УЧАСТИЕ μ-ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ АНТИНЕКРОТИЧЕСКОГО И ИНОТРОПНОГО ЭФФЕКТОВ НА ИЗОЛИРОВАННОЕ СЕРДЦЕ У КРЫС ПОСЛЕ АДАПТАЦИИ К ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 3 - P. 7-11

Раздел I

БИОЛОГИЯ СЛОЖНЫХ СИСТЕМ. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

УДК: 616-092.4 DOI: 10.12737/artide_59c49abf90e9f4.50857698

УЧАСТИЕ ц-ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕАЛИЗАЦИИ АНТИНЕКРОТИЧЕСКОГО И ИНОТРОПНОГО ЭФФЕКТОВ НА ИЗОЛИРОВАННОЕ СЕРДЦЕ У КРЫС

ПОСЛЕ АДАПТАЦИИ К ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ

Е.С. ПРОКУДИНА*, Ю.В. БУШОВ**

*Научно-исследовательский институт кардиологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук, пер. Кооперативный, 5, Томск, Томская обл., 634009, Россия,

e-mail: goddess27@mail.ru ** Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, Томская обл., 634050, Россия,

e-mail: bushov@bio.tsu.ru

Аннотация. Было оценено участие кардиальных р-опиоидных рецепторов (ОР) в повышении устойчивости сократительной активности миокарда к действию ишемии и реперфузии на изолированные сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии. Кроме того, оценивали степень некротической гибели кардиомиоцитов в ответ на моделирование ишемии-реперфузии изолированного сердца крысы. Адаптацию животных к гипоксии проводили непрерывно на протяжении 21 суток при 12% О2. У крыс моделировали глобальную ишемию (45 минут) и ре-перфузию (30 минут) изолированного сердца. Адаптация к хронической гипоксии уменьшала репер-фузионное высвобождение креатинфосфокиназы из некротизированных кардиомиоцитов, а также улучшала постишемическое восстановление сократительной активности изолированного сердца: увеличивались реперфузионные значения силы сокращения миокарда, а также снижалась степень реперфузионной контрактуры миокарда. Перфузия изолированных сердец адаптированных крыс раствором пептида СТАР (100 нМ/л, селективный р-ОР-антагонист) устраняла антинекротическое и инотропное действие хронической непрерывной нормобарической гипоксии. Полученные данные свидетельствуют о том, что кардиальные р-опиоидные рецепторы принимают участие в реализации антинекротического и инотропного эффектов у крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобарической гипоксии.

Ключевые слова: адаптация, гипоксия, опиоидные рецепторы, миокард, сократимость, некроз.

INVOLVEMENT OF ц-OPIOID RECEPTORS IN IMPLEMENTATION OF ANTINECROTIC AND INOTROPIC EFFECTS ON ISOLATED RATS HEART AFTER ADAPTATION

TO CHRONIC HYPOXIA

E.S. PROKUDINA*, U.V. BUSHOV**

* Research Institute of Cardiology, Tomsk National Research Medical Center, Per. Cooperative, 5, Tomsk, Tomsk

region, 634009, Russia,e-mail: goddess27@mail.ru. **Tomsk State University, Lenin Ave., 36, Tomsk, Tomsk region, 634050, Russia, e-mail: bushov@bio.tsu.ru

Abstract. It was assessed the involvement of cardiac p-opioid receptor (OR) in improving resistance of myocardial contractility to ischemia and reperfusion on the isolated hearts in rats adapted to chronic continuous normobaric hypoxia (CCNH). Furthermore, it was evaluated the degree of necrotic death of of cardi-omyocytes in response to ischemia-reperfusion of isolated rat heart. Rats were adapted to hypoxia continuously for 21 days at 12% O2. On isolated rats hearts was simulated global ischemia (45 min) and reperfusion (30 minutes). Adaptation to CCNH reduced the release of creatinkinase from necrotic cardiomyocytes,

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 3 - P. 7-11

and improved post-ischemic recovery contractility of isolated hearts: increased myocardial contractile force values at reperfusion, and reduced degree of myocardial reperfusion contracture. Perfusion of isolated hearts from adapted rats with CTAP (100 nM/l, selective p-OR-antagonist) eliminated the antinecrotic and inotropic effects of chronic continuous normobaric hypoxia. This data suggest that cardiac p-opioid receptors are involved in the implementation of antinecrotic and inotropic effects in rats adapted to chronic continuous normobaric hypoxia.

