CC BY
44
селективную среду, содержащую 50 — 60 мг/л канамицина, где в течение 2 — 4 недель у них образовывались зачатки корешков, в случае если трансформация прошла успешно.
Устойчивость к антибиотику определяли по способности растений к корнеобразованию и дальнейшему росту, а также отсутствию хлороза. После того как у эксплантов образовывались корешки, растения пересаживались с селективной среды в воду на одни сутки, а затем в сосуды с влажной фильтровальной бумагой, где они находились до тех пор, пока у них не образовывалась разветвленная корневая система, обычно этот процесс занимал от 2 до 4 недель.
После того, как растения образовали хорошо разветвленную корневую систему, их пересаживали в сосуды с влажным стерильным песком. В этих сосудах растения подвергались адаптации к внешним условиям, в особенности к воздействию более сухой атмосферы. Затем растения пересаживали в почву. Образовавшиеся плоды в недозрелом и зрелом состояниях собирали и помещали на хранение в холодильную камеру с температурой воздуха —20 °С.
Успешность инсерции целевого гена в ядерный геном томата выявляли с помощью ПЦР анализа листьев и плодов растений, которые прошли селекцию на канамицине. Наличие основного антигенного белка гепатита В в тканях трансформированных растений выявлялось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). После положительного ИФА, в целях избежания случайной ошибки, а также для подтверждения эффективности тест-системы, проводили подтверждающий ИФА.
Полученные результаты позволили заключить, что данный метод генетической трансформации вполне пригоден для растений томата. Эффективность трансформации составила 2,3 %. Результаты селекции на среде с канамицином подтвердили экспрессию гена npt II в трансгенных растениях. Была подобрана система адаптации растений, прошедших селекцию, к условиям внешней среды. В итоге были получены вполне здоровые и жизнеспособные трансгенные растения, обладающие нормальным плодоношением, фенотипически не отличающиеся от контрольных не трансформированных растений. С помощью ПЦР и иммуноферментного анализов установлена интеграция и экспрессия целевого гена preS2-S-HDEL в листьях и плодах трансформированных растений поколения Т0. Получены также растения поколения Т в листьях и плодах которых с помощью прямого и подтверждающего иммуноферментного анализа обнаружено значительное количество основного антигенного белка гепатита В HBsAg, что свидетельствует об успешной экспрессии целевого гена.
Полученные результаты открывают возможность использование в дальнейшем плодов растений томата трансгенных по гену preS2-S-HDEL, в предклинических и клинических испытаниях в качестве кандидатной съедобной вакцины против гепатита В.
Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ № 2176р.
ЛИТЕРАТУРА
1. Амосов А.Д. Гепатит В / А.Д. Амосов. - Новосибирск: Изд-во «Вектор-Бест», 2006. — 128 с.
2. Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen / Y. Thanavala, Y-F. Yang, P. Lyons et al. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1995. - Vol. 92, N 8. - P. 3358-3361.
3. Jilg W. Novel hepatitis B vaccines / W. Jilg // Vaccine. - 1998. - Vol. 16. - P. 65-68.
4. Oral immunogenicity of potato-derived HBsAg middle protein in BALB/c mice / Y.H. Joung, J.W. Youm, J.H. Jeon et al. // Vaccine. - 2007. - Vol. 25, N 3. - P. 577-584.
5. Purcell R.H. Hepatitis Viruses: Changing Patterns of Human Disease / R.H. Purcell // PNAS. - 1994. - Vol. 91. - P. 2401 -2406.
И.А. Теркина1, Т. Мимура2
УЧАСТИЕ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА В МОБИЛИЗАЦИИ ФОСФАТОВ В ОЗЕРЕ БИВА(ЯПОНИЯ)
1 Лимнологический институт СО РАН (Иркутск) 2 Университет г. Кобе (Кобе, Япония)
Озеро Бива - это древнее и самое большое пресноводное озеро в Японии с площадью 670 км2 и максимальной глубиной 104 м. Озеро состоит из двух бассейнов: северного (глубоководного) и южного (мелководного). В начале XX века северный бассейн был олиготрофным. В 60-х годах прошлого века над озером нависла серьезная экологическая угроза, связанная с интенсивным эвтрофированием водоема. Результатом загрязнения явилось ускоренное повышение биопродуктивности водоема в результате накопления в воде биогенных веществ. Это могло привести к нехватке кислорода в воде, заморам, гибели флоры и фауны. Японцы приняли самые решительные меры по спасению одного из древнейших озер планеты и на сегодняшний день трофический статус озера - мезотрофное. В процессе эвтрофирования водоемов особая роль принадлежит фосфору - одному из важнейших биогенных элементов, необходи-
мых для жизнедеятельности организмов. Фосфор является одним из главных питательных компонентов, который ограничивает и контролирует рост водных организмов и может усваиваться ими только в виде растворимых неорганических соединений. Основная часть запасов фосфора в водной экосистеме находится в форме органических соединений (фосфорные эфиры, нуклеиновые кислоты, инозитфосфаты и фосфолипиды) трудно доступных для усвоения организмами. Как показывают химический анализ воды озера и опыты с фитопланктоном, содержание растворимых соединений фосфора в нем лимитировано. Ограниченное содержание фосфора в воде достигается благодаря тому, что молекулы растворимого фосфата быстро абсорбируются водными организмами или превращаются в нерастворимые соединения, опускающееся на дно, где они захоранивается в донных осадках и самостоятельно не высвобождается (Tezuka, 1986). Микроорганизмы являются главными участниками процесса иммобилизации фосфора из органических и неорганических соединений. С помощью набора ферментов, таких как щелочные и кислые фосфатазы, фосфолипазы, нуклеазы и другие, фосфор вновь попадает в биологический круговорот веществ. Щелочная фосфатаза является общеизвестным маркером недостатка растворимого фосфата в окружающей среде. Продуцировать щелочную фосфатазу способны почти все живые организмы от водорослей, бактерий и простейших до высших растений и животных (^гс^, 1987). Иногда очень трудно оценить роль микробного сообщества в продукции этого фермента и в целом в процессах минерализации и трансформации соединений фосфора.
