CC BY
76
УДК 616.24-002:576.858.9
А.А.Григорьев, В.П.Бондарев, И.В.Дармов, А.В.Миронин, А.Г.Золотарев,
И.П.Погорельский, Д.С.Янов
УМЕРЕННЫЙ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗНЫЙ БАКТЕРИОФАГ: ОБНАРУЖЕНИЕ И СВОЙСТВА
ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской
Федерации», Киров
Впервые выделен умеренный легионеллезный бактериофаг из органов морской свинки, зараженной культурой Legionella pneumophila штамма Филадельфия-1. Установлено, что негативные колонии бактериофага от 1,5 до 2,5 мм в диаметре, центральная часть колоний прозрачная и окружена зоной неполного лизиса по периферии. По результатам электронной микроскопии корпускулы фага состоят из многогранной удлиненной головки растянутой гексагональной формы и короткого отростка. Бактериофаг специфичен, лизирует бактерии основных видов возбудителей болезни легионеров, но в то же время бактериофаг обладает определенной литической активностью в отношении клеток возбудителя туляремии. Простота использования выделенного бактериофага позволяет рекомендовать новый легионеллезный бактериофаг НИИМ для применения на практике.
Ключевые слова, болезнь легионеров, умеренный легионеллезный бактериофаг, лизогения, свойства, диаг-
ностика.
Болезнь легионеров является острым инфекционным заболеванием, характеризующимся разнообразием клинических проявлений, возбудителем которого являются факультативные внутриклеточные паразиты-легионеллы.
Легионеллезная пневмония составляет 2-6 % от общего числа пневмоний и до 10-15 % так называемых атипичных пневмоний, вызываемых микоплазмами, хламидиями, легионеллами и коксиелла-ми [7]. В США ежегодно регистрируют около 25000 случаев заболеваний, вызванных Legionella pneumophila. Вспышки носят как эпидемический (на фоне гиперэндемической активности), так и эпизодический харакер. Вместе с тем следует отметить увеличение доли нозокомиальных пневмоний. В России заболевание диагностируют с трудом, но есть сообщения о более чем 100 спорадических случаях легионеллеза. Не исключена возможность бессимптомного или субклинического течения легионеллеза, поскольку более 20 % лиц старшего возраста серопозитивны [5].
В странах, где налажена лабораторная диагностика легионеллеза, его доля среди госпитальных инфекций дыхательных путей неуклонно возрастает и составляет в среднем 0,5-4 % от числа больных пневмонией [7]. Очевидно, можно согласиться с высказыванием ряда специалистов о том, что спорадический легионеллез регистрируется там, где налажена лабораторная диагностика этого заболевания на должном уровне [5, 6].
В современных условиях диагностика большинства инфекционных заболеваний, ввиду их выраженного клинического полиморфизма, невозможна без объективного лабораторного подтверждения. В настоящее время предложено пять методических подходов, используемых в диагностике легионеллеза: выделение культуры возбудителя - «золотой стандарт»; определение уровня антител и растворимого антигена легионелл в моче; выявление возбудителя в клиническом материале с помощью методов иммунофлюоресценции, а также ДНК-зондов
или полимеразной цепной реакции [7, 8]. Вместе с тем следует отметить, что в схеме лабораторной диагностики практически всех опасных заболеваний бактериальной природы используются специфические бактериофаги, позволяющие в короткие сроки и с высокой степенью достоверности идентифицировать выделенную микробную культуру.
Метод использования бактериофагов (определение чувствительности этиологического агента болезни к диагностическому бактериофагу) по-прежнему рассматривается в качестве высокочувствительного, специфичного, экономичного, технологически простого, доступного и удобного для практического здравоохранения и массового анализа проб. Отсутствие подобного препарата, пригодного для диагностики болезни легионеров, существенно снижает эффективность противоэпидемических и лечебно-профилактических мероприятий.
