CC BY
116
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК 616.98:579.841.95:615.371
ТУЛЯРЕМИЙНЫЙ БАКТЕРИОФАГ:
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
С.А. Разгулин, А.А. Григорьев, ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»
Григорьев Аркадий Александрович - e-mail: aralgr@bk.ru
Умеренный бактериофаг туляремии был впервые изолирован от органов морской свинки, зараженной живой культурой туляремийного вакцинного штамма № 15, линии НИИЭГ. Отрицательные колонии бактериофага составляли до 2,0 мм в диаметре с неполной зоной лизиса в периферии. По результатам электронной микроскопии, бактериофаг представляет собой корпускулы нитевидной формы. Бактериофаг лизировал бактерии трех подвидов возбудителя туляремии и бактерии основных видов возбудителей легионеллеза. Простое использование бактериофага позволяет рекомендовать новый туляремийный бактериофаг GAL для практического применения.
Ключевые слова: туляремия, туляремийный бактериофаг, характеристики, диагностика.
Temperate tularemia bacteriophage was for the first time isolated from the organs of guinea-pig infected with live tularemia vaccine strain,N 15 of RIEH line. Negative colonies of bacteriophage were up to 2.0 mm in di-ameter with incomplete lysis zone at the periphery. In view of the results of electronic microscopy bacteriophage represented filamentous carpuscules. Bacteriophage lyzed bacteria of three subtypes of tularemia etiological agent and bacteria of the main species of legionellosis etiological agents. The simple use of bacteriophage allows to recommend new tularemia bacteriophage GAL for practical application.
Key words: tularemia, tularemia bacteriophage, characte-ristics, diagnostics.
Впервые выделен туляремийный бактериофаг из органов морской свинки, инфицированной живой культурой туляремийного вакцинного штамма № 15 линии НИИЭГ. Установлено, что негативные колонии бактериофага 2,0 мм в диаметре с зоной неполного лизиса по периферии. По результатам электронной микроскопии бактериофаг представляет собой корпускулы нитевидной формы. Бактериофаг лизирует бактерии возбудителей туляремии трех подвидов, а также основных видов возбудителей болезни легионеров. Простота использования выделенного бактериофага позволяет рекомендовать новые туляремийный бактериофаг для применения на практике.
Ключевые слова: туляремия, туляремийный бактериофаг, свойства, диагностика.
В настоящее время заболевания туляремией регистрируются в виде спорадических случаев или эпидемических вспышек разной интенсивности. Число случаев туляремии в последнее десятилетие колеблется от 100 до 400 в год, при этом около 75% заболеваний зарегистрировано в трех районах Российской Федерации: Северном, Центральном и ЗападноСибирском. Характерной особенностью заболеваемости последних лет является существенное увеличение доли больных среди жителей городов (до 75% от общего числа случаев). Периодически, примерно с десятилетним интервалом, возникают подъемы эпизодической активности, которые зачастую сопровождаются эпидемическими осложнениями [1].
Современное состояние природных очагов туляремии в Российской Федерации вызывает определенную
настороженность у эпидемиологов. Так, в 2005 г. в
Российской Федерации зарегистрирован 881 случай заболевания людей туляремией (уровень заболеваемости составил 0,60 на 100 тыс. населения). Этот показатель в 6,78 раза превышает уровень заболеваемости в аналогичный период предыдущего года [2]. Сроки установления окончательного диагноза у лиц с подозрением на данное заболевание были весьма длительными в связи с поздним обращением больных и значительной продолжительностью лабораторных исследований. В большинстве случаев диагноз туляремии поставлен ретроспективно на основании результатов иммунологических тестов [3].
Повышение заболеваемости людей туляремией свидетельствует об активизации природных очагов и уменьшении иммунной прослойки среди населения.
Напряженная эпидемическая обстановка, сложивщаяся в последнее время в Российской Федерации по ряду инфекционных заболеваний, включая туляремию, и неблагоприятный прогноз ее развития на ближайшие годы диктуют необходимость совершенствования средств их диагностики.