Целью этой работы было исследовать и проанализировать вклад микробного сообщества, обитающего в воде, в донных осадках и на поверхности водного растения Едепа densa в озере Бива, в трансформацию фосфор содержащих соединений и пополнение запасов растворимого фосфора в этом водоеме.
Отбор проб проводили с сентября 2005 по май 2006 гг. ежемесячно. Были исследованы: 1) общая численность бактерий (ОЧБ), численность и сезонная динамика гетеротрофных бактерий ГБ, бактерий, растворяющих фосфат кальция (ФРБ), бактерий, мобилизующих фитиновую кислоту (ФМБФ) и лецитин (ФМБЛ) в глубоководной (вода, осадки) и мелководной (вода, осадки, растения) частей озера; 2) абиотические параметры (температура, хлорофилл «а», концентрация растворимого неорганического фосфата (РНФ), растворимого органического фосфата (РОФ) и общего фосфата (ОФ); 3) кинетические параметры щелочной фосфатазы микробного сообщества воды и донных осадков озера.
Обнаружено, что культивируемое микробное сообщество, обитающее в воде, донных осадках и на поверхности растений, принимают активное участие в превращении органических соединений фосфора и нерастворимых солей фосфорной кислоты. В воде мелководной части озера ОЧБ варьировало от 1,3 х 106 до 6,3 х 106 кл./мл. Фосфат растворяющие бактерии постоянно присутствовали в воде, в донных осадках и на поверхности растений. ФМБФ и ФМБЛ бактерии также были постоянным компонентом микробного сообщества растений. С ноября по апрель численность всех исследуемых культивируемых групп бактерий в воде была минимальная (ГБ — 100 — 200 КОЕ/мл, ФМБФ и ФМБЛ — 60 — 80 КОЕ/мл). На поверхности Е. densa в определенные периоды она резко возрастала (ГБ — > 3 х 105 КОЕ/г, ФМБФ и ФМБЛ — > 1,6 х 105 КОЕ/г). Вероятно, это связано с разными стадиями развития растительного сообщества Е. densa. Пока растение активно фотосинтезирует, в воде численность бактерий максимальная. В донных осадках численность разных групп бактерий составляет от 1,4 до 6,7 х 104 КОЕ/г. Когда растительное сообщество отмирает, подвергается процессам деструкции, в воде численность разных групп уменьшается, а в осадках и в старых останках растений — увеличивается на порядок. В целом, поглощение литоральной растительностью фосфора является способом накопления этого элемента в прибрежных участках эпилимниона. Как только рост растений заканчивается и начинается разложение отмерших листьев и стеблей, процесс идет в обратную сторону. Однако в содержании неорганического фосфата в воде не наблюдалось резких колебаний и составило 0,58 — 1,7 мг/л. Это можно объяснить тем, что Е. densa растет в комплексе с другими высшими растениями. В результате, фосфат, образующийся при разложении Е. densa, поглощается другой активно растущей в это время растительностью.