Key words: adaptation, hypoxia, opioid receptors, myocardium, contractility, necrosis.

Введение. Для нормальной работы сердца необходима постоянная доставка достаточного количества кислорода, поэтому продолжительная ишемия и следующая за ней реперфузия могут привести к необратимому повреждению и гибели кардиомиоцитов. Одним из эффективных методов, способных повысить устойчивость сердца к ишемии и реперфузии является адаптация к хронической гипоксии [6]. Защитный эффект адаптации к длительной гипоксии продолжительный и сохраняется дольше, чем при других формах кардиопротекции. Новорожденные кролики после курса хронической ги-побарической гипоксии обладали повышенной толерантностью к ишемическому-

реперфузионному повреждению даже после нескольких недель пребывания в нормоксиче-ских условиях [3]. В нашем недавнем исследовании, выполненном на модели ишемии-реперфузии изолированного сердца крысы, удалось обнаружить, что кардиопротекторный эффект адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии реализуется при участии кардиальных опиоидных рецепторов (ОР) [5]. Остается неясным, какую роль в механизме кардиопротекции играют различные субтипы ОР, в том числе р-опиоидные рецепторы.

Цель исследования - исследовать участие ц-опиоидных рецепторов (ОР) в уменьшении степени некроза и повышении устойчивости сократительной активности миокарда при моделировании глобальной ишемии и реперфу-зии изолированного сердца у крыс, адаптированных к хронической непрерывной нормобари-ческой гипоксии (ХННГ).

Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на аутбредных крысах-самцах Вистар массой 250-280 г. Экспериментальное исследование выполнялось в соответствии с рекомендациями, изложенными в Приказе МЗ СССР за № 755 от 12 августа 1977 г., а также принятыми в Хельсинской декларации 1975 г. и дополненными в 1983 г. Все болезнен-

ные процедуры были выполнены на наркотизированных диэтиловым эфиром животных. Дизайн исследования включал 6 групп животных, по 12 особей в каждой группе (всего 72). Неадаптированных крыс содержали в стандартных условиях вивария с постоянным доступом к воде и пище. Адаптацию животных к гипоксии проводили путем непрерывного содержания их в гипоксической камере при 12% О2, 0,03% СО2 и нормальном атмосферном давлении в течение 21 дня [6]. Контроль газового состава в гипоксической камере осуществлялся с помощью датчиков TCOD-IR и OLC 20 (Oldham, Франция) и аппарата «Био-нова-204G4R1» (НТО «Био-нова», Москва, Россия) через блок управления МХ 32 (Oldham, Франция). За 24 часа до начала эксперимента адаптированных крыс извлекали из гипоксической камеры.

Глобальную ишемию и реперфузию моделировали на изолированном перфузируемом сердце крысы. Животных наркотизировали эфиром, из грудной клетки извлекали сердца и помещали в раствор Кребса-Хензелайта, охлажденный до 4° С. Через канюлированную аорту изолированное сердце перфузировали буфером Кребса-Хензелайта по методу Лангендорфа. Протокол эксперимента включал 20 минут нормоксической перфузии изолированного сердца (нормоксия), затем путем прекращения перфузии моделировали 45-минутную глобальную ишемию и последующую 30-минутную реперфузию. Изолированные сердца животных контрольных групп подвергали нор-моксической перфузии в течение 95 минут. Параметры сократительной активности изолированного сердца регистрировались с помощью латексного баллончика, заполненного дистиллированной водой и введенного в полость левого желудочка. Латексный баллончик был соединен с датчиком давления SS13L (Biopac System Inc., Goleta, США) и подключен к аппарату для электрофизиологических исследований МР35 (Biopac System Inc., Goleta, США). Измеря-

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 3 - P. 7-11

лись следующие параметры сократительной активности изолированного сердца крысы: давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ, мм рт. ст.), характеризующее силу сокращения миокарда, конечное диастолическое давление (КДД, в % от исходных значений). КДД используется для оценки функции расслабления миокарда и характеризует степень его реперфузионной контрактуры [1]. Значения исследуемых параметров сократительной активности регистрировались как в период нор-моксии, так и на 5, 15 и 30 минутах реперфузии изолированного сердца.

Для оценки участия р-опиоидных рецепторов в реализации кардиопротекторного эффекта ХННГ за 10 минут до моделирования глобальной ишемии изолированные сердца пер-фузировали раствором селективного антагониста р-ОР пептида СТАР в концентрации 100 нМ/л [4].