В настоящее время используются в диагностике туляремии бактериологические, иммунологические и молекулярногенетические методы исследования. Вместе с тем следует отметить, что в схеме лабораторной диагностике большинства особо опасных заболеваний бактериальной природы используются специфичные бактериофаги, позволяющие в короткие сроки и с высокой степенью достоверности идентифицировать выделенную микробную культуру.
Отсутствие подобного препарата для диагностики туляремии существенно снижает эффективность противоэпидемических и лечебно-профилактических мероприятий.
До настоящего времени вопрос о наличии у возбудителя туляремии специфического бактериофага оставался открытым. Проведенный нами патентный поиск по фондам описаний изобретений России и ведущих зарубежных стран показал отсутствие данных о фактах обнаружения и способах выделения туляремийного бактериофага.
Мнения исследователей о наличии бактериофага у туляре-мийного микроба неоднозначно. Одни авторы утверждают, что у франциселл нет собственных фагов [4], а другие приводят данные об обнаружении феномена бактериофагии у туляре-мийного микроба [5]. Обстоятельные исследования этого феномена туляремийного микроба выполнила О.С. Емельянова [6, 7]. По заключению автора, обнаруженный литический агент относится к умеренным фагам. Однако выделить и изучить туляремийный бактерифаг авторам не удалось.
Туляремия считается труднодиагностируемой инфекцией, несмотря на внедрение в практику лабораторных исследований ряда современных иммунологичнеских и молекулярногенетических методов. Эффективность диагностических мероприятий могла бы быть существенно повышена за счет использования специфического туляремийного бактериофага.
Цель исследования - выделение туляремийного бактериофага и изучении его основных морфологических и физиологических свойств.
Материалы и методы
Бактериофаг выделен из органов морской свинки методом обогащения с «подсевом». Инфицированных живой культурой туляремийного вакцинного штамма № 15 линии НИИЭГ лабораторных животных усыпляли хлороформом
через 6-14 суток после их заражения. Гомогенаты из паренхиматозных органов эвтаназированных животных заливали небольшим количеством забуференного физиологического раствора №С! (рН 7,0) и фильтровали через свечу Шамберлана. Полученные фильтраты вносили во флаконы с односуточной культурой РгаггаБеУа ^агегаБ штамма № 15 линии НИИЭГ, выращивали в статических условиях при температуре от +36° до +38°С в течение 48 ч. Затем каждый флакон инокулировали 0,1 см3 суспензии агаровой культуры Р ^агегыБ, выращенной на РТ-агаре, содержащей 1х109 КОЕ см3 по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. В качестве жидкой питательной среды использовали бульон на основе ферментативного гидролизата мяса, разведенного дистиллированной водой до содержания аминного азота 145-155 мг%-дм~3 с добавлением на 1,0 дм3 0,5 г №С!; 1,0 г №2НР04-12Н20; 0,2 г КС1; 0,25 г дрожжевого экстракта; 0,5 г 1_-цистеина.
После 3-15 суток инкубирования при температуре 36-38°С в статических условиях культуры фильтровали через нитро-целлюлезный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Фильтраты проверяли на присутствие в них туляремийного бактериофага по методу агаровых слоев Грациа [8, 9] с предварительным инкубированием смеси (фаг и культура) в термостате при температуре 36-38°С в течение 20 минут. Спектр литического действия, адсорбционную способность, продолжительность латентного периода внутриклеточного развития выделенного фага, средний урожай фаговых частиц на одну инфицированную клетку определяли методом М. Адамса [10]. Тепловую инактивацию проводили путем нагревания суспензии бактериофага в 0,1М фосфатном буфере в термостате на водяной бане. Для электронномикроскопических исследований препараты готовили путем адсорбции бактериофагов на поверхности сеток, покрытых формваровой подложкой, укрепленной углеродом и деионизированной непосредственно перед употреблением. Время адсорбции составляло 10 мин. Препараты контрастировали 1,0% водным раство-ром уранилацетата в течение 30 сек., после чего промывали на каплях воды и высушивали. Препараты просматривали на микроскопе ,1ео! 100Б при увеличении х 30000. Экспериментальные исследования выполняли с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Для получения антифаговой сыворотки были использованы кролики массой от 3 до 5 кг. Иммунизацию проводили по методу М. Адамса [10].Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами с использованием критерия Стьюдента (р<0,05) [11].
