CC BY
122018, т. 8, № 2
УДК: 611.41:612.824.1+616-092.4
УЛЬТРАСТРУКТУРА ОРГАНОВ ИММУНОГЕНЕЗА ПРИ РАДИАЦИОННОМ ПОРАЖЕНИИ И ВВЕДЕНИИ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В КАЧЕСТВЕ КОРРЕКЦИОННОЙ ТЕРАПИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Абсеттарова А. И.1, Макалиш Т. П.2, Сукиасян Ю. Н.1
'Кафедра нормальной анатомии, Медицинская академия им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», 295051, ул. А. Невского 27а, Симферополь, Россия
2Центральная научно-исследовательская лаборатория, Медицинская академия им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им.В. И. Вернадского», 295051, бульв. Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Абсеттарова Алие Ибрагимовна, соискатель кафедры нормальной анатомии Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», e-mail: [email protected]
For correspondence: Absettarova Alie Ibrahimovna, normal anatomy department, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU; e-mail: [email protected]
Information about authors:
Absettarova A. I. https://orcid.org/0000-0002-0588-6854 Makalish T. P. https://orcid.org/0000-0003-1884-2620 Sukiasyan Yu. N. https://orcid.org/0000-0002-4934-2437
РЕЗЮМЕ
В связи с возрастающим уровнем радиации во многих регионах Российской Федерации актуален поиск радиопротекторных и иммунотропных препаратов. Одним из перспективных направлений является использование цереброспинальной жидкости лактирующих коров. Цель работы - изучить ультраструктуру костного мозга и селезенки в постлучевой период после коррекции ксеногенной цереброспинальной жидкостью. Изучали ультраструктуру костного мозга и селезенки зрелых крыс линии Вистар после облучения в дозе 5 Гр на трансмиссионном электронном микроскопе ПЭМ-125. Контрольная группа животных получала инъекции 0,9% раствора NaCl, экспериментальная - прижизненно взятую криоконсервированную цереброспинальную жидкость крупного рогатого скота в дозе 2 мл/кг живого веса каждые третьи сутки в течение месяца. Облучение в дозе 5 Гр вызывает изменение ультраструктуры костного мозга и селезенки, массовую гибель клеток. К 30-м суткам популяция восстанавливается за счет пролиферации уцелевших мультипотентных клеток. Введение ксеногенной цереброспинальной жидкости приводит к стимуляции пролиферации клеток различных дифферонов костного мозга с дальнейшей репопуляцией клеточного состава в периферических органах. На 7-е сутки проявления последствий облучения значительно меньше, чем в контрольной группе. К 30-м суткам клетки со следами повреждений отсутствуют.
Ключевые слова: ультраструктура; костный мозг; селезенка; цереброспинальная жидкость; облучение.
THE ULTRASTRUCTURE OF THE ORGANS OF IMMUNOGENESIS AFTER RADIATION INJURY AND INJECTIONS OF THE CEREBROSPINAL FLUID AS A CORRECTIVE THERAPY IN EXPERIMENT
Absettarova A. I.1, Makalish T. P.2, Sukiasyan Yu. N.1
'Normal anatomy department of Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
2Central research laboratory of Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
Since the level of radiation is growing in many regions of Russian Federation, the search for radioprotective and immune drugs is an acute issue. One of the promising areas is the use of the cerebrospinal fluid of lactating cows. The aim of the work is to study the ultrastructure of bone marrow and spleen at the post-radiation period after correction by the xenogenic cerebrospinal fluid. The ultrastructure of bone marrow and spleen of mature Wistar rats was studied after irradiation with a dose of 5 Gr using the transmission electron microscope PEM-125. The control group of animals received injections of 0.9% NaCl solution, the experimental group received the obtained in vivo and then cryopreserved cerebrospinal fluid of cows with a dose of 2 ml / kg every third day during a month. The radiation with a dose of 5 Gr caused changes in bone marrow and spleen ultrastructure and massive death of cells . On the 30th day, the cellular population was restored due to the proliferation of the survived multipotent cells. The administration of the xenogenic cerebrospinal fluid resulted in stimulation of cell proliferation of various differons in the bone marrow with subsequent repopulation of the cellular content in the peripheral organs. On the 7th day, the manifestation of the radiation effects was smaller than in the control group. By the 30th day there were no cells with traces of damage.