Степень некроза миокарда оценивали по измерению активности креатинфосфокиназы (КФК, Ед/г) в перфузионном растворе, оттекающем от сердца в период реперфузии. Активность КФК измеряли с помощью энзимати-ческих наборов CK-NAc (Analyticon Biotechnologies, Германия) на спектрофотометре SmartSpec (Bio-Rad, США) при длине волны 340 нм. В качестве контроля принималась активность КФК в перфузате, оттекающем от изолированного сердца с нормоксической перфузией.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы «Statistica 8.0». Рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (SEM). Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Критическим принимался уровень значимости р<0,05.

Результаты и их обсуждение. Моделирование глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца сопровождалось некрозом кардиомиоцитов, выходом креатинфосфокина-зы из разрушенных клеток и, соответственно, увеличением активности КФК в перфузионном растворе (табл. 1). Однако если у неадаптированных крыс активность КФК в период репер-фузии возрастала в 4,6 раз по сравнению с контролем, то у адаптированных животных - лишь в 2,1 раза по сравнению с исходным значением (табл. 1). Использование селективного антагониста СТАР у неадаптированных крыс не влия-

ло на реперфузионные значения КФК (табл. 1). Селективная блокада р-ОР у адаптированных к гипоксии особей устраняла защитное действие ХННГ - значения КФК в реперфузию было неотличимо от такового в группе сравнения. Таким образом, антинекротический эффект адаптации к ХННГ реализуется с участием карди-альных р-опиоидных рецепторов.

Таблица 1

Активность креатинфосфокиназы (Ед/г ткани) в перфузионном растворе (M±SEM)

Группа Неадаптированные Адаптированные

Нормоксия 10,8±2,2 9,0±1,0

Ишемия-реперфузия 49,5±4,0 (р1=0,0002) 19,0±1,1 (р2=0,0003)

СТАР + Ишемия-реперфузия 43,9±4,2 (р1=0,006) 45,2±3,2 (р3=0,0003)

Примечание: нормоксия - период нормоксической

перфузии изолированных сердец. Ишемия-реперфузия - группа крыс с моделированием глобальной 45-минутной ишемии и 30-минутной реперфузии изолированных сердец. CTAP - селективный антагонист р-ОР (100 нМ/л). р1 - уровень значимости при сравнении с группой «Неадаптированные, Нормоксия»; р2 - уровень значимости при сравнении с группой «Неадаптированные, Ишемия-реперфузия»; рз - уровень значимости при сравнении с группой «Адаптированные, Ишемия-реперфузия». Количество особей (n) в каждой группе составило 12

Исходные значения давления, развиваемого левым желудочком (ДРЛЖ), не различались у неадаптированных и адаптированных к гипоксии животных. Моделирование глобальной ишемии приводило к остановке сердца и прекращению сердечных сокращений. После возобновления перфузии сократительная активность изолированного сердца постепенно восстанавливалась. У неадаптированных крыс ДРЛЖ на 5-й минуте реперфузии составляло 12,3% от предишемического значения, на 15-й минуте - 19,7%, а на 30-й минуте - 20,2% от исходного значения (табл. 2). У адаптированных к ХННГ особей ДРЛЖ на 5-й минуте ре-перфузии восстанавливалось до 17,7%, на 15-й минуте - до 37,6% и на 30-й минуте - до 64,2% от предишемического значения (табл. 2). Это указывает на то, что адаптация к хронической гипоксии оказывает инотропное действие, способствуя лучшему реперфузионному восстановлению силы сокращения изолированного

ВЕСТНИК НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ - 2017 - Т. 24, № 3 - С. 7-11 JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 3 - P. 7-11

сердца у крыс. Использование пептида СТАР в указанной концентрации у неадаптированных крыс не влияло на реперфузионное восстановление ДРЛЖ (табл. 2). У адаптированных к ХННГ животных селективная блокада р-ОР устраняла защитный эффект гипоксии - реперфу-зионный значения ДРЛЖ были значительно ниже, чем в группе сравнения. Следовательно инотропный эффект адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии реализуется при участии кардиальных р-опиоидных рецепторов.