На сегодняшний день многие аспекты биологии легионелл не изучены, в частности, оставался открытым вопрос и о наличии у них специфического бактериофага. Проведенный нами патентный поиск по фондам описаний изобретений России и ведущих зарубежных стран показал отсутствие данных о фактах обнаружения и способах выделения легио-неллезного бактериофага.
Известны многие бактериофаги, используемые для идентификации и фаготипирования бактерий различного систематического положения [1]. Этапы их получения, состоящие из выделения и накопления фаговых частиц, проверки специфичности свойств и последующем применении в целях лабораторной диагностики, являются типовыми. Однако известные бактериофаги не могут быть использованы для идентификации и фаготипирования легио-нелл в связи с высокой специфичностью механизмов взаимодействия бактерий и паразитирующих вирусов. По этой причине они не способны адсорбироваться на поверхности клеток легионелл, репродуцироваться в них и вызывать их лизис.
Целью настоящей работы явилось выделение
легионеллезного бактериофага и изучение его основных морфологических и физиологических свойств.
Бактериофаг выделен из органов морской свинки методом обогащения с «подсевом». Для этого инфицированных сублетальной дозой культуры ле-гионелл штамма Филадельфия-1 лабораторных животных усыпляли хлороформом через 8-16 сут после их заражения. Гомогенаты из паренхиматозных органов эвтаназированных животных заливали небольшим количеством забуференного физиологического раствора (ЗФР) NaCl (рН 7,0) и фильтровали через свечу Шамберлана. Полученные фильтраты вносили во флаконы с 2-суточной культурой легио-нелл штамма Филадельфия-1, выращенной в статических условиях при температуре 35-37 °С. В каждый флакон инокулировали 0,1 мл суспензии агаровой культуры, выращенной на угольно-дрожжевом агаре (УДА), содержащей l-icf КОЕ/мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Jl.A.Tapace-вича. Среды готовили согласно рекомендациям [6]. Легионеллы культивировали на УДА с добавлением L-цистеина гидрохлорида - 0,4 г/л, пирофосфата железа - 0,25 г/л, Aces-буфера - 10 г/л, а-кетоглу-таровой кислоты - 1 г/л, pH 6,9-7,0. Все реактивы произведены фирмой «Sigma». В качестве жидкой питательной среды использовали бульон на основе протеозопептона № 3 («Difco») - 15 г/л, дрожжевого экстракта - 10 г/л, NaHC03 - 0,042 г/л, К2НРО4 -4 г/л, КН2РО4 - 1 г/л и с добавлением L-цистеина гидрохлорида и пирофосфата железа в таких же количествах, что и в УДА.
После 3-15 сут инкубирования при температуре 35-37 °С в статических условиях содержимое очищали от бактерий фильтрованием. Фильтраты проверяли на присутствие в них легионеллезного бактериофага по методу агаровых слоев Грациа [4] с предварительным инкубированием смеси (фаг + культура) в термостате при температуре 35-37 °С в течение 20 мин. Спектр литического действия, адсорбционную способность, продолжительность латентного периода внутриклеточного развития выделенного фага, средний урожай фаговых частиц на одну инфицированную клетку определяли методами М.Адамса [1]. Тепловую инактивацию проводили путем нагревания суспензии бактериофага в 0,1 М фосфатном буфере в термостате на водяной бане. При каждой избранной температуре фаг выдерживали 10 мин. Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры фагов осуществляли методом негативного контрастирования 2 % водным раствором уранилацетата при увеличении в 60120 тыс. раз и ускоряющем напряжении 70 кВ. Экспериментальные исследования выполняли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Для получения антифаговой сыворотки были использованы кролики массой 3-5 кг. Иммунизацию проводили по методу М.Адамса [1]. Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами с использованием критерия Стьюдента (р<0,05) [2].
