CC BY
9УДК 612.826.4
УРОВЕНЬ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ИНДУКЦИИ КОРТИКАЛЬНОЙ ДЕПРЕССИИ В СРЕЗАХ МОЗГА КРЫС С ПРЕНАТАЛЬНОЙ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИНЕМИЕЙ
DOI
Яковлев А. В.1, Деттерер А. С.1, Шахматова В. И.1, Гайфутдинова Н. Р.1, Ситдикова Г. Ф.1
1 Казанский Приволжский Федеральный Университет, Казань, Россия e-mail: alv.yakovlev@gmail.com
Аннотация. В ходе исследования было установлено, что, высокий уровень гомоцистеина в пренатальный период развития усиливает повреждение клеток, повышает проницаемость ГЭБ и изменяет чувствительность нейронов соматосенсорной коры крыс к распространению кортикальной депрессии.
Ключевые слова: гипергомоцистеинемия, лактатдегидрогеназа, кортикальная депрессия, гематоэнцефалический барьер.
Гомоцистеин, серосодержащая аминокислота, образующаяся в ходе метаболизма метионина, в высоких концентрациях обладает нейротоксическими эффектами, реализующимися как в эндотелии, так и нейрональной ткани мозга. Генетические мутации ферментов метаболизма гомоцистеина, дефицит витаминов группы В, избыток метионина и нарушения выделительной функции, прием некоторых лекарственных препаратов приводит к повышению уровня гомоцистеина в организме — гипергомоцистеинемии (ГГЦ) [1]. ГГЦ может приводить к повышению проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) как в пре-, так и постнатальном периоде, что может выступать одним из факторов ишемических повреждений и нейро-дегенеративных заболеваний, возникающих из-за поступления токсинов в мозговой кровоток [2]. Клинические данные указывают на то, что повышение уровня гомоцистеина может являться фактором риска возникновения мигрени. Показано, что распространяющаяся кортикальная депрессия (РКД), лежит в основе мигрени с аурой, частота возникновения которой ассоциируется с ГГЦ [3; 4]. Целью
настоящего исследования была оценка проницаемости ГЭБ, активности лактатдегидрогеназы и РКД в соматосенсорной коре у крысы в условиях пренатальной ГГЦ.
Методика: Исследование проводили на крысах линии Wistar в возрасте 21-45 дней после рождения. Самки крыс были разделены на две группы. Одна группа находилась весь период на контрольной диете, а другая группа получала корм с повышенным содержанием метионина (7,7 г/кг корма) в течение 3 недель до начала и во время беременности [5; 6]. Гомоцистеин в плазме крови крыс определялся с использованием набора (Homocysteine Colorimetric Assay Kit, Elabscience, США). РКД исследовали в соматосенсорной коре в та-ламокортикальных срезах (400 мкм) с помощью внеклеточной регистрации локального полевого потенциала (ЛПП) в режиме по постоянного тока и внутреннего оптического сигнала (ВОС) в режиме пропускания света [7]. РКД индуцировали при помощи экви-молярной заменой NaCl на KCl (50 мМ) во внеклеточном растворе в течение 5 мин. Для оценки изменения синаптической активности таламокортикальных нейронов в ходе распространения РКД регистрировали возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) в ответ на стимуляцию вентропостериомедиального ядра таламуса. Для исследования влияния производного гомоцистеи-на — таламокортикальные срезы предварительно инкубировали в гомоцистеин-тиолактоне (60 мин, 500 мкМ). Значение светопро-пускаемости ткани нормализовалось к уровню свечения до аппликации KCl [8]. Оценивали амплитуду рассеяния света в регионе интереса и время восстановления светопропускаемости ткани с использованием программы ImageJ (NIH, США). Проницаемость ГЭБ оценивали по степени экстравазации альбумина в ткани в го-могенате мозга с использованием красителя Evans Blue (ЕВ, 2мл/кг) при длине волны 620 нм c использованием ИФА ридера Multiscan FS (Thermo Scientific, США). Уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в таламокортикальных срезах мозга крыс определи спектрофото-метрически с использование набора (LDA, Colorimetric Assay Kit, Abcam, США). Статистическая оценка различий в сравниваемых выборках оценивалась для 5% уровня значимости. Нормальность распределения выборки определяли при помощи F-теста Фишера и критерия Шапиро-Уилка с использованием программы OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, США). Достоверность различий оценивали с помощью критерия Манна-Уитни для непараметрических выборок, где N — количество животных,
n — количество срезов. Все измерения проводили не менее, чем в 3 параллельных пробах, используя для повторения животных из разных помётов.
