Индигенные лактобациллы полости рта человека — кандидаты в пробиотические штаммы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 579.25.083.18 ИНДИГЕННЫЕ ЛАКТОБАЦИЛЛЫ ПОЛОСТИ РТА ЧЕЛОВЕКА — КАНДИДАТЫ В ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ШТАММЫ

© Червинец Ю.В., Червинец В.М., Миронов А.Ю., Ботина С.Г., Гагарина Е.Ю.,

Самоукина А.М., Михайлова Е.С.

Тверская государственная медицинская академия, Тверь;

Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва; ОАО Г осударственный НИИ биосинтеза белковых веществ ГК «Ростехнологии», Москва

E-mail: profmironov@mmascience. ru

Определена способность индигенных штаммов лактобацилл полости рта здоровых людей к адгезии, аутоагрегации, поверхностной гидрофобности, коагрегации, образованию биоплёнки. Исследовано 23 антагонистически активных изолята лактобацилл, включающих 5 штаммов Lactobacillus plantarum, 6 - L. rhamnosus, 4 - L. paracasei и 8 -L. fermentum. Изучены свойства лактобацилл, ассоциированные с адгезией, аутоагрегацией, поверхностной гидрофоб-ностью, коагрегацией, образованим биоплёнки. Бактерии характеризовались высокой и средней степенью адгезии, аутоагрегации, поверхностной гидрофобности, выраженной способностью к формированию биоплёнки и разной коаг-регирующей активностью в отношении тест-штаммов S. aureus, E. coli, C. albicans, P. aeruginosa, В. subtilis. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, выделенные из полоти рта здоровых людей, генетически паспортизированы с использованием метода RAPD-PCR с двумя вариантами праймеров (M13, MSP), как L. fermentum 39, L. rhamnosus 50, L. rhamnosus 24. Изученные свойства лактобацилл могут быть использованы для создания новых пробиотиков с целью стабилизации нормофлоры полости рта.

Ключевые слова: микрофлора полости рта, лактобациллы, пробиотики, биоплёнка.

THE RESIDENT LACTOBACILLUS FROM HUMAN ORAL CAVITY - CANDIDATES FOR PROBIOTIC

STRAINS

Chervinets Yu. V., Chervinets V.M., Mironov A. Yu., Botina S. G., Gagarina E. Yu., Samoukina A.M., Mikhailova E.S.

State Medical Academy, Tver;

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow;

State SRI Proteins Biosynthesis SC “Rostekhnologii”, Moscow

Determination of resident strains of lactobacilli oral healthy people to adhesion, autoaggregation, surface hydrophobicity, coaggregation and formation of biofilms. Studied 23 antagonistically active isolates of lactobacilli, including 5 strains of Lactobacillus plantarum, 6 - L. rhamnosus, 4 - L. paracasei, 8 - L. fermentum. The properties of lactobacilli associated with adhesion, autoaggregation, surface hydrophobicity, coaggregation and formation of biofilms were studied. Bacteria were characterized by high and medium adhesion, autoaggregation, surface hydrophobicity, pronounced ability to form biofilms and different coaggregation activity to test-strains: S. aureus, E. coli, C. albicans, P. aeruginosa, В. subtilis. The investigated properties of Lactobacillus can be used for formation of new probiotics and stabilization of microflora of oral cavity.

Keywords: microflora of oral cavity, lactobacillus, probiotics, biofilms.

В настоящее время сохраняется тенденция к росту числа больных с одонтогенными гнойновоспалительными заболеваниями (ГВЗ) челюстно-лицевой области (ЧЛО). Причиной этого являются нарушения микроэкологии полости рта и иммунного статуса пациентов. ГВЗ ЧЛО, прежде всего одонтогенные абсцессы и флегмоны, продолжают оставаться актуальной проблемой практического здравоохранения.