Key words: ultrastructure; bone marrow; spleen; cerebrospinal fluid; irradiation.
По данным ВОЗ, среди факторов, формирующих здоровье человека, 20% принадлежит окружающей среде [1]. К этой группе факторов относятся состояние воздуха, качество воды, колебания электромагнитного и гравитационного полей, уровень ультрафиолетового и радиоактивного излучения. Последний из перечисленных факторов оказывает наиболее губительное влияние на здоровье человека [2]. Люди каждый день подвергаются воздействию естественного и искусственного излучения. Естественное излучение происходит из многочисленных источников, включая более 60 естественным образом возникающих радиоактивных веществ в почве, воде и воздухе; космическое излучение. На человека воздействует также излучение из искусственных источников — от производства ядерной энергии до использования медицинского оборудования для радиационной диагностики или лечения [3].
Подобная ситуация заставляет ученых искать препараты, обладающие радиопротекторными и иммуномодуляционными свойствами [4, 5]. Одним из перспективных направлений является использование цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) лактирующих коров в качестве субстрата для изготовления препарата, обладающего иммуностимулирующим эффектом благодаря высокому содержанию в ней факторов роста, гормонов и других биологически активных веществ, а также отсутствию видовой и индивидуальной специфичности [6, 7].
Целью нашей работы явилось изучение ультраструктуры костного мозга и селезенки в постлучевой период при коррекции ксеногенной ЦСЖ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент проводили на крысах линии Вистар в раннем половозрелом возрастном периоде. Животных подвергали однократному тотальному гамма-облучению на линейном ускорителе Clinac 2100 (Varian, США) на базе ГБУЗ Республики Крым «Крымский республиканский онкологический клинический диспансер им. В. М. Ефетова» (г. Симферополь) в дозе 5 Гр с целью моделирования костномозговой формы острой лучевой болезни. После облучения каждые третьи сутки животные получали инъекции 0,9% раствора (контрольная группа) или ксеногенную ЦСЖ (экспериментальная группа), взятую путем субок-ципитальной пункции от лактирующих коров породы красная степная в дозе 2 мл/кг живого веса. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом на 7-е и 30-е сутки от начала эксперимента.
Кусочки костного мозга и селезенки размером 1 мм3 фиксировали в 2,5% растворе глю-тарового альдегида на фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 в течение 1 часа при температуре -4°С. Материал промывали в 0,1 М фосфатном буфере 3 раза по 20 минут и дофиксировали 1% раствором тетраоксида осмия на 0,1% фосфатном буфере 2,5 часа. После проведения через батарею спиртов возрастающей концентрации и абсолютный ацетон, материал заключали в смесь эпоксидных смол в капсулы. Полимеризацию осуществляли в термостате при температуре 37°С (12 часов), 56°С (12 часов), 45°С (12 часов). Полутонкие срезы толщиной 0,5-1,5 мкм изготавливали на ультратоме ЛКБ-460 с последующим контрастированием метиленовым синим. После изучения полутонких срезов, готовили ультратонкие срезы с помощью ультрамикротома ULTRACUT с последующим контрастированием уранилацетатом и цитратом свинца. Просмотр и фотографирование срезов производили на электронном микроскопе ПЕМ-106.
Исследование выполнено в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Молекулярная биология» Медицинской академии им. С.И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского.
РЕЗУЛЬТАТЫ
У крыс экспериментальной группы (при коррекции облучения введением ЦСЖ) на 7-е сутки после облучения костный мозг демонстрировал ультрамикроскопическую картину, сходную с образцами группы контроля, включавшую облученных животных без коррекции. Выявлены повреждения клеток: от полной деструкции бластных форм до частичных изменений в зрелых клетках всех дифферонов. Однако более выражены такие изменения в группе контроля. На данном сроке эксперимента у подопытных животных лимфобласты имеют ядро округлой формы, оно занимает большую часть площади клетки, перинуклеарное пространство расширено, по периферии кариоплазмы расположены крупные глыбки хроматина (рис. 1).