Результаты и их обсуждение
При посеве фильтрата методом агаровых слоев туляремийный бактериофаг формировал мутные, с нечетким неровным краем округлые негативные колонии, а также колонии с прозрачным центром и зоной неполного лизиса по периферии, диаметр которых не превышал 2,0 мм. Мутные негативные колонии (НК) имели следы роста индикаторной культуры. Выделение «чистой» линии бактериофага проводили путем многократных пересевов из изолированных НК без признаков вторичного роста бактерий.
Такой методический подход позволил получить «чистую» линию фага, который формировал негативные колонии на двухслойном РТ-агаре, приготовленном по методу Грациа, с
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
индикаторной культурой F. tularensis штамма № 501. Туляремийный бактериофаг через 48 ч инкубирования при температуре 36-38°С образовывал прозрачные колонии округлой формы с относительно ровным краем до 2,0 мм в диаметре, но при микроскопии на дне НК выявлялся слабо-выраженный рост индикаторной культуры. Нанесение фаговой суспензии на газон индикаторной культуры по методу Отто [9] вызвало через 48 ч термостатирования при температуре 36-38°С образование зоны специфического лизиса в виде «стерильного» пятна или четко контурируемого мутного пятна, или группы мелких негативных пятен (рис. 1).
Адсорбция фага индикаторными бактериями в жидкой среде составляла не менее 90%. Продолжительность латентного периода равна 4 ч. Средний выход фага из одной инфицированной клетки составляет 10±3 корпускулы. При иммунизации кроликов суспензией бактериофага с адъювантом Фрейнда образовывались специфические антитела. Полученная антифаговая сыворотка в разведении 1:100 инактивировала не менее 90% бактериофага.
Фаг термолабилен. Инактивация начинается при температуре 50°С, а полное разрушение происходит после инкубации при температуре 55°С в течение 30 мин. При посевной дозе 1х106 КОЕ в 1,0 см3 односуточной агаровой культуры и множественности инфекции 0,010-0,001 в течение 24-36 ч инкубирования при температуре 36°С накапливалось до1х104Б0Есм3.
Изучение ультраструктуры туляремийного фага показало, что он относится к первой морфологической группе вирусов бактерий по классификации А.С. Тихоненко [12]. По результатам электронной микроскопии бактериофаг представляет собой корпускулы нитевидной формы толщиной до 20 нм и длиной до 400 нм (рис. 2). Тип нуклеиновой кислоты - ДНК, молекулярная масса 20 кв.
Бактериофаг лизирует бактерии возбудителей туляремии трех подвидов (средне-азиатского, неарктического и голарктического), а также основных видов возбудителей болезни легионеров {Legionella pneumophila, Legionella micdadei, Legionella bozemanii, Legionella dumoffii). Бактериофаг не оказывает лити-ческого действия на Yersinia pestis, Vibrio cholera eltor, Bacillus anthracis, Brucella abortus, Yersinia pseudotuberculosis, Escherichia coli, Salmonella choleraesuis, Streptococcus faecium, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus saprophytics и
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris и Proteus mirabilis, Shigella sonnei и Shigella flexneri, Serratia marcescens, Pseudomonas aeroginosa, Pasteurella multocida, Burkcholderia mallei, Burkcholderia pseudomallei, Listeria monocytogenes.
Важно отметить, что выделенный фаг не способен лизиро-вать бактерии Francisella novicida - близкородственного по отношению к F. tularensis микроба.
рис. г.
Частицы нитевидного фага Francisella tularensis. Контрастирование уранилацетатом. х 30000.
Лизирующее действие туляремийного бактериофага в отношении легионелл определяли с использованием питательной среды на основе ВСУЕ (а)-агара, так как последние, в отличие от туляремийного микроба, не растут на БТ-агаре. Эти отличительные ростовые характеристики уже на этапе индикации позволяют дифференцировать возбудителей туляремии и легионеллеза.
В результате проведенных исследований впервые выделен штамм туляремийного бактериофага, обладающий специфической литической активностью в отношении Б. ■УагегаБ и основных видов болезни легионеров. Интерпретируя обнаруженную у туляремийного бактериофага способность лизировать бактерии основных видов возбудителя легионеллеза, необходимо отметить, что про-тивотуляремийная сыворотка в некоторых случаях также дает «перекрест» в серологических реакциях с антигеном
А} П Ж
рис. і.