Микрофлора полости рта насчитывает более 700 видов микроорганизмов. Лактобациллы составляют около 1% культивируемых микроорганизмов. Доминирующими видами являются гете-роферментативные, L. plantarum, L. rhamnosus, L. casei, L. fermentum, а также гомоферментативные, L. salivarius, L. buchneri, L. oris, L. zeae, L. delbrueckii, L. acidophilus, L. jensenii, L. gasseri, L.

agilis [16]. Индигенные бактерии в организме формируют биоплёнку, состоящую из жизнеспособных клеток и межклеточного матрикса [14, 15,

21, 23]. Бактерии биоплёнки характеризуются изменённым спектром экспрессии генов, обладают повышенной устойчивостью к антибиотикам и повреждающим факторам окружающей среды [4, 17]. Для колонизации полости рта человека инди-генным бактериям необходимо адгезироваться к эпителию слизистой оболочки или эмали зубов. Адгезия бактерий к поверхности зубов происходит быстро, но многие микроорганизмы не способны прикрепляться непосредственно к зубной эмали, а оседают на поверхности уже адгезиро-вавшихся бактерий, образуя связь «клетка к клетке». Микрокапсула лактобацилл принимает участие в адгезии клеток к субстрату, а также спо-

собствует объединению лактобацилл между собой и их аутоагрегации. Адгезия, аутоагрегация, поверхностная гидрофобность и коагрегация являются наиболее важными характеристиками клеточной поверхности. Они связаны с процессами прикрепления, колонизации организма хозяина и формирования биоплёнки бактериями. Явление коагрегации между антагонистической инди-генной микрофлорой и транзиторными видами может являться одним из путей вытеснения УПМ из различных биотопов организма.

В последнее десятилетие заметно вырос интерес к проблеме поддержания и восстановления микроэкологического статуса человека. Для этих целей всё шире используют медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) - пробиотики. Повышенный интерес к пробиотикам вызван расширением контингента лиц, требующих коррекции аутофлоры, прогрессом в изучении состава и биологических свойств микрофлоры, колонизирующей различные биотопы организма человека, её роли в поддержании здоровья организма; использованием микроэкологических подходов к раскрытию этиологии и патогенеза различных заболеваний; выявлением полезных свойств у микроорганизмов, не встречающихся в норме в биоценозах человека.

ГВЗ ЧЛО сопровождаются изменением видового и количественного состава микрофлоры полости рта. Разработка новых МИБП может способствовать решению проблемы лечения и профилактики дисбактериоза, ассоциированного с ГВЗ ЧЛО. Антагонистическими свойствами по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре обладают многие представители нормальной микрофлоры. Наибольшая активность отмечена у лактобацилл [20]. Они выделяют различные антибактериальные вещества, основными из которых являются органические кислоты, перекись водорода, мурамидаза, бактерио-цины, микроцины и др., обеспечивающие устойчивость слизистой полости рта к колонизации патогенными микроорганизмами, что напрямую связано с их антагонистической активностью [7, 10].

В настоящее время для борьбы с активацией эндогенной оппортунистической инфекции рекомендуется применение МИБП, действующим началом которых являются пробиотические штаммы микроорганизмов - представителей индиген-ной микрофлоры, в частности, бифидобактерии и лактобациллы [1, 16]. Терапия микробами-

симбионтами направлена на регуляцию иммунных механизмов, модуляцию микрофлоры организма и управление метаболическими процессами. За рубежом такой подход получил название «микробиологическая терапия».

Цель работы - охарактеризовать способность оральных штаммов лактобацилл к адгезии, аутоагрегации, поверхностной гидрофобности, коаг-регации, образованию биоплёнки и оценить их как возможных кандидатов в пробиотические штаммы для создания отечественных оральных пробиотиков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аналит собирали со слизистой оболочки щеки и слизистой оболочки дорзальной поверхности языка практически здоровых людей стерильным ватным тампоном и помещали в 1 мл транспортной среды. Аналит доставляли в бактериологическую лабораторию в течение 1 часа.

Чистую культуру лактобацилл выделяли путём раститровки исследуемого материала и посева на оптимальную питательную среду МРС-4. Культивировали 24 часа при температуре 37°С в эксикаторе со свечой при повышенном содержании CO2 и в аэробных условиях. Идентификацию чистых культур проводили по культуральным, морфологическим, тинкториальным, биохимическим свойствам. Биохимические свойства антагонистически активных штаммов лактобацилл изучали, используя тест-систему API 50 CH «bioMe-rieux» (Франция) и программное обеспечение APIWEB (Professional). У грамположительных палочек коротких и длинных с закругленными концами изучали ферментацию 50 субстратов [8].

Изучены 48 штаммов лактобацилл, выделенных со слизистой оболочки полости рта практически здоровых людей. Оральные штаммы лактобацилл подразделены на 4 группы: I группа - выделенные от детей до 8 лет (11 штаммов), II группа - от 9 до 18 лет (10 штаммов), III группа - от 28 до 45 лет (11 штаммов) и IV группа - старше 80 лет (16 штаммов).