Ультраструктура селезенки в раннем постлучевом периоде также характеризуется наличием клеточного детрита, клеток с признаками повреждений: нарушение целостности цито- и ка-риолеммы, вакуолизация цитоплазмы (рис. 2). Данные изменения коснулись в первую очередь лимфоцитов как наиболее радиочувствительных клеток, однако ретикулярные клетки микроокружения также имеют признаки деструкции. Также растет количество активно фагоцитирующих макрофагов. Трехкратное введение лик-вора мало сказывается на состоянии повреж-
2018, т. 8, № 2
Рис. 1. Костный мозг подопытных животных, 7-е сутки эксперимента. Вакуолизация цитоплазмы и расширение перинуклеарного пространства (указано стрелкой) клеток лимфоидного ряда.
1 - малый лимфоцит, 2 - митоз. ТЭМ. х 4800.
Рис. 2. Селезенка крысы экспериментальной группы, 7-е сутки эксперимента. 1 -лимфобласт, 2 - плазмоцит, 3 - нейтрофильный гранулоцит, 4 - эритроцит, 5 - макрофаг, 6 - базофильный гранулоцит. ТЭМ. х 4800.
денных клеток, т.к. регенерация лимфоидной ткани происходит по клеточному типу. Вместе с тем в красной пульпе встречаются единичные лейкоциты без признаков повреждения, мигрировавшие сюда, вероятно, из костного мозга.
На 30-е сутки в костном мозге подопытных животных единичные проэритробласты содержат округлой формы крупное ядро с конденсированным по краю кариоплазмы хроматином и 2-3 ядрышками. Базофильные эритробла-сты имеют округлое ядро со слабовыраженны-ми инвагинациями, равномерно распределенным мелкодисперстным хроматином (рис. 3).
Пролимфоциты, в количественном отношении, также как и лимфобласты, немногочисленны, содержат округлые митохондрии с фрагментированными кристами, полисомы, вакуоли и расширенную гранулярную цито-плазматическую сеть, обедненную рибосомами.
Рис. 3. А Костный мозг подопытных животных,
30-е сутки эксперимента. Скопление клеток эритроидного и миелоидного ростков. 1 - базофильный эритробласт, 2 - полихроматофильный эритробласт, 3 - нейтрофильный гранулоцит, 4 -ретикулоциты, 5 - нормоциты, 6 - эритроциты. ТЭМ. х 2600. Б. Делящаяся клетка (1), лимфоцит (2), сегментоядерный эозинофил (3), плазматическая клетка с хорошо развитой шероховатой цитоплазматической сетью (4), тромбоцит (5).
ТЭМ. х 3200.
В ядрах малых лимфоцитов значительно преобладал гетерохроматин, цистерны шероховатой цитоплазматической сети были расширены, содержат мало рибосом на своей поверхности. В цитоплазме плазматических клеток выявлен хорошо развитый комплекс Гольджи, массивная, богатая рибосомами гранулярная цитоплазма-тическая сеть, ядра с множественными инвагинациями. Крупные овальной формы ядра плаз-мобластов занимают большую часть клетки, вокруг них выявлены просветления перинуклеар-ного пространства, в цитоплазме хаотично располагаются увеличенные митохондрии с дезориентированными внутренними мембранами.
Активация регенераторных и усиление компенсаторных процессов всех ростков красного костного мозга при коррекции последствий облучения путем введения ЦСЖ приводит к восстановлению клеточной популяции в периферических органах иммуногенеза. В паренхиме селезенки признаков деструкции клеток обнаружено не было. Пульпа селезенки полнокровна, в капиллярах большое количество эритроцитов, встречали тромбоциты. Ретикулярные клетки со светлым ядром и светлой цитоплазмой, содержащей большое количество гранул, митохондрий (рис. 4). Присутствуют лимфоциты различной степени зрелости (средние, малые). По небольшому количеству выростов цитолеммы и фагосом можно предположить умеренную активность макрофагов.