Таблица 2

Давление, развиваемое левым желудочком (мм рт. ст.), у неадаптированных и адаптированных крыс (М±БЕМ)

Примечание: р\ - уровень значимости при сравнении с группой «Неадаптированные, Ишемия-реперфузия»; р2 - уровень значимости при сравнении с группой «Адаптированные, Ишемия-реперфузия». Количество особей в каждой группе составило 12

Показатель конечного диастолического давления (КДД) характеризует степень реперфузи-онной контрактуры, то есть чем выше значения КДД во время реперфузии, тем хуже восстанавливается диастолическая функция миокарда. У неадаптированных крыс на 30-й минуте ре-перфузии КДД достигало 372% от исходного значения, в то время как у адаптированных к хронической гипоксии особей данный показатель поднимался лишь до 160% от начального. Эти данные указывают на способность адаптации к ХННГ предупреждать развитие реперфу-зионной контрактуры миокарда, тем самым улучшая восстановление диастолической

функции изолированного сердца после ишемии и реперфузии. Перфузия изолированных сердец неадаптированных крыс раствором пептида СТАР не влияла на постишемические значения КДД. Однако у адаптированных к ХННГ крыс селективная блокада кардиальных р-ОР пептидом СТАР устраняла защитное действие гипоксии - реперфузионные значения КДД достигали 296% от исходных.

В совокупности эти данные подтверждают, что адаптация к хронической непрерывной нормобарической гипоксии улучшает пости-шемическое восстановление силы сокращений изолированного сердца, а также уменьшает развитие реперфузионной контрактуры миокарда. В реализации защитного инотропного действия адаптации к ХННГ принимают участие кардиальные р-опиоидные рецепторы.

Проведенное исследование продемонстрировало, что моделирование глобальной 45-минутной ишемии и 30-минутной реперфузии на изолированном сердце вызывает некротическую гибель кардиомиоцитов с последующим высвобождением внутриклеточного фермента креатинфосфокиназы в перфузионный раствор. Адаптация к ХННГ в значительной мере уменьшает постишемический некроз миокарда. При этом, антинекротический эффект адаптации к ХННГ реализуется с участием кар-диальных р-опиоидных рецепторов. Воздействие ишемии и реперфузии на изолированное сердце у неадаптированных крыс также приводит к значительному ухудшению сократительной активности миокарда. Предварительная адаптация животных к хронической гипоксии улучшает постишемическое восстановление силы сокращений и снижает выраженность ре-перфузионной контрактуры миокарда. Такое защитное инотропное действие ХННГ также реализуется при участии кардиальных р-опиоидных рецепторов. О кардиопротектор-ном действии адаптации к хронической нор-мобарической гипоксии впервые сообщалось в работе M. Tajima и соавт. [7] и в дальнейшем было продемонстрировано на модели ишемии-реперфузии изолированного сердца кролика [3]. Полученные нами результаты согласуются с данными об участии р-опиоидных рецепторов в способности адаптации к хронической непрерывной нормобарической гипоксии ограничивать размер инфаркта и уменьшать гибель кардиомиоцитов, подвергавшихся действию

Период Ишемия-реперфузия СТАР + Ишемия-реперфузия

Неадаптированные

Нормоксия 79,8±5,1 71,3±2,3

Реперфузия (5 мин) 9,8±0,9 6,5±2,6

Реперфузия (15 мин) 15,7±1,9 13,3±3,8

Реперфузия (30 мин) 16,1±1,7 16,4±1,2

Адаптированные

Нормоксия 77,6±6,4 79,3±1,8

Реперфузия (5 мин) 13,7±1,9 8,2±1,0 (рг=0,02)

Реперфузия (15 мин) 29,2±5,1 (рг=0,002) 14,3±0,9 (рг=0,0012)

Реперфузия (30 мин) 49,8±6,3 (рг=0,0001) 16,2±0,9 (рг=0,0002)

JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2017 - V. 24, № 3 - P. 7-11

аноксии-реоксигенации [2,6]. Выводы:

1. Адаптация к хронической непрерывной нормобарической гипоксии уменьшает пости-шемический некроз кардиомиоцитов.

2. При адаптация к хронической непрерывной нормобарической гипоксии улучшает-

Литература

1. Капелько В.И., Новикова Н.А. Связь диастоли-ческой упругости сердца с его приспособлением к нагрузкам // Физиол. журн. СССР. 1988. № 7. С. 970-977.

2. Нарыжная Н.В., Маслов Л.Н., Цепокина А.В., Хуторная М.В., Кутихин А.Г., Нам И.Ф., Жанг И., Пей Ж.-М. Значение опиоидных рецепторов в ци-топротекторном действии хронической гипоксии при аноксии-реоксигенации кардиомиоцитов // Росс. физиол. жур. им. И. М. Сеченова. 2015. Т. 102, № 6. С. 688-697.