Результаты и обсуждение
Анализ РКД в срезах коры крыс контрольной группы показал, что 5 мин аппликация 50 мМ KCl приводила развитию через 0.8 ± 0.01 мин (n = 5) РКД в виде двухфазного ЛПП. В срезах мозга крыс с пре-натальной ГГЦ латентный период РКД был меньше и составил 0.6 ± 0.08 мин (n = 19, р < 0.05), а амплитуда и длительности ЛПП достоверно не отличались от контрольных значений. Горизонтальная скорость распространение ЛПП в соматосенсорной коре крыс с пре-натальной ГГЦ достоверно увеличивалась до 4.0 ± 0.5 мм/мин (n = 12, p < 0.05) по сравнению с контролем — 2.6 ± 0.8 мм/мин (n=10). РКД также приводила к полному подавлению вызванных синаптических ответов в IV слое соматосенсорной коры. В контрольной группе восстановление амплитуды ВПСП до 85 ± 9% (n = 14) наблюдалось к 60 мин после индукции РКД. В срезах коры крыс с пренатальной ГГЦ наблюдалось замедление восстановления амплитуды ВПСП и к 60 мин амплитуда составляла 65±8% (n = 6, p < 0.05) относительно значений до аппликации KCl. Аналогичные результаты были получены в экспериментах при инкубации таламокортикальных срезов в гомоцистеин-тиолактоне. Анализ светопропускаемости ткани при локальной аппликации 50 мМ KCl показал резкое увеличение ВОС в 4 слое коры (n = 12). Восстановление светопроницаемости среза наблюдалось через 5.0 ± 0.7 мин (n = 12). В тоже время в срезах коры крыс с ГГЦ наблюдалось 60% снижение амплитуды ВОС относительно контроля и увеличение времени восстановления светопропускае-мости ткани до 7.1 ± 0.5 мин (n = 11, р < 0.05).
В следующей серии экспериментов была произведена оценка уровня ЛДГ во внеклеточной жидкости при индукции РКД. В срезах коры крыс контрольной группы наблюдалось постепенное увеличение содержания ЛДГ во внеклеточной жидкости и через 150 мин составило 31 ± 2 нмоль/мин/мг (N = 3; p < 0.05). В срезах коры крыс с пренатальной ГГЦ через 150 мин после индукции РКД наблюдалось 2х-кратное увеличение концентрации ЛДГ в инкубационной среде (N = 3; p < 0.05) по сравнению с контролем, что свидетельствует о значительном повреждение или гибели клеток.
Анализ проницаемости ГЭБ не выявил выхода красителя за пределы церебральных сосудов в контрольных условиях. Предва-
рительное введение гомоцистеин-тиолактона (500 мкМ) вызывало 5-кратное увеличение проницаемости ГЭБ (N = 4; p < 0.05). В условиях пренатальной ГГЦ в тканях мозжечка наблюдалось 7-кратное увеличение концентрации EB (N = 7; p < 0.05), что свидетельствовало о значительном нарушении проницаемости ГЭБ.
Заключение
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о повышенной чувствительности и сниженной резистентности нейронов соматосенсорной коры крыс с пренатальной гипергомоцистеине-мией к развитию РКД. Также наши данные свидетельствуют о негативном влиянии высокого уровня гомоцистеина и его производных на проницаемость ГЭБ. Полученные данные указывают на нарушения эндотелия сосудов мозга, дисфункцию астроцитов и нейронов в хроническом действии высоких доз гомоцистеина
Работа выполнена в рамках гранта РНФ 20-15-00100
Список литературы
1. Troen A. M. // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2005. V. 29. pp. 1140-1151.
2. Трегуб П. П. // Росс. Физ. Журнал. им Сеченова. 2022. Т. 108. № 5. С. 579-593.
3. Gerasimova E., Burkhanova G., Chernova K., Zakharov A., Eni-keev D., Khaertdinov N., Giniatullin R., Sitdikova G. // Behav Brain Res. 2021. V. 409. № 113324.
4. Gerasimova E., Yakovleva O., Enikeev D., Bogatova K., Hermann A., Giniatullin R., Sitdikova G. //. Biomolecules. 2022. V. 12. № 735.
5. Yakovleva O., Bogatova K., Mukhtarova R., Yakovlev A., Shakhma-tova V., Gerasimova E., Ziyatdinova G., Hermann A., Sitdikova G. // Biomolecules. 2020. V. 10. № 7. P. 995.
6. Gerasimova E., Yakovleva O., Burkhanova G., Ziyatdinova G., Khaertdinov N., Sitdikova G. // BioNanoScience. 2017. V. 7. Pp. 155158.
7. Juzekaeva E., Nasretdinov A., Gainutdinov A., Sintsov M., Mukhtarov M., Khazipov R. // Frontiers in cellular neurosci. 2017. V. 11. № 390.
8. Borbely S., Kossy C., Somogyvari Z., Vilagi I. // European J Neuroscie. 2014. V. 39. Pp. 72-82.
THE LACTATE DEHYDROGENASE LEVEL DURING INDUCTION OF CORTICAL DEPRESSION IN BRAIN SLICES OF RATS WITH PRENATAL HYPERHOMOCYSTEINEMIA
Yakovlev A. V.1, Detterer A. S.1, Shakhmatova V. I.1, Gaifutdinova N. R.1, Sitdikova G. F.1
1 Kazan Volga Federal University, Kazan, Russia e-mail: alv.yakovlev@gmail.com
Abstract. It was found that high levels of homocysteine during of the prenatal period of brain development induced the cell damage, increase the BBB permeability and change the neurons sensitivity of rat somatosensory cortex to the spread of cortical depression.
Key words: hyperhomocysteinemia, lactate dehydrogenase, cortical depression, blood-brain barrier.