Антагонистическая активность лактобацилл определялась по отношению к тест-культурам: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus subtilis 534, Escherichia coli 25922, Klebsiella pneumoniae K1 5054, Candida albicans ATCC 885-653 методом отсроченного антагонизма [1, 2, 3, 6, 9].

Способность лактобацилл к формированию биоплёнки определяли по модифицированному методу O’Toole G. с соавт. [18]. В полистероло-вые чашки диаметром 35 мм вносили по 5 мл жидкой среды МРС, затем вносили 0,1 мл суточной бульонной культуры лактобактерий, культивировали при 37°С в течение 24 и 48 часов. Затем жидкую среду МРС аккуратно отбирали и прикреплённую к стенкам и дну полистероловой

чашки биоплёнку лактобацилл окрашивали 0,1% спиртовым раствором кристаллвиолета.

Аутоагрегацию и поверхностную гидрофоб-ность определяли по методу Andreu et al. [11]. Коагрегацию исследовали по методу Reid et al. [19]. Адгезию - по методу Бриллис В.И. с со-авт. на эритроцитах человека О (I) группы Rh+ [6].

Выделение ДНК из культур лактобактерий проводилось согласно методике [4].

Генотипирование штаммов лактобацилл проводили с помощью RAPD-PCR. Для ПЦР использованы следующие праймеры: MSP (GTAAAAC-GACGGCCAGT) [12], и M13

(GAGGGTGGCGGTTCT) [22]. Праймеры синтезировали на фирме «Синтол». В работе использовали реактивы фирмы «Fermentas».

Состав ПЦР-реакции:

50 мМКО — 1 мкл 2 мМMgCl2 — 1 мкл

10 мМ^-Ж1 (pH 8,8)

250 мкМ смесь дНТФ — 1 мкл Праймеры (20 пмоль) — по 0,5 мкл каждого Буфер для Taq-полимеразы — 0,9 мкл Выделенная хромосомной ДНК — 20 нг Taq-полимераза — 1,25 единицы активности ddH2O — до 20 мкл

Реакция проводилась в стеклянных капиллярах в амплификаторе Omn-E фирмы Hybaid при следующих условиях [5]:

Тденатурации 940С, 30'' Тотжига 4ЗОС, 3О''

Тэлонгации 720Q 4'

40 циклов

ПостПЦР 720С, 80'

Гель-электрофорез ДНК проводили в горизонтальном 1,5% агарозном геле в трис-ацетатном буфере при напряжённости электрического поля

0,5 В/см в течение 17 ч. Для визуализации ДНК гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,05 мкг/мл в дистиллированной воде) в течение 30 мин. Для определения размеров фрагментов ДНК в качестве стандартов использовали ДНК-маркёры Gene RulerTM DNA Ladder Mix SM0331 фирмы Fermentas.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из 48 изолятов индигенных лактобацилл отобрано 20 штаммов, проявлявших высокую антагонистическую активность в отношении Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Bacillus subtilis 534, Escherichia coli 25922, Klebsiella pneumoniae K1 5054, Candida albicans ATCC 885-653.

По биохимическим свойствам оральные штаммы идентифицированы как: I группа - Lac-

tobacillus plantarum (3 штамма), Lactobacillus rhamnosus (1 штамм), Lactobacillus paracasei (1 штамм); II группа - Lactobacillus plantarum (3 штамма), Lactobacillus rhamnosus (2 штамма); III группа - Lactobacillu splantarum (2 штамма), Lactobacillus fermentum (2 штамма), Lactobacillus paracasei (1 штамм); IV группа: Lactobacillus fer-mentum (3 штамма), Lactobacillus rhamnosus (2 штамма).

Все 20 оральных штаммов лактобацилл демонстрировали высокую способность к образованию биоплёнок (рис. 1).

Высоким показателем адгезии обладали 72,7% оральных штаммов лактобацилл I и III группы, 90% штаммов - II группы, и S1,2% штаммов - IV группы. Средний показатель адгезии обнаружен у 27,3% оральных штаммов лактобацилл I и III группы, 10% штаммов - II группы, и 1S,S% штаммов - IV группы. Большинство штаммов лактобацилл имели высокое и среднее значение адгезивности.