Рис. 4. Селезенка облученной крысы после коррекции ЦСЖ, 30-е сутки эксперимента. Обилие лимфоцитов различных классов (обозначены стрелками). 1 - эритроцит, 2 - макрофаг. ТЭМ. х 2400.
ОБСУЖДЕНИЕ
Ионизирующее излучение вызывает изменения на всех уровнях организации живого организма. На субклеточном уровне наиболее частыми повреждениями являются нарушения целостности клеточных мембран: от измене-
ния проницаемости до разрывов, нарушение мембран органелл, приводящие к гибели митохондрий и разрыву лизосом с последующим аутолизисом - так называемая некротическая форма лучевой гибели клеток. Другая форма -апоптозная, возникает при первичном повреждении ядра с конденсацией ядерного материала и повреждений хромосом [8, 9]. Мы наблюдали обе формы лучевого повреждения клеток. Ультраструктурные изменения в контрольной и в подопытной группах, в целом, отражают деструктивные последствия облучения в клетках всех дифферонов, однако, более выражены они в контрольной группе. В костном мозге животных после коррекции ЦСЖ наиболее радиочувствительными оказались ранние представители лимфоидного ряда. Вследствие названных ранее процессов значительно снизилась плотность клеточных элементов в кровотоке и периферических органах иммуногенеза. Клеточный состав в селезенке значительно сдвинулся в сторону увеличения нейтрофилов, что характерно для ранних сроков постлучевого периода [10]. Уменьшилось относительное количество макрофагов, плазматических клеток и лимфобла-стов вследствие повреждения соответствующих дифферонов ростков красного костного мозга.
Ультрамикроскопическое исследование показало, что во всех возрастных группах коррекция последствий радиоабляции введением ЦСЖ взывает стимуляцию дифференцирования ретику-лоцитов и тромбоцитов. Темпы восстановления числа нейтрофильных гранулоцитов выше, количество сегментоядерных лейкоцитов в опытной группе превышает значение контроля на 16,46 %.
После трехкратного введения ликвора количество клеточных элементов в паренхиме селезенки значительно возрастает, особенно это заметно в красной пульпе за счет существенно увеличившегося количества лимфобластов и плазматических клеток. Все еще встречаются поврежденные клетки и клеточный детрит, однако есть и целые клетки, вероятнее всего мигрировавшие сюда с током крови из центральных органов иммунитета. Уже на ранних сроках постлучевого периода после коррекции ЦСЖ количество бластов значительно больше в сравнении с контрольными животными. Среди созревающих пролиферирующих и созревающих непролифе-рирующих клеток костного мозга степень деструктивных процессов значительно отстает от их выраженности в группе контроля. Вследствие восстановления пролиферативной активности в костном мозге начинается заселение новыми клетками периферических органов иммуногенеза. Восстановления пролиферативной активности и бласттрансформации в них наступает
2018, т. 8, № 2
несколько позже. Признаки таких процессов мы наблюдали лишь на 30-е сутки эксперимента.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, мы пришли к выводу, что введение ликвора облученным животным приводит к скорейшей активации процессов регенерации и как следствие более раннему их завершению.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors have no conflict of interest to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Информационный бюллетень ВОЗ от 29 апреля 2016 г (http://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/ detail/ionizing-radiation-health-effects-and-protective-measures).
2. Зайцева Е.М., Шигапова Н.В. Радиация, ее влияние на организм человека. Актуальные проблемы инновационного педагогического образования. 2018.2(5):23-26.
3. Башилов Н.И. Естественные источники ионизирующего излучения. Молодой ученый. 2018. 24(210):277-282.
4. Конюхов Г.В., Тарасова Н.Б., Низамов Р.Н., Василевский Н.М., Асланов Р.М., Великанов В.И. Моле-кулярно-биологические принципы разработки противорадиационных диагностических и лечебно-профилактических средств. Ветеринарный врач. 2016.3:3-9.