На начальном этапе выделения легионеллезно-го бактериофага из органов лабораторных животных обнаружены как мутные, так и с прозрачным
центром, зоной неполного лизиса по периферии негативные колонии (НК). Они имели правильную круглую форму с относительно ровными краями. Диаметр их не превышал 1,5-2,5 мм. Однако мутные НК отличались следами роста индикаторной культуры. Для выделения «чистой» линии бактериофага проводили многократные пересевы из прозрачных изолированных НК без признаков вторичного роста бактерий.
В результате десяти пассажей получена «чистая» линия фага, которая формировала только прозрачные негативные колонии на 2-слойном УДА, приготовленном по методу Грациа, с типовой индикаторной культурой L. pneumophila штамма Филадельфия-1. Легионеллезный бактериофаг через 4896 ч инкубирования при температуре 35-37 °С образовывал колонии округлой формы диаметром 1,52,5 мм с прозрачным центром и узкой зоной неполного лизиса по периферии, с относительно ровным краем (рис. 1, а). Нанесение фаговой суспензии на газон индикаторной культуры по методу Отто [4] вызывало через 48-72 ч термостатирования при температуре 35-37 °С образование четкой зоны специфического лизиса (рис. 1,6).
Бактериофаг вызывал лизогенизацию чувствительных к нему легионелл (Legionella pneumophila, Legionella micdadei, Legionella dumoffii и Legionella bozemanii) в бульоне и полужидком агаре при высокой множественности инфекции, в результате чего культуры приобретали иммунитет к гомологичному фагу.
По морфологии НК и способности к лизогениза-ции чувствительных к нему бактерий обнаруженный бактериофаг следует отнести к умеренным фагам.
Адсорбция фага индикаторными бактериями в жидкой среде составляла 90 %. Продолжительность латентного периода равна 2 ч. Средний выход фага из одной инфицированной клетки составляет 150+20 корпускул. Иммунизация кроликов суспензией бактериофага с адъювантом Фрейнда приводила к образованию специфических антител. Полученная антифаговая сыворотка в разведении 1:100 инактивировала 100 % бактериофага.
Фаг термолабилен. Инактивация начинается
Рис. 1. Виды лизиса индикаторной культуры L. pneumophila штамма Филадельфия-1:
а - морфология негативных колоний на двухслойном УДА, приготовленном по методу Грациа, х2; б - форма зоны лизиса при нанесении капли фага на агаровую культуру, х0,5
при температуре 50 °С, а полное разрушение происходит после инкубации при температуре 55 °С в течение 30 мин.
При посевной дозе 1 • 10б КОЕ в 1 мл 2-3-суточной бульонной культуры и множественности инфекции 0,01-0,1 в течение 24-36 ч инкубирования при температуре 35 °С накапливалось до 1-105 БОЕ/мл. Бактериофаг содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту, молекулярный вес которой составляет 13 • 10б дальтон.
Изучение ультраструктуры легионеллезного бактериофага показало, что он относится к третьей морфологической группе вирусов бактерий по А.С.Тихоненко [9]. По результатам электронной микроскопии корпускулы фага состоят из многогранной удлиненной головки растянутой гексагональной формы размером 60x30 нм и короткого отростка длиной (15±5) нм, рис. 2, а.
При инфицировании легионелл образуются в довольно значительном количестве корпускулы фагов (рис. 2, б), которые способны адсорбироваться на поверхности клеток L. pneumophila штамма Филадельфия-1 (рис. 2, в).
Бактериофаг высокоспецифичен и лизирует бактерии основных видов возбудителей легионеллеза: L. pneumophila (9 штаммов), L. micdadei штамм Tatlock, L. dumoffii штамм ТЕХ-^ и L. bozemanii штамм Wiga.