3. Fitzpatrick C.M., Shi Y., Hutchins W.C., Su J., Gross G.J., Ostadal B., Tweddell J.S., Baker J.E. Cardioprotection in chronically hypoxic rabbits persists on exposure to normoxia: role of NOS and K(ATP) channels // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005. Vol. 288, № 1. P. H62-H68.

4. Hill-Pryor C., Lindsey D., Lapanowski K., Dunbar J.C. The cardiovascular responses to mu opioid agonist and antagonist in conscious normal and obese rats // Peptides. 2006. Vol. 27, № 6. P. 1520-1526.

5. Maslov L.N., Naryzhnaya N.V., Prokudina E.S., Kolar F., Gorbunov A.S., Zhang Y., Wang H., Tsibulni-kov S.Yu., Portnichenko A.G., Lasukova T.V., Lishma-nov Y.B. Preserved cardiac mitochondrial function and reduced ischemia/reperfusion injury afforded by chronic continuous hypoxia: Role of opioid receptors // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2015. Vol. 42, № 5. P. 496-501.

6. Maslov L.N., Naryzhnaya N.V., Tsibulnikov S.Yu., Kolar F., Zhang Y., Wang H., Gusakova A.M., Lishma-nov Y.B. Role of endogenous opioid peptides in the infarct size-limiting effect of adaptation to chronic continuous hypoxia // Life Sci. 2013. Vol. 93, № 9-11. P. 373-379.

7. Tajima M., Katajose D., Bessho M., Isoyama S. Acute ischemic preconditioning and chronic hypoxia independently increase myocardial tolerance to ischemia // Cardiovasc. Res. 1994. Vol. 28, № 3. P. 312-319.

ся реперфузионное восстановление сократительной активности миокарда.

3. Антинекротический и инотропный эффекты хронической непрерывной нормобари-ческой гипоксии реализуются при участии кардиальных р-опиоидных рецепторов.

References

Kapel'ko VI, Novikova NA. Svyaz' diastolicheskoy uprugosti serdtsa s ego prisposobleniem k nagruzkam [Relationship between diastolic elasticity of the heart and its adaptation to stresses]. Fiziol. zhurn. SSSR. 1988;7:970-7. Russian.

Naryzhnaya NV, Maslov LN, Tsepokina AV, Khutor-naya MV, Kutikhin AG, Nam IF, Zhang I, Pey Zh-M. Znachenie opioidnykh retseptorov v tsitoprotektor-nom deystvii khronicheskoy gipoksii pri anoksii-reoksigenatsii kardiomiotsitov [The importance of opioid receptors in the cytoprotective action of chronic hypoxia in the anoxia-reoxygenation of car-diomyocytes]. Ross. fiziol. zhur. im. I.M. Sechenova. 2015;102(6):688-97. Russian.

Fitzpatrick CM, Shi Y, Hutchins WC, Su J, Gross GJ, Ostadal B, Tweddell JS, Baker JE. Cardioprotection in chronically hypoxic rabbits persists on exposure to normoxia: role of NOS and K(ATP) channels. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005;288(1):H62-8.

Hill-Pryor C, Lindsey D, Lapanowski K, Dunbar JC. The cardiovascular responses to mu opioid agonist and antagonist in conscious normal and obese ratsю Peptides. 2006;27(6):1520-6.

Maslov LN, Naryzhnaya NV, Prokudina ES, Kolar F, Gorbunov AS, Zhang Y, Wang H, Tsibulnikov SYu, Portnichenko AG, Lasukova TV, Lishmanov YB. Preserved cardiac mitochondrial function and reduced ischemia/reperfusion injury afforded by chronic continuous hypoxia: Role of opioid receptors. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2015;42(5):496-501.

Maslov LN, Naryzhnaya NV, Tsibulnikov SYu, Kolar F, Zhang Y, Wang H, Gusakova AM, Lishmanov YB. Role of endogenous opioid peptides in the infarct size-limiting effect of adaptation to chronic continuous hypoxia. Life Sci. 2013;93(9-11):373-9.

Tajima M, Katajose D, Bessho M, Isoyama S. Acute ischemic preconditioning and chronic hypoxia independently increase myocardial tolerance to ischemia. Cardiovasc. Res. 1994;28(3):312-9.