Научная статья на тему 'Влияние ферментов на формирование бактериальных биопленок'

Влияние ферментов на формирование бактериальных биопленок Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
2083
243
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БИОПЛЕНКА / BIOFILM / YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS / BACILLUS SUBTILIS / ДНКАЗА I / α-D-ГАЛАКТОЗИДАЗА / α-D-GALACTOSIDASE / ЭНДО-1 / ENDO-1 / 3-β-D-ГЛЮКАНАЗА / 3-β-D-GLUCANASE / DN-ASE I

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Терентьева Наталья Александровна, Тимченко Нелли Федоровна, Балабанова Лариса Анатольевна, Голотин Василий Анатольевич, Белик Алексей Анатольевич

До конца прошлого столетия микробиология развивалась главным образом на основе исследований чистых культур микроорганизмов. Именно благодаря исследованиям чистых культур сформировалось понятие о бактериях как об одноклеточных микроорганизмах. В настоящее время в микробиологии является признанным факт, что большинство микроорганизмов в естественных и лабораторных условиях существуют в виде биопленок. Многие острые и хронические инфекции обусловлены способностью бактерий к образованию биопленок, что обеспечивает их повышенной устойчивостью к антибактериальным средствам. Для ингибирования образования или разрушения бактериальной биопленки могут быть использованы низкомолекулярные вещества или ферменты. Целью работы было изучение влияния гидролитических ферментов на формирование и разрушение биопленки Yersinia pseudotuberculosis и Bacillus subtilis. Показана возможность исследования действия ферментов на модели биопленки, формируемой бактериями. Установлено, что ДНКаза I ингибировала образование биопленки Y. pseudotuberculosis и B. subtilis, частично разрушая зрелую биопленку. Напротив, α-D-Галактозидаза морских бактерий Pseudoalteromonas sp. стимулировала рост биопленок Y. pseudotuberculosis и B. subtilis, а эндо-1,3-β-D-глюканаза из морской бактерии Formosa algae ингибировала формирование биопленки Y. pseudotuberculosis, но не разрушала уже сформировавшуюся биопленку.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Терентьева Наталья Александровна, Тимченко Нелли Федоровна, Балабанова Лариса Анатольевна, Голотин Василий Анатольевич, Белик Алексей Анатольевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The influence of enzymes on the formation of bacterial biofilms

Until the end of the last century, microbiology developed mainly based on studies of pure cultures of microorganisms. It is thanks to the research of pure cultures of bacteria formed a concept of how to single-celled microorganisms. Currently in microbiology is a recognized fact that the majority of microorganisms in natural and laboratory conditions exist in the form of biofilms. Many acute and chronic infections caused by bacteria's ability to form biofilms, which ensures their increased resistance to antibacterial agents. For inhibiting the formation or destruction of bacterial biofilms can be used low-molecular substances or enzymes. The purpose of the study was the effect of hydrolytic enzymes on the formation and destruction of biofilm Yersinia pseudotuberculosis and Bacillus subtilis. There was shown the possibility of studies on the action of enzymes on the model of biofilm formed by bacteria. It is established that DNase I inhibited the formation of biofilm by the bacterial strains of Y. pseudotuberculosis and B. subtilis, partially destroying the matural biofilm. In contrast, α-D-Galactosidase from the marine bacteria Pseudoalteromonas sрp. was found to stimulate the growth of Y. pseudotuberculosis and B. subtilis biofilms, whereas endo-1,3-β-D-glucanase from the marine bacterium Formosa algae inhibited the formation of Y. pseudotuberculosis biofilms, but did not destroy already formed biofilm.

Текст научной работы на тему «Влияние ферментов на формирование бактериальных биопленок»

14. Lyte M., Freestone P.P., Neal C.P., Olson B.A., Haigh R.D., Bayston R., Williams P.H. Stimulation

of Staphylococcus epidermidis growth and biofilm formation by catecholamine inotropes. Lancet, 2003. 361: 130-5

15. Freestone P.P., Haigh R.D., Lyte M. Blockade of catecholamine-induced growth by adrenergic and dopaminergic receptor antagonists in Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica and Yersinia enterocolitica. BMC Microbiol. 2007; 269(2): 221-8.

E.K. Psareva, B.G. Andryukov, N.F. Timchenko

THE CHARACTERISTIC OF INFLUENCE OF BIOGENIC AMINES ON GROWTH YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

Federal State Budget Scientific Institution «Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, G. P. Somova», Vladivostok, Russia.