Бактериофаг не оказывает литического действия на Yersinia pestis (10 штаммов), Vibrio cholerae eltor, Bacillus anthracis, Brucella abortus, Yersinia pseudotuberculosis (10 штаммов), Escherichia coli (4 штамма), Salmonella choleraesuis, Streptococcus fae-cium, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris и Proteus mirabilis, Shigella sonnei и Shigella flex-neri, Serratia marcescens, Pseudomonas aeroginosa (2 штамма), Pasteurella multocida, Burkcholderia mallei,
Burkcholderia pseudomallei, Listeria monocytogenes. В то же время выделенный бактериофаг обладает определенной литической активностью в отношении клеток возбудителя туляремии: Francisella tularensis (штаммы № 499, 501, 503, 543, 15 НИИЭГ и Schu).
В результате проведенных исследований впервые из органов морской свинки выделен штамм умеренного легионеллезного бактериофага, активный в отношении L. pneumophila, L. micdadei, L. dumoffii и L. bozemanii. Непосредственно из культуры легионелл бактериофаг выделить не удалось. Таким образом, впервые обнаружен неизвестный ранее легионеллезный бактериофаг, активный в отношении основных видов возбудителей болезни легионеров, обладающий способностью к адсорбции на поверхности легионелл и вызывающий их лизис, обусловленный репродукцией фаговых частиц в инфицированной бактериальной клетке. Бактериофаг депонирован в коллекции фагов ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» под обозначением НИИМ. По результатам экспериментальных исследований оформлена заявка на изобретение и получен патент [3]. Бактериофаг обладает высокой специфичностью, лизируя только штаммы основных видов возбудителей болезни легионеров. В то же время родственные микроорганизмы, такие как Pas-teurella multocida, Yersinia spp, а также сапрофитные микроорганизмы, возбудители оппортунистических и опасных инфекций к этому бактериофагу не чувствительны, за исключением F. tularensis. Примечательно, что культуры F. tularensis в некоторых случаях также давали «перекрест» в серологических реакциях с антигеном возбудителя болезни легионеров [6]. По-видимому, на поверхности клеточных оболочек этих микроорганизмов имеются близкие по антигенной специфичности рецепторы, обеспечивающие начальные этапы литического процесса при использовании фага НИИМ в макси-
Рис. 2. Частицы легионеллезного бактериофага:
а - морфология фаговых корпускул, х 120000; б - клетка бактерии легионеллы с внутриклеточным фагом, х80000; в - адсорбция фаговых корпускул на поверхности клеточной стенки легионеллы, хбОООО
мальных концентрациях. Природа обнаруженного явления, возможно, обусловлена тесным филогенетическим родством бактерий родов Legionella и Francisella.
У легионеллезного бактериофага имеется отросток, однако концевая часть его видна не всегда. Концевой аппарат отростка в большинстве случаев не несет каких-либо дополнительных образований. Адсорбция корпускул бактериофага происходит равномерно по всей поверхности микробной клетки без преимущественной локализации их на отдельных участках. Очевидно антигенные локусы бактериальной клетки, ответственные за адсорбцию ле-гионеллезного бактериофага, равномерно распределены по всей поверхности микробной клетки.
Необходимо отметить, что отсутствие в литературе сведений о легионеллезном бактериофаге обусловлено, на наш взгляд, его чувствительностью к L-цистеину. Возбудитель болезни легионеров отличается высокой требовательностью к составу искусственных питательных сред. Обязательным и незаменимым компонентом любых (жидких и плотных) питательных сред, разработанных для выращивания легионелл, является L-цистеин. По данным Д.М.Гольдфарба и Т.Н.Брокер [4] L-цистеин оказывает прямое фагоцидное действие на многие бактериофаги, находящиеся в свободном состоянии. Для уменьшения противофагового действия L-цистеина был использован модифицированный двухслойный метод Грациа, используемый при обнаружении и титровании бактериофагов на плотных питательных средах. Предварительная инкубация смеси (фаг + культура) в термостате, очевидно, вызывает необратимую адсорбцию фаговых частиц на поверхности клеток легионелл. В таких условиях L-цистеин в меньшей степени оказывает противофаговое действие на бактериофаг, находящийся в контакте с бактериальной клеткой, и не подавляет репродукцию фага внутри легионеллезного микроба.