В глубоководной части озера ОЧБ в поверхностном слое постепенно увеличивалось с ноября по май, составляя от 1,13 до 5,39 х 106 кл./мл. На глубине 40 м (середина) и у дна (70 м) ОЧБ возрастало с сентября по март, достигая 3,9 — 4,5 х 106 кл./мл), а затем снижалось, составляя в мае 3,3 — 3,8 х 106 кл./ мл. В период стагнации (сентябрь — октябрь) распределение всех групп бактерий было одинаковым: максимум в эпилимнионе до 30 м (температурный скачок), а затем равномерное снижение до дна. В ноябре и декабре наблюдали максимум цветения фитопланктона на глубине 10 — 30 м, а в декабре максимум численности бактерий был обнаружен в зоне температурного скачка (30 — 50 м), где, происходило скопление отмершего фитопланктона. В январе (период полной циркуляции) наблюдали равномерное распределение хлорофилла «а» (1,5 — 1,6 мг/л), общего фосфора (1,8 — 2 мг/л), неорганического и органического фосфата (0,4 — 0,8 и 1 — 1,4 мг/л соответственно) от поверхности до дна. Численность разных групп бактерий составляла: ГБ — 10 — 25 КОЕ/мл, ФМБФ, ФМБЛ, ФРБ — 1—4 КОЕ/мл. С января по май количество ФРБ бактерий было минимальным или они вообще отсутствовали. В донных осадках численность всех групп бактерий повышалась с сентября (2 — 4 х 104 КОЕ/г), достигая максимума в марте (3 — 7 х 105 КОЕ/г), а затем вновь снижалась.
Исследование фосфатазной активности микробного сообщества воды, донных осадков и растений также указывают на активное участие бактерий в трансформации соединений фосфора.
Следовательно, микробное сообщество озера Бива принимает непосредственное участие в процессах минерализации органических соединений фосфора и его иммобилизации из донных осадков и из остатков растительности, тем самым, пополняя запасы растворимого фосфора в воде этого водоема.
Работа поддержана грантом Obuchi-Fellowship Японо-Российского Центра Молодежных Обменов (^ЕХ).
К.А. Тирских, М.Б. Черепанова
влияние плазмидных и бесплазмидных вариантов yersinia enterocolitica на формирование устойчивости к возбудителю чумы в эксперименте
ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока
Роспотребнадзора»(Иркутск)
Yersinia pestis и Yersinia enterocolitica относятся к роду Yersinia и являются патогенами как для людей, так и для животных. Данные о циркуляции патогенных Y. enterocolitica в очагах чумы весьма незначительны и в литературе практически не освещены, поэтому изучение влияние возбудителя кишечного иерсиниоза на эпизоотический процесс при чуме представляет большое теоретическое и практическое значение.
Ранее было показано, что высоковосприимчивая и высокочувствительная к чумному микробу монгольская пищуха в 0,35 % случаев выживает после встречи с чумным микробом (Klimov V.T. et al., 2003). Одним из механизмов этого явления может быть совместная циркуляция близкородственных иерсиний с разными путями передачи возбудителя инфекции: трансмиссивный путь с помощью блох у Y. pestis и фекально-оральный механизм передачи через объекты окружающей среды (почва, растения), загрязненные выделениями грызунов, у Y. enterocolitica.
Оба микроба имеют родоспецифическую плазмиду (pYV у Y. enterocolitica и pCad - Y. pestis), известную как плазмида вирулентности иерсиний, функция которой заключается в нейтрализации фагоцитарных клеток, участвующих в иммунном ответе макроорганизма. Можно предположить, что слабопатогенные pYV( + ) Y. enterocolitica О:3 и О:9 при попадании в организм монгольской пищухи вызывают перекрестный иммунитет, который нейтрализует действие аналогичной плазмиды pCad Y. pestis.
Цель исследования - изучение влияния Y. enterocolitica на формирование устойчивости к возбудителю чумы в эксперименте.
материалы и методы
В работе использовали следующие штаммы: Y. enterocolitica, выделенный от монгольской пищухи, основного носителя чумы в Горно-алтайском природном очаге, и Y. pestis И-3516, выделенный от плоскочерепной полевки в том же природном очаге (получен из коллекции Иркутского противочумного института).
Культурально-морфологические, биохимические и серологические свойства были изучены согласно рекомендациям по лабораторной диагностике иерсиниозов (Инструкция ..., 1990). Наличие плазмиды определяли методом T. Kiesser (1984). Наличие гена ail, отвечающего за адгезивные и инвазивные свойства Y.enterocolitica определяли в ПЦР с использованием специфических праймеров (Bhaduri S. et al., 1997).
В эксперименте были использованы 2 группы животных - беспородные белые мыши массой 18-20 г (по 20 мышей в группе). Первую группу интрагастрально заражали по 0,5 мл суспензией, содержащей 109 м.кл. Y. enterocolitica, имеющей плазмиду pYV+. Вторая группа была инфицирована бесплазмидным вариантом Y.enterocolitica (pYV-) в той же дозе. Через 21 день всем животным подкожно вводили по 0,5 мл суспензии Y.pestis И-3516, содержащей 103, 104, 105, 106 м.кл. (по 5 животных на 1 дозу). В качестве контрольной группы использовали белых мышей, зараженных теми же дозами Y. pestis И-3516. Срок наблюдения составил 21 день. Материал от павших и хлороформированных животных (место подкожного введения Y.pestis, печень, селезенка, кишечник) исследовали методом прямого посева на чашки с казеино-дрожжевым агаром.
Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью статистического пакета «Statistica for Windows 6.0» для персонального компьютера. LD50 вычисляли по методу Кербера.