The class of biogenic amine (BA) - a group of compounds includes neurotransmitters catecholamines histohormones, pheromones, which play an important role in neuroendocrine system of humans and animals. Attracted the attention of many researchers on the impact of BA microorganisms. BA ability to stimulate the growth of bacteria was first demonstrated in the late twentieth century. Subsequent studies have shown that catecholamines cause structural effects in microbial systems, in particular, modulate the aggregation of cells into colonies affect the mobility and virulence of microorganisms, as well as on the rate of microbial biofilm formation. Of particular interest is the impact of asthma on the growth of Yersinia pseudotuberculosis - pathogen pseudotuberculosis, which occupies a leading position among zoonotic natural focal infections of bacterial etiology. The aim of this work was to study the action of neurotransmitters dopamine and serotonin BA on the growth of Y. pseudotuberculosis. Revealed a dose-dependent effect of these BA on the growth and reproduction of Yersinia. At higher concentrations detected more pronounced effect of catecholamine hypothalamic neurohormone dopamine (80% at 0.1 M solution), as compared to serotonin (25% of 0.01 M solution).

Keywords: Yersinia pseudotuberculosis, biogenic amines (BA), dopamine, serotonin.

Citation: Psareva E.K., Andryukov B.G., Timchenko N.F. The characteristic of influence of biogenic amines on growth Yersiniapseudotubermlosis. Health. Medical ecology. Science. 2015; 2(60): 83-86. URL: https://yadi.sk/i/98h4QgX_fPs6s

Сведения об авторах

Псарева Екатерина Константиновна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, телефоны: 8(423)-246-78-14, 89046281858; 690078, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1; e-mail: ekaterinapsareva@gmail.com;

Андрюков Борис Георгиевич - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, телефоны: 8(423)-246-78-14, 89242304647; 690078, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1; e-mail: andrukov_bg@mail.ru;

Тимченко Нэлли Федоровна - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова, тел./факс: 8(423) 244-14-38; 690078, г. Владивосток, ул. Сельская, д. 1; e-mail: ntimch@mail.ru.

© Коллектив авторов, 2015 г. УДК 615.468:604.4-7

Н.А. Терентьева12, Н.Ф. Тимченко2, Л.А. Балабанова13, В.А Голотин1, А.А. Белик13, И.Ю. Бакунина1, Л.В. Диденко4, В.А. Рассказов1

влияние ферментов на формирование бактериальных биопленок

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток;

2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» г. Владивосток;

3 Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток;

4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва

До конца прошлого столетия микробиология развивалась главным образом на основе исследований чистых культур микроорганизмов. Именно благодаря исследованиям чистых культур сформировалось

понятие о бактериях как об одноклеточных микроорганизмах. В настоящее время в микробиологии является признанным факт, что большинство микроорганизмов в естественных и лабораторных условиях существуют в виде биопленок. Многие острые и хронические инфекции обусловлены способностью бактерий к образованию биопленок, что обеспечивает их повышенной устойчивостью к антибактериальным средствам. Для ингибирования образования или разрушения бактериальной биопленки могут быть использованы низкомолекулярные вещества или ферменты. Целью работы было изучение влияния гидролитических ферментов на формирование и разрушение биопленки Yersinia pseudotuberculosis и Bacillus subtilis. Показана возможность исследования действия ферментов на модели биопленки, формируемой бактериями. Установлено, что ДНКаза I ингибировала образование биопленки Y pseudotuberculosis и B. subtilis, частично разрушая зрелую биопленку. Напротив, a-D-Галактозидаза морских бактерий Pseudoalteromonas sp. стимулировала рост биопленок Y pseudotuberculosis и B. subtilis, а эндо-1,3-Р-0-глюканаза из морской бактерии Formosa algae ингибировала формирование биопленки Y. pseudotuberculosis, но не разрушала уже сформировавшуюся биопленку.

Ключевые слова: биопленка, Yersinia pseudotuberculosis, Bacillus subtilis, ДНКаза I, a-D-галактозидаза, эндо-1,3-р-0-глюканаза.