В настоящее время, несмотря на новейшие разработки молекулярно-биологических методов идентификации инфекционных агентов, основное значение при диагностике легионеллеза придается бактериологическим исследованиям, поскольку только выделение культуры легионелл является бесспорным доказательством болезни легионеров. Остальные методы, будь то ускоренные, серологические, молекулярно-биологические, пригодны лишь для постановки предварительного или ретроспективного диагноза.
Результаты исследований указывают на перспективность использования легионеллезного бактериофага НИИМ для обнаружения и идентификации легионелл при выделении от больных или объектов внешней среды. Они свидетельствуют о дос-
таточно высокой диагностической ценности легио-неллезного бактериофага НИИМ. Простота использования выделенного бактериофага позволяет рекомендовать новый бактериофаг НИИМ для применения на практике.
Использование бактериофага НИИМ в комплексе с другими методами (микробиологическими, биохимическими, серологическими и др.) позволяет повысить информативность анализов и, следовательно, улучшить качество лабораторной диагностики легионеллеза. Обнаруженный легионеллез-ный бактериофаг НИИМ может также найти применение в исследованиях генома возбудителя легионеллеза.
ШИТОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Адамс М. Бактериофаги. - М.: Иностранная литература, 1961. - 2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Отатистиче-ские методы в микробиологических исследованиях. - Л.: Изд-во мед. л-ры, 1962. - 3. Григорьев А.А, Пименов Е. В., Дармов И. В. и др. Штамм легионеллезного бактериофага НИИМ, активный в отношении Legionella pneumophila, L. micdadei, L. dumoffii и L. bozemanii. Патент РФ № 2236458, приоритет от 30.07.2003 // Бюл. - 2004. - № 26. - 4. Гольд -фарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 196. - 5. Медицин -ская микробиология. - М.: Медицина, 1999. - б. Прозоров -ский СВ., Покровский В.И., Тартаковский И.^ Болезнь легионеров (легионеллез). - М.: Медицина, 1984. -7. Тартаковский И^., Cинопальников А.И. // Клин. микробиол. и антимикробная химиотерапия. - 2003. - Т. 3 -№ 1. - S. Тартаковский И.^, Бархатова О.И., Темеж-никова Н.Д. и др. // Лаб. диагн. возбудит. опасных инф. бол. - Cаратов, 1998. - Т. 1. - 9. Тихоненко А.^ Ультраструктура вирусов бактерий. - М.: Наука, 1968. - 167 с.
A.A.Grigoriev, V.P.Bondarev, I.V.Darmov, A.V.Mironin, A.G.Zolotaryov, I.P.Pogorelsky, D.S.Yanov
A Temperate Legionellosis Bacteriophage:
Discovery and Characterization
48-th Central Research Institute of RFMinistry of Defense, Kirov
A temperate legionellosis bacteriophage was for the first time isolated from the organs of a guinea pig infected with a culture of Legionella pneumophila, Philadelphia-1 strain. Negative bacteriophage colonies had the diameter of about 1.5 to 2,5 mm. The central part of the colonies was translucent surrounded by a peripheral zone of incomplete lysis. Electron microscopic studies demonstrated the phage corpuscles to consist of a polyhedral elongated head stretched out and hexagonal in its form, and of a short process. The bacteriophage showed good specificity, subjecting to lysis the main bacterial species of the Legionnaires’ disease pathogens, and yet demonstrating certain lytic activity for the agent of tularemia. Simplicity of application of the new NIIM bacteriophage permits it to be recommended for use in routine practices.
Key words: Legionnaires’ disease, temperate legionellosis bacteriophage, lysogeny, characteristics, diagnosis.
nocTynn^a: 24.01.07.