Высокой поверхностной гидрофобностью обладало большинство оральных штаммов лактобацилл: б3,б% лактобацилл I и III группы; 90% штаммов - II группы; З0% штаммов - IV группы. Средней поверхностной гидрофобностью обладали 3б,4% оральных лактобацилл I и III группы; 10% штаммов - II группы; З0% штаммов -IV группы. Большинство штаммов лактобацилл обладало высокой и средней поверхностной гид-рофобностью.

Аутоагрегация разной степени выраженности отмечалась у всех исследуемых оральных штаммов лактобацилл (рис. 2). Высокая степень аутоагрегации наблюдалась у З4,З% оральных лактобацилл I группы; 40% штаммов - II группы; 27,3% штаммов - III группы; 12,З% штаммов -IV группы. Средняя степень аутоагрегации выявлена у 4З,З% лактобацилл I группы; б0% штаммов - II группы; 72,7% штаммов - III группы; S7^% штаммов - IV группы. Более высокой аутоагрегацией (З4,З%) обладали лактобациллы I группы, лактобациллы II-IV групп - высокой и средней аутоагрегацией.

Тест-культура S. aureus в 72,7% случаев обладала коагрегацией с оральными лактобациллами

I и III групп; в S0% случаях - II группы; З6,3% случаях - IV группы. Тест-культура E. coli в 63,6% случаев коагрегировала с оральными лактобациллами I и III группы; в 90% случаях -

II группы; б2,З% случаях - IV группы (рис. 3). Тест-культура C. albicans в 63,6% случаев давала положительный результат с оральными лактобациллами I группы; в S0% - со штаммами II группы; в З4,З% - со штаммами III группы; в 6S,S% -со штаммами IV группы. Тест-культура P. aeruginosa в 72,7% случаев давала положительный

Рис. 1. Образование биоплёнки in vitro.

Рис. 2. Аутоагрегация лактобацилл (увеличение 1х1000).

Рис. 3. Коагрегация между штаммами Lactobacillus и E. coli (увеличение 1х1000).

результат с оральными лактобациллами I группы; в 70% - со штаммами II группы; в 45,5% - со штаммами III группы; в 75% - со штаммами IV группы. Тест-культуры В. suЫШs 537 и 6633 в 100% случаев коагрегировали с оральными лактобациллами I и III группы; в 80% случаях -

II группы; 87,5% случаях - IV группы.

Генотипирование штаммов лактобацилл проводили с помощью анализа полиморфизма ам-134

плифицированных фрагментов ДНК (RAPD-PCR) с двумя вариантами праймеров (M13, MSP). Проведена генетическая паспортизация штаммов L. fermentum 39, L. rhamnosus 50, L. rhamnosus 24. Изученные культуры представляли собой разные штаммы, поскольку паттерны ПЦР-электрофореграмм различаются.

Праймер М13 подобран на мини-сателлитную последовательность фага М13, которая, как было

Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье", 2012, № 1 1 2 3 4 5 6 7 8

зооо-

20001500 —

1000 — 500 /

Рис. 4. Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных с помощью метода RAPD-PCR с использованием праймеровM13, MSP.

1, 8 - маркёрGeneRuler DNA Ladder Mix;

2 - штамм L. fermentum 39, использован праймер М13.

3 - штамм L. ramnosus 24, использован праймер М13.

4 - штамм L. ramnosus 50, использован праймер М13.

5 - штамм L. fermentum 39, использован праймер MSP.

6 - штамм L. ramnosus 24, использован праймер MSP.

7 - штамм L. ramnosus 50, использован праймер MSP.

показано ранее, может встречаться в разных участках генома у различных бактерий [13]. Праймер MSP успешно использован ранее для идентификации и дифференциации бактерий рода Bifidobacterium и Streptococcus [5]. Эти праймеры впервые использованы в данном исследовании в отношении штаммов лактобацилл, что показало целесообразность и правомочность использования их для дифференцировки культур рода Lactobacillus на уровне штамма.

При использовании праймеров M13 и MSP образовывалось большое количество фрагментов, размер которых варьировал от 200 до 5000-6000 п.н.; основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 400-2500 п.н. Электрофоре-грамма результатов амплификации ДНК штаммов с праймерами M13 (дорожки 2-4) и MSP (дорожки 5-7) представлена на рис. 4. Как видно из рис. 4, паттерны разных штаммов отличаются друг от друга по количеству и размерам, что позволяет достоверно дифференцировать данные штаммы.

Штаммы Lactobacillus fermentum 39, Lactobacillus rhamnosus 24 и Lactobacillus paracasei 50 проявили высокую антагонистическую активность по отношению к тестовым штаммам: S. aureus 25923, C. albicans 531, P. aeruginosa ATCC 9027, S. typhimurium 415,

S. sonnei I фазы 941, B. subtilis, E. coli BVKO83. L. ramnosus, L. casei, L. paracasei, L. fermentum являются близкородственными видами и относятся к одной филогенетической группе лактобацилл (группе casei). Для них характерны довольно сходные биохимические свойства, что затрудняет их видовую идентификацию при использовании коммерческих тест-систем.

В колонизации бактериями той или иной поверхности решающее значение имеет способность бактерий прикрепляться к данной поверхности. Созревание зубной бляшки начинается после адгезии бактерий к поверхности зуба и зависит от способности бактерий, находящихся в слюне, прикрепляться к фиксированным на поверхности зубной эмали бактериям. Пи смешивании двух и более штаммов бактерий может происходить слипание бактерий разных видов в растворе или коагрегация либо прилипание бактерий, находящихся в растворе, к другим бактериям, фиксированным на поверхности или коадгезия. Большинство штаммов лактобацилл в разной степени обладали способностью к агрегации со всеми тест-культурами in vitro, т.е. коагрегацией. Высокая и средняя степень аутоагрегации, поверхностной гидрофобности и адгезии у большинства оральных штаммов лактобацилл определяет выраженную способность к образованию биоплёнки. Дан-

ные характеристики индигенных микроорганизмов делают их более конкурентоспособными в борьбе за сайты адгезии при образовании биоплёнки в полости рта и способствуют стабилизации нормобиоценоза. Штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта детей в возрасте 9-18 лет, идентифицированные как Lactobacillu plantarum (3 штамма) и Lactobacillus rhamnosus (2 штамма), обладали наиболее высокой поверхностной гидрофобностью, адгезией и коагрегацией с тест-культурами. Способность ряда штаммов лактобацилл подавлять рост стафилококков имеет важное значение для селекции пробиотических культур [8, 9]. Определённую роль играет и способность индигенных лактобацилл к образованию биоплёнки [2, 6].

ПЦР-фингерпринтинг, основанный на применении праймеров M13 и MSP, позволил с высокой степенью достоверности дифференцировать лактобациллы следующих видов: L. fermentum 39, L. rhamnosus 50 и L. rhamnosus 24 на уровне штаммов.

Высокая степень аутоагрегации, поверхностной гидрофобности и коагрегации у большинства оральных штаммов лактобацилл определяет выраженную способность к образованию биоплёнки. Данные характеристики индигенных микроорганизмов делают их более конкурентоспособными в борьбе за сайты адгезии при образовании биоплёнки в полости рта и способствуют сохранению эубиоза.

ГВЗ ЧЛО остаются актуальной проблемой практического здравоохранения. Они сопровождаются развитием дисбиоза полости рта. Для борьбы с эндогенной оппортунистической инфекцией рекомендуется применение МИБП, действующим началом которых являются штаммы пробиотических микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры организма, в частности, бифидобактерий и лактобацилл.

Антагонистическими свойствами по отношению к патогенным микробам и УПМ обладают многие представители нормальной микрофлоры. Наибольшая активность отмечена у лактобацилл, которые продуцируют различные антибактериальные вещества, такие как органические кислоты, перекись водорода, мурамидазу, бактериоци-ны, микроцины и др., что обусловливает их антагонистическую активность. Лактобациллы обеспечивают устойчивость слизистых оболочек организма к колонизации аллохтонной микрофлорой.

Терапия микробами-симбионтами направлена на регуляцию иммунных механизмов, модуляцию микрофлоры организма, управление метаболическими процессами. За рубежом такой подход получил название «микробиологическая терапия». В

клинической практике широко используются пробиотики на основе штаммов лактобацилл для коррекции микробиоценоза кишечника (лакто-бактерин, аципол, ацилакт) и для коррекции микробиоценоза влагалища (экофемин). Однако оральных форм пробиотиков ни в России, ни за рубежом до сих пор не производится. Разработка новых отечественных оральных форм МИБП может способствовать решению проблемы лечения и профилактики дисбиоза, ассоциированного с ГВЗ ЧЛО.

