacterium strains for their ability to produce GABA from its precursor monosodium glutamate (MSG). As a result 58 strains belonging to the species L.plantarum, L.brevis, B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium were able to produce GABA. The most efficient GABA-producers were Bificobacterium strains (up to 6 g/L). We selected a GABA-producing strains that was further tested in Sprague-Dawley rats. Ingestion of L.plantarum 90sk strain increased GABA in the rats' blood and decreased the rate of stress hormone prolactin.
Key words: GABA, probiotics, psychobiotics, Lactobacilli, Bifidobacteria, depression
REFERENCES
[1] Kaznacheev V.P. Sovremennie aspekty adaptacii [Modern aspects of adaptation]. Novosibirsk: Nauka [Novosibirsk: Science], 1980. 191 p.
[2] Sapov I.A., Novikov I.S. Nespecificheskie mehanizmi adaptacii cheloveka [Non-specific mechanisms of human adaptation]. L.: Nayka [Science], 1984. 146 p.
[3] Binh T.T., Ju WT., Jung WJ., Park R.D. Optimization of y-amino butyric acid production in a newly isolated Lactobacillus brevis. Biotechnol Lett. 2014. 36. P. 93—98.
[4] Carabotti M., Scirocco A., Maselli M.A., and Severi C. The gut-brain axis: interactions between enteric microbiota, central and enteric nervous systems. Ann Gastroenterol. 2015. 28(2). P. 203— 209.
[5] Cryan J.F., Dinan T.G. Mind-altering microorganisms: the impact ofthe gut microbiota on brain and behaviour. Nat Rev Neurosci. 2012. 13(10). P. 701—12.
[6] De Man J.C., Rogosa M. & Sharpe M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli. J Appl Bacteriol 1960. 23. P. 130—135.
[7] Di Cagno R., Mazzacane F, Rizzello C.G., Angelis M.D.E., Giuliani G., Meloni M., Servi B.D.E., Marco G., and Synthesis ofy-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus plantarum DSM19463: functional grape must beverage and dermatological applications. Appl.Microbiol. Biotechnol. 2010. 86. P. 731—741.
[8] Dinan T.G., Stanton C., Cryan J.F. Psychobiotics: a novel class of psychotropic. Biol Psychiatry. 2013. 74(10). P. 720—726.
[9] Douglas-Escobar M., Elliott E., Neu J. Effect of intestinal microbial ecology on the developing brain. JAMA Pediatr. 2013. 167(4). P. 374—379.
[10] Foster J.A., McVey Neufeld K.A. Gut-brain axis: how the microbiome influences anxiety and depression. Trends Neurosci. 2013. 36(5). P. 305—312.
[11] Li H., Li W, Liu X., Cao Y., gadA gene locus in Lactobacillus brevis NCL912 and its expression during fed-batch fermentation. FEMS Microbiol Lett. 2013. 349(2). P. 108—116.
[12] Maurizio F, Guaraldi G.P. Proclactin and stress. Medicine 1987. Jul-Sep 1987. 3(3). P. 211—216.
[13] Messaoudi M., Lalonde R., Violle N., Javelot H., Desor D., Nejdi A., Bisson J.F., Rougeot C., Pichelin M., Cazaubiel M., Cazaubiel J.M. Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats and human subjects. Br J Nutr. 2011. 105(5). P. 755—764.
[14] Nicholson J.K., Holmes E., Kinross J., Burcelin R., Gibson G., Jia W et al. Host-gut microbiota metabolic interactions. Science 2012. 336. 1262—1267.
[15] Rao A.V., Bested A.C., Beaulne T.M., Katzman M.A., Iorio C., Berardi J.M., Logan A.C., A r and omized, double-blind, placebo-controlled pilot study of a probiotic in emotional symptoms of chronic fatigue syndrome. Gut Pathog. 2009 Mar 19. 1(1). P. 1—6.
[16] Schneiderman N., Gail I., Scott S. Stress and health: Psychological, behavioral, and biological determinants. Annu Rev Clin Psychol. 2005. 1. P. 607—628.
[17] Tajabadi N., Baradaran A., Ebrahimpour A., Rahim R.A., Bakar F.A., Manap M.Y., Mohammed A.S., Saari N. Overexpression and optimization of glutamate decarboxylase in
Lactobacillus plantarum Taj-Apis362 for high gamma-aminobutyric acid production. Microb Biotechnol. 2015. 8(4). P. 623—632.
[18] Walter J. Ecological role of lactobacilli in the gastrointestinal tract: implications for fundamental and biomedical research. Appl Environ Microbiol. 2008 Aug. 74(16). P. 4985—4996.
[19] Zhao A., Hu X., Pan L., Wang X. Isolation and characterization of a gamma-aminobutyric acid producing strain Lactobacillus buchneri WPZ001 that could efficiently utilize xylose and corncob hydrolysate. Appl Microbiol Biotechnol. 2015. 99(7). P. 3191—3200.