Лизирующее действие бактериофага туляремийного ГАЛ в виде чётко контурируемого мутного пятна (а), «стерильного пятна» (б), мелких негативных колоний (в).
возбудителя болезни легионеров [13]. По-видимому, на поверхности клеточных оболочек всех названных микроорганизмов имеются близкие по антигенной специфичности рецепторы, обеспечивающие начальные этапы литического процесса при использовании туляремийного фага в максимальных концентрациях. Природа обнаруженного явления, возможно, обусловлена тесным филогенетическим родством данных микроорганизмов.
Необходимо отметить, что имевшие место ранее неудачные попытки выделения туляремийного бактериофага обусловлены, на наш взгляд, его чувствительностью к Ьцистеину. При этом возбудитель туляремии отличается высокой требовательностью к составу искусственных питательных сред, и обязательным и незаменимым компонентом жидких и плотных питательных сред для выращивания туляремийных бактерий является 1_-цистеин. Известно, что 1_-цистеин оказывает прямое фагоцидное действие на свободные бактериофаги [8]. Для уменьшения прямого противофагового действия 1_-цистеина нами был использован модифицированный двухслойный метод Грациа, включающий предварительную инкубацию смеси (фаг и культура) в термостате, в процессе которой, по-видимому, происходит необратимая адсорбция фаговых частиц на поверхности туляремийных бактерий. В таких условиях 1_-цистеин, обладающий фагоцидными свойствами, в меньшей степени воздействует на бактериофаг, связанный с бактериальной клеткой, и не подавляет репродукцию фага внутри туляремийных бактерий.
В настоящее время, несмотря на использование новейших диагностических методов, основное значение при лабораторной диагностике туляремии придается бактериологическим исследованиям, поскольку только выделение культуры Б. "ЫагегаБ является бесспорным доказательством заболевания. Все остальные методы, будь то иммунологические, молекулярно-генетические, пригодны лишь для постановки предварительного или ретроспективного диагноза.
Простота использования выделенного бактериофага позволяет рекомендовать его для применения на практике.
Использование туляремийного бактериофага в комплексе с другими методами лабораторной диагностики позволит повысить информативность анализа и, следовательно, улучшить качество лабораторной диагностики туляремии.
Заключение
Таким образом, в ходе многолетнего поиска впервые удалось выделить туляремийный бактериофаг и разработать способ его получения. Диагностический бактериофаг может быть использован в научных и практических лабораториях, занимающихся индикацией и идентификацией возбудителя туляремии, выделяемого из организма больного и контами-нированных объектов внешней среды, а также для изучения физиологических свойств и поверхностных структур штаммов туляремийного микроба. |Д!Ц
ЛИТЕРАТУРА
1. Приказ МЗ РФ. № 125 от 14.04.1999 г.
2. Здоровье населения и среда обитания. Информ. бюл. 2005. № 12 (153).
3. Антонов А.В. Клинико-эпидемиологическая характеристика туляремии в Краснодарском крае. Медицинская микробиология - XXI век / Матер. Всерос. науч.-практ. конф. Саратов, 2004. С. 23-24.
4. Домарадский И.В. Проблемы патогенности франциселл. Журн. микро-биол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. № 2. С. 106-110.
5. Колядицкая Л.С., Кучина К.В., Шмурыгина А.Г. О туляремийном бактериофаге. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1959. № 3. С. 13-16.
6. Емельянова О.С. О туляремийном бактериофаге. Проблемы особо опасных инфекций. 1971. № 3 (19). С. 202-206.
7. Олсуфьев Н.Н. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М., 1975. 192 с.
8. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М. : Медгиз, 1961. 521 с.
9. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., 1978. 392 с.
10. Адамс М. Бактериофаги. М. : Медгиз, 1961. 521 с.
11. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. : Медгиз, 1962. 125 с.
12. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М. : Наука, 1968. 89 с.
13. Прозоровский С.В., Покровский В.И., Тартаковский И.С. Болезнь легионеров. М. : Медицина, 1984. 207 с.