5. Bakarat I. A.H. [et al.] Evaluation of radio protective effects of wheat germ oil in male rats. Journal of American Science. 2011.7(2):664-673.
6. В. С. Пикалюк, Е. Ю. Бессалова, В. В. Ткач (мл) и др.Ликвор как гуморальная среда организма.Симфе-рополь: ИТ «АРИАЛ», 2010.
7. Dean A. Seehusen. Mark M. Reeves, Demitri A. Fomin. Cerebrospinal fluid investigation. Медицина св^у. 2006.21(4):185-190.
8. Гильяно Н.Я., Коневега Л.В., Журишкина Е.В., Степанов С.И., Носкин Л.А. Влияние низких доз излучения иттербия-169 на пролиферацию и гибель клеток человека в культуре. Патогенез. 2015. 13(4):57-61.
9. Zal Z., Ghasemi A., Azizi S., Asgarian-Omran H., Montazeri A., Hosseinimehr SJ. Radioprotective Effect of Cerium Oxide Nanoparticles Against Genotoxicity Induced by Ionizing Radiation on Human Lymphocytes. Current Radiopharmaceuticals 2018.11(2):109-115.
10. М. А. Кривенцов, Е. Ю. Бессалова, Н. В. Де-вятова и др. Количественные изменения периферической крови крыс после облучения. Биологические исследования. Сборник научных работ V Всеукраинской научно-практической конференции молодых ученых и студентов.2014:343-346.
REFERENCES
1. Informacionnyj byulleten' VOZ ot 29 aprelya 2016 g. (http://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/ ionizing-radiation-health-effects-and-protectivemeasures).
2. Zajceva E.M., Shigapova N.V. Radiaciya, ee vliyanie na organizm cheloveka. Aktual'nye problemy innovacionnogo pedagogicheskogo obrazovaniya. 2018.2(5):23-26.
3. Bashilov N.I. Estestvennye istochniki ioniziruyushchego izlucheniya. Molodoj uchenyj. 2018. 24(210):277-282.
4. Konyuhov G.V., Tarasova N.B., Nizamov R.N., Vasilevskij N.M., Aslanov R.M., Velikanov V.I. Molekulyarno-biologicheskie principy razrabotki protivoradiacionnyh diagnosticheskih i lechebno-profilakticheskih sredstv Veterinarnyj vrach. 2016.3:3-9.
5. Bakarat I. A.H. [et al.] Evaluation of radio protective effects of wheat germ oil in male rats. Journal of American Science. 2011.7(2):664-673.
6. V. S. Pikalyuk, E. YU. Bessalova, V. V. Tkach (ml) i dr.Likvor kak gumoral'naya sreda organizma.Simferopol': IT «ARIAL», 2010.
7. Dean A. Seehusen. Mark M. Reeves, Demitri A. Fomin. Cerebrospinal fluid investigation. Медицина св^у. 2006.21(4):185-190.
8. Gil'yano N.YA., Konevega L.V., ZHurishkina E.V., Stepanov S.I., Noskin L.A. Vliyanie nizkih doz izlucheniya itterbiya-169 na proliferaciyu i gibel' kletok cheloveka v kul'ture. Patogenez. 2015. 13(4):57-61.
9. Zal Z., Ghasemi A., Azizi S., Asgarian-Omran H., Montazeri A., Hosseinimehr SJ. Radioprotective Effect of Cerium Oxide Nanoparticles Against Genotoxicity Induced by Ionizing Radiation on Human Lymphocytes. Current Radiopharmaceuticals 2018.11(2):109-115.
10. M. A. Krivencov, E. YU. Bessalova, N. V. Devyatova i dr. Kolichestvennye izmeneniya perifericheskoj krovi krysposle oblucheniya. Biologicheskie issledovaniya. Sborniknauchnyh rabot V Vseukrainskoj nauchno-prakticheskojkonferencii molodyh uchenyh i studentov. 2014:343-346.