Оральные изоляты лактобацилл, выделенные со слизистой оболочки полости рта практически здоровых людей всех возрастных групп, обладают высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и способностью к формированию биоплёнки. Они могут служить основой новых пробиотических штаммов, которые можно будет использовать для создания оральных форм пробиотиков для стабилизации нормофлоры полости рта.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бондаренко В.М.Молекулярно-клеточные механизмы действия пробиотиков // Фарматека. -2010. - № 196 (2). - С. 26-32.

2. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий кишечника в полиорганной патологии человека. - М.: Изд-во «Триада», 2007. - 148 с.

3. Бондаренко В.М., Воробьёв А.А. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией // ЖМЭИ. -2004. - № 1. - С. 84-92.

4. Ботина С.Г. Выяснение таксономического положения отечественных штаммов термофильных молочнокислых бактерий по данным секвенирования генов 16S рРНК // Микробиология. - 2005. - Т. 74, № 4. - С. 520-525.

5. Ботина С.Г., Цыганков Ю.Д., Суходолец В.В. Филогенетический анализ типовых штаммов бактерий группы Salivarius рода Streptococcus на основании данных о строении генов 16S pPHK // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 3. - С. 429-432.

6. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. Методика изучения адгезивного процесса // Лаб. дело. -1986. - № 4. - С. 210-212.

7. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н. и др. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // ЖМЭИ. - 2004. - № 2. - С. 64-69.

8. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Вербицкая Н.Б. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на клетки Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis // ЖМЭИ. - 2006. - № 7. - С. 8-11.

9. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова Н.А. и др. Бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл // ЖМЭИ. - 2006. -№ 7. - С. 78-82.

10. Червинец Ю.В. Микробный пейзаж полости рта у здоровых подростков и больных хроническим гастродуоденитом // ЖМЭИ. - 2008. - № 6. -С. 59-63.

11. Andreu A., Stapleton A., Fennell C. et. al. Hemagglutination, adherence and surface properties of vaginal Lactobacillus species // J. Infect. Diseases. - 1995. -№ 171. - Р. 1237-1243.

12. Chakrabortty Use of RNA arbitrarily primed-PCR fingerprinting to identify Vibrio cholerae genes differentially expressed in the host following infection // Infect. Immunity. - 2000. - Vol. 68. - P. 3878-3887.

13. Huey B., Hall J. Hypervariable DNA fingerprinting in Escherichia roll: minisatellite probe from bacteriophage M13 // J. Bacteriology. - 1989. - № 171. -P. 2528-2532.

14. Izano E.A. Amarante M.A., Kher W.B. et al. Differential roles of poly-N-аcetylglucosamine surface polysaccharide and extracellular DNA in Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms // Appl. Envir. Microbiology. - 2008. - № 74 (2). -Р. 470-476.

15. Kolenbrander P.E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems // Annu. Rev. Microbiology. - 2000. - № 54. - Р. 413-437.

16. Koll-Klais P., Mandar R., Leibur E. et al. Oral lactobacilli in chronic peridontitis and periodontal health: species composition and antimicrobial activity // Oral microbiology immunology. - 2005. - № 20 (6). -P. 354-361.

17. Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaaecher S.C. Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2008. -№ 72 (4). - P. 728-764.

18. O’Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development // Ann. Rev. Microbiology. - 2000. - № 54. - P. 49-79.

19. Reid G., Mac Groarty J., Chow A. et al. Coaggregation of urogenital bacteria in vitro and in vivo // Curr. Microbiology. - 1990. - № 20. - P. 47-52.

20. Ruby J., Goldner M. Nature of Symbiosis in Oral Disease // J. Dent. Res. - 2007. - № 86 (1). - P. 8-11.

21. Speziale P., Visai L., Rindi S. et al. Prevention and treatment of Staphylococcus biofilms // Curr. Med. Chem. - 2008. - № 15. - P. 3185-3195.

22. Torriani S. Use of PCR-based methods for rapid differentiation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgari-cus and Lactobacillus delbrueckii ssp. Lactis // Appl. Environ. Microbiology. - 1999. - 65. - P. 4351--356

23. Williams N.T. Probiotics // Am. J. Health Sys. Pharm. - 2010. - № 67 (6). - P. 449-458.