Цитировать: Терентьева Н.А., Тимченко Н.Ф., Балабанова Л.А. и соавт. Влияние ферментов на формирование бактериальных биопленок // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015. №2(60). С. 86-93. URL: https://yadi.sk/i/ M472oC3hfPs7A

Введение. Большинство видов бактерий существуют в природе не в виде свободно живущих клеток, а в виде специфически организованных биопленок (biofilms). При этом сами бактерии составляют лишь часть массы биопленки, остальная часть - это внеклеточный матрикс. Бактериальная биоплёнка -сообщество одного или нескольких видов бактерий, прикрепленных к поверхности или друг к другу, и заключенных в матрикс из синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ [6, 13]. Бактерии в биопленке могут «общаться» между собой посредством секреторных интермедиаторов, которые служат основой их «социального» поведения или Quorum sensing. В состав внеклеточного матрикса биопленки входят экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества [4].

Биопленка защищает бактерии от неблагоприятных факторов внешней среды и от факторов специфической и неспецифической защиты иммунной системы хозяина.

Многие острые и хронические инфекции обусловлены бактериями, растущими в виде биопленок. Устойчивость бактерий в биопленке к антибиотикам в 1000 раз больше, чем у планктонных форм [6, 13]. Известно, что в основе повышенной выживаемости лежат как свойства микроорганизмов, так и внеклеточного матрикса. Матрикс биопленки может связывать или не пропускать, и/или инактивировать антибиотики [12-14].

В настоящей работе в качестве модельных микроорганизмов использованы широко распространенные в окружающей среде микроорганизмы Yersinia pseudotuberculosis. Возбудитель псевдотуберкулеза человека Y pseudotuberculosis изолирован из почвы, воды и растительных субстратов [5]. Эти микроорганизмы способны образовывать биопленку, которая защищает их от неблагоприятных экологических

условий [3]. Для ингибирования образования или разрушения бактериальной биопленки могут быть использованы низкомолекулярные вещества или ферменты.

Цель работы: изучение влияния гидролитических ферментов на формирование и разрушение биопленки Y pseudotuberculosis и B. subtilis.

Материалы и методы. В работе использовали штаммы Y pseudotuberculosis из коллекции ФГБНУ НИИЭМ им. Сомова, изолированные от больного (512 рУЫ82МД и pYV48]^, 0I серовар), из внешней среды (696 pVM82МД, pYV48МД, 0I серовар) и штамм 2517 (Институт Пастера, Франция), несущий плазмиду вирулентности молекулярной массой 40 МД ^YV+), и утративший ее (pYV-), 03 серовар. Штамм B. subtilis из коллекции ФГБУН ТИБОХ ДВО РАН.

Проверена способность исследуемых штаммов Y. pseudotuberculosis формировать биопленку при температурах 37°С и 20-22°С в жидкой среде (питательный бульон) в течение 24-48 ч. По истечению этого времени готовили образцы и анализировали их в двулучевом сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company USA) [26].

Количественное определение способности Y. pseudotuberculosis образовывать биопленки проводили в стандартных 96-луночных полистероловых планшетах по методу [29, 30]. Бактерии выращивали в питательном бульоне рН 7,1-7,2 в течение 18-24 ч при температуре 20-22 С. Затем микроорганизмы в дозе 107 мк/мл разносили по 200 мкл в лунки планшета. Для каждого опыта обычно использовали 4-8 дублирующих лунок. Системы инкубировали в течение 4, 7 и 10 суток при температуре 20-22°С. Измеряли количество образовавшейся биопленки и определяли число КОЕ. Для этого среду с клетками удаляли из лунок, промывали их 3-4 раза стерильным 0,85%

раствором NaCl для удаления неприкрепившихся клеток и компонентов среды. В каждую лунку вносили по 200 мкл 0,5% водного раствора кристаллического фиолетового (CV) и инкубировали планшет при комнатной температуре 15 мин. После удаления несвязанного красителя лунки промывали водой 3-4 раза до исчезновения окраски и подсушивали на воздухе в течение нескольких часов или оставляли на ночь. Для количественного определения биопленки в каждую лунку планшета добавляли 200 мкл 96% этанола, содержащего 2% уксусной кислоты (объем/ объем), инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 15 мин для растворения красителя. Количество биопленки оценивали в планшет-ридере по оптической плотности при 600 нм.

Ингибирование образования биопленки тестировали по методу [28]. Исследовали действие на биопленки ДНКазы I (Sigma), а-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas spp. КММ 701 [8], эндо-1,3-р-0-глюканазы морской бактерии Formosa algae [2].

Для исследования воздействия на процесс образования биопленки различные соединения вносили в лунки одновременно с Y. pseudotuberculosis. Инкубировали планшет при 20-22°С, в течение времени, необходимого для развития биопленки. Для выявления разрушения биопленки разные концентрации исследуемых ферментов в буфере добавляли в лунки после формирования биопленки. Затем систему инкубировали дополнительно в течение 1 ч при 37°С или 24 ч при 20-22°С. Дальнейшую обработку лунок планшета и окраску биопленки проводили, как описано выше.

Для определения числа колониеобразую-щих единиц (КОЕ/мл) в исходной культуре Y. pseudotuberculosis готовили серию разведений, затем высевали бактерии в объеме 0,1 мл на дифференциально-диагностическую среду №67 (Г.Д. Серов, 1969). Инкубировали посевы в течение 18-24 ч при 37°С, затем 18-24 ч при 20-22°С и подсчитывали число выросших колоний.

Для определения числа КОЕ Y. pseudotuberculosis в составе биопленки из лунок планшета удаляли среду с неприкрепленными клетками и трижды

' 1Д-

□i

/ 'ч

—■— 1

■ ■>■■ 1

■ □

■-ТТ-- 4-

промывали их стерильным 0.85% раствором NaCl. В каждую лунку вносили по 200 мкл раствора и тщательно ресуспендировали клетки бактерий, прикрепленные ко дну и стенкам лунки. Из полученной взвеси готовили серию разведений и высевали материал по 0,1мл на среду №67. После инкубирования посевов подсчитывали число КОЕ/мл.

Выращивание и количественное определение биопленки B. subtilis проводили аналогично методам, используемым с Y. pseudotuberculosis, за исключением того, что инкубацию проводили в течение 24 ч при 37°С.

Все определения проводили в четырехкратной повтор-ности, результаты обрабатывали статистически [1, 2]. Результаты и их обсуждение Выявлена способность Y. pseudotuberculosis образовывать биопленки как в среде выращивания микроорганизмов (питательный бульон), так и на абиотической поверхности, подобраны условия роста бактерий в лунках полистирольных планшетов, дающие возможность количественного тестирования формируемых биопленок.

Рис. 1. Биопленка Y. pseudotuberculosis, сформировавшаяся в течение 48 ч культивирования бактерий (штамм 2517 pYV-) в питательном бульоне при 37°С. Стрелками показан межклеточный матрикс.

-1—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|—I—|

□ 1Z3tSS7E

Рис. 2. Количество биопленки (А) и число КОЕ (Б) Y. pseudotuberculosis: 1 - 2517 pYV-; 2 - 2517 pYV+; 3 - 512 pYV+; 4 - 696 pYV+

Как видно из представленных результатов, количество образовавшейся биопленки различается у разных штаммов Y pseudotuberculosis (рис. 2А). Наиболее интенсивный рост биопленки был выявлен у штамма 696 pYV+, изолированного из смыва с овощей (свежая капуста). Меньше всего биопленки формировали бактерии штамма 512 pYV+, выделенного от больного псевдотуберкулезом. Коллекционный штамм Y. pseudotuberculosis 2517, несущий плазмиду вирулентности и штамм, утративший ее, занимали промежуточное положение. Увеличение количества биопленки наблюдалось до 7 сут., после чего ее количество стабилизировалось на одном уровне, либо уменьшалось.

Поскольку бактерии в составе биопленки могут представлять собой как активно функционирующие клетки, так и находящиеся в состоянии покоя или не-культивируемые формы, нами было проведено определение числа колониеобразующих единиц в составе биопленки у исследуемых штаммов Y. pseudotuberculosis (рис. 2Б). Максимальное число КОЕ обнаружено при культивировании системы в течение 4 сут., а затем оно снижалось в разной степени у разных штаммов.

Известно, что внеклеточный матрикс состоит из белков, полисахаридов, липидов, гликолипидов, ну-

Данные табл. 1 свидетельствуют о том, что а-галактозидаза, внесенная в систему вместе с бактериями, оказывала стимулирующее действие, увеличивая количество биопленки Y. pseudotuberculosis и B. subtilis. Если количество биопленки B. subtilis увеличилось в присутствии а-галактозидазы в полтора раза, то стимуляция образования биопленки Y. pseudotuberculosis составила для разных штаммов от 4 до 12 раз. На уже сформированную биопленку а-галактозидаза не оказывала влияния.

Мы предполагаем, что а-галактозидаза в природном штамме Pseudoalteromonas spp. КММ 701 может участвовать в процессе формирования биопленки наряду с другими механизмами, поскольку эти бактерии часто оказываются в экстремальных условиях выживания. Либо морские бактерии, обладая а-галактозидазой, занимают определенную нишу в симбиотическом сообществе и помогают выживать другим участникам этого сообщества -бактериям, водорослям, животным. Выяснению ме-

клеиновых кислот и некоторых других компонентов [16, 23]. Одним из подходов к борьбе с биопленками является использование ферментов, специфичных к структурным компонентам биопленки. В литературе имеются сведения о том, что бактериальные биопленки могут разрушаться при обработке разрушающими матрикс ферментами - ДНКазами [28, 32-34], протеазами [9, 11, 18], полисахарид деградирующими ферментами [23, 25].

Поскольку известно, что основную часть внеклеточного матрикса биопленки составляют полисахариды, мы изучили влияние О-гликозидгидролаз морских бактерий, участвующих в трансформации углеводов и углеводсодержащих биополимеров на формирование биопленки модельными микроорганизмами (табл. 1 и 2). В экспериментах был использован рекомбинантный белок а-галактозидазы морской бактерии Pseudoalteromonas sp. штамма КММ 701(а-PsGal) [8]. Имеются данные, что а^-галактозидаза катализирует гидролиз а-галактозидной связи в таких олигосахаридах, как раффиноза, мелибиоза, стахиоза и в таких полисахаридах, как галактоманнаны, а также в гликоконью-гатах, включая гликопротеины и гликолипиды [7, 8].

ханизма действия фермента на формирование структуры биопленки будет способствовать дальнейшее исследование свойств фермента, а именно способности к трансгликозилированию - переносу галак-тозной группы на другие субстраты (олиго- и полисахариды), что является важным на сегодняшний день инструментом в получении новых пищевых и медицинских биодобавок на основе полисахаридов - известных модуляторов и стимуляторов иммунной системы человека.

Другим исследуемым ферментом явилась эндо-1,3-Р-О-глюканаза из морской бактерии F. algae KMM 3553, обитающей на талломах бурой водоросли Fucus evanescens [2]. Эндо-1,3-Р-0-глюканазы широко распространены среди представителей всех царств живой природы от архебактерий до эука-риот. Функции, выполняемые этими ферментами, чрезвычайно разнообразны, так как полисахариды 1,3-*^-глюканы являются одними из важнейших составляющих любых живых клеток и тканей. В

Таблица 1

Влияние а-галактозидазы Pseudoalteromonas spp. КММ 701 на биопленки У pseudotuberculosis и B. subtilis

Штаммы Y. pseudotuberculosis Образование биопленки, % Разрушение биопленки, %

1 мкг/мл а-галактозидазы 2 мкг/мл а-галактозидазы 22°С,1 час 22°С, 24 часа

2517 pYV- 403 ± 28 692 ± 39 0 0

2517 pYV+ 585 ± 41 626 ± 43 0 0

696 pYV+ 828 ± 53 755 ± 51 0 4

512 pYV+ 1209 ± 85 1265 ± 94 0 0

B. subtilis - 159 ± 11 0 2

частности, 1,3-*-0-глюканазы бактерий участвуют в деградации полисахаридов, которые используются бактериями в качестве источника энергии. У грибов эти ферменты осуществляют лизис собственного клеточного матрикса в процессе развития клеток, в растениях они участвуют в клеточной дифференциа-

Как видно из табл. 2, фермент 1,3-Р-глюканаза, внесенный в систему с бактериями, оказывал ин-гибирующее действие на формировании биопленки Y pseudotuberculosis. Процент ингибирования составил у разных штаммов этих микроорганизмов от 10% до 87%. Самыми чувствительными к действию 1,3-Р-глюканазы оказались бактерии штамма 2517, несущего плазмиду вирулентности pYV. На уже сформированную биопленку Y. pseudotuberculosis 1,3-Р-глюканаза не оказывала влияния.

Есть предположение, что механизм ингибирования образования биопленок может быть связан с подавлением экспрессии каких-то компонентов пленкоо-бразования, поскольку 1,3-Р-глюканаза в природной морской бактерии F. algae является поставщиком простых углеводов для катаболизма. Возможно, Y. pseudotuberculosis 2517 pYV+ и 696 pYV+ отключают какие-то механизмы пленкообразования в присутствии 1,3-Р-глюканазы морской бактерии в связи с улучшением питание бактерий, а значит, ухудшений условий окружающей среды не предвидится. Однако имеются сведения о трансгликозилирующей активности данного фермента, способного из полисахарида морской водоросли ламинарана синтезировать трансламинаран - известный полисахарид с антирадиационной активностью. Тем не менее, трансглико-зилирующую активность 1,3-Р-глюканазы штаммы Y. pseudotuberculosis не используют в строительстве полисахаридных компонентов пленки, что косвенно указывает на отсутствии субстратов для фермента в составе пленок. Интересно отметить, что фракция 1,3-Р-глюканазы после элюции с Ni-агарозы давала наибольший ингибирующий эффект, скорее всего, из-за присутствия большой концентрации ЭДТА (50 мМ) (табл. 2).

Экзополисахариды являются одним из основных компонентов матрикса большинства биопленок. Хотя состав этих полимеров обычно колеблется у

ции, в системе защиты растений от патогенных грибов. Эндо-1,3-р^-глюканаза расщепляла Р-(1—>3)-связи в смешанных (1—3); (1—6)-Р-0-глюканах. Глюканы с другими типами связей, такие как пусту-лан, пуллулан, амилопектин и КМ-целлюлоза не ги-дролизовались этим ферментом [24, 35].

разных бактерий, есть полисахариды, продуцируемые несколькими видами бактерий, а некоторые бактерии способны синтезировать несколько видов полисахаридов. Одним из наиболее распространенных полисахаридов матрикса является полимер ß-1,6-N-ацетил^-глюкозамина (PNAG), обнаруженный в разных видах бактерий, в том числе Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staрhylococcus aureus, Yersinia pestis, Actinobacillus spp., Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Bordetella spp. [23]. В ма-триксе биопленки обычно находят целлюлозу, линейный полимер (1-4)^-глюкозы. Целлюлоза является основным компонентом матрикса биопленки некоторых штаммов E. coli и некоторых видов Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, и Pseudomonas, а также Agrobacterium tumefaciens. Среди бактериальных экзополисахаридов встречаются сложные разветвленные полимеры, имеющие в своем составе глюкозу, галактозу, маннозу, рамнозу, маннуро-новую и гулуроновую кислоты [23]. Полисахариды не только помогают бактериям выживать в морской среде, но являются факторами, способствующими проникновению их в организм человека в период сезонных эпидемий [17]. Данных о составе полисахаридов внеклеточного матрикса биопленок Y. pseudotuberculosis в литературе пока нет.

Важнейшим компонентом матрикса является ДНК. Экстраклеточная ДНК играет важную роль в развитии биопленки, обеспечивая структурную стабильность [19, 20] и защиту от антимикробных агентов [27]. В присутствии ДНКазы происходит ряд изменений в количестве, архитектуре, морфологии биопленок, а также в количестве КОЕ различных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Расщепление внеклеточной ДНК приводит к изменению биопленки, что позволяет проникать антибиотикам. Таким образом, добавление ДНКазы усиливает действие антибиотиков, что

Таблица 2

Влияние 1,3-р-гпюканазы F. algae на биопленку Y. pseudotuberculosis

Штаммы Y pseudotuberculosis Образование биоппенки, % Разрушение биоппенки, %

18 мкг/мп ß-глюканазы1 12 мкг/мп ß-глюканазы2 22°С, 1 час 22°С, 24 часа

2517 pYV- 100 ± 6 92 ± 6 0 0

2517 pYV+ 19 ± 2 31 ± 3 0 0

696 pYV+ 13 ± 2 65± 5 0 4

512 pYV+ 90 ± 6 100 ± 5 0 0

Примечание: 1 - фракция р-глюканазы после стадии очистки на №-агарозе; 2 - фракция р-глюканазы после стадии гель-фильтрации

приводит к снижению биомассы биопленки и числу ДНКазы I на образование и разрушение биопленок КОЕ [34]. В табл. 3 приведены данные по действию Y pseudotuberculosis и B. subtilis.

Таблица 3

Влияние ДНКазы I на биопленку У pseudotuberculosis и B. subtilis

Штаммы Y. pseudotuberculosis Образование биопленки, % Разрушение биопленки, %

37°С, 1час 22°С, 24 часа

2517 pYV- 83 ± 6 30 ± 3 -

2517 pYV+ 52 ± 4 21 ± 2 11 ± 1

696 pYV+ 50 ± 3 50 ± 4 49 ± 4

512 pYV+ 71 ± 5 20 ± 2 33 ± 3

B. subtilis 46± 3 59 ± 4 -

Примечание: (-) - исследования не проводились.

Из табл. 3 видно, что количество биопленки, образованной Y pseudotuberculosis штаммами 696 pYV+ и 2517 pYV+ в присутствии ДНКазы I, снижалось вдвое при концентрации фермента 20 мкг/мл и инкубирования системы в течении 4 с. при температуре 20-22°С. У бактерий двух других штаммов Y. pseudotuberculosis (512 pYV+ и 2517-) ингибиро-вание формирования биопленки было менее выражено. Показано, что ДНКаза I в концентрации 20 мкг/мл частично разрушала зрелые биопленки Y. pseudotuberculosis. Процент разрушения варьировал у разных штаммов микроорганизмов от 11% до 50% и зависел также от условий инкубации с ферментом.

Биопленка B. subtilis оказалась также подвержена действию ДНКазы I. Нуклеаза ингибировала формирование биопленки, а также разрушала более половины уже образовавшейся биопленки.

В литературе есть данные о влиянии нуклеаз на формирование и разрушение биопленок как грам-положительных, так и грамотрицательных бактерий, включая B. licheniformis, B. subtilis, E. coli, Micrococcus luteus, разных видов Pseudomonas [28]. Так, ДНКаза I уменьшала образование биопленки Rhodococcus ruber (C208) на ранней стадии формирования на 20-25%, но не оказывала существенного влияния на зрелые биопленки. В то же время, добавление ДНК значительно увеличивало образование биопленки на ранней стадии (на 50-100%) [19].

Формирование биопленки, как правило, включает в себя производство внеклеточного матрикса, который позволяет клеткам взаимодействовать между собой и/или адгезировать к поверхности. Одной из стратегий борьбы с биопленками является деградация этого матрикса. Некоторые виды бактерий, как было показано, секретируют ферменты, специфичные к тем или иным компонентам матрикса [23]. Например, альгинат биопленки мукоидных штаммов Pseudomonas aeruginosa, может разрушаться альги-натлиазой [10]. Внеклеточные протеазы участвуют в разрушении биопленки некоторых штаммов золотистого стафилококка [9]. В Xanthomonas campestris биопленки могут быть диспергированы с помощью

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

фермента эндо-Р-(1,4)-маннаназы [15]. Дисперсин B (Р-гексозаминидаза) гидролизует гликозидные связи PNAG матрикса биопленок ряда бактерий. В его присутствии может полностью ингибироваться образование биопленок штаммов E. coli, а также S. epidermidis, S. aureus, P. fluorescens и Y pestis [21]. Дисперсин В также способствовал отторжению и повышению проницаемости для антибактериальных агентов вновь сформировавшейся биопленки [22, 31].

Внеклеточная ДНКаза (NucB) Bacillus licheniformis ингибировала образование биопленок таких микроорганизмов, как B. licheniformis, B. subtilis, E. coli, Micrococcus luteus и Pseudomonas [28]. Имеются данные о возможности использования нуклеаз морских бактерий для разжижения слизистых биопленок в терапии заболеваний верхних дыхательных путей [32, 33].

Нами было показано влияние ДНК-зы I и двух гликозидаз на формирование биопленок. Так, ДНКаза I оказывала ингибирующее действие на образование биопленки и разрушала зрелую биопленку. Не выявлено существенного влияния гликозидаз на уже сформированную биопленку, однако, обнаружены различия их в действии на образование биопленки. Если 1,3-Р^-глюканаза ингибировала образование биопленки штаммами Y. pseudotuberculosis, то a-D-галактозидаза проявляла стимулирующее действие на биопленки. Механизм такого действия предстоит выяснить. Ранее было установлено, что а-галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas spр. KMM 701 обладает антибактериальным свойством разрушать пленки патогенных микроорганизмов, образующихся на слизистых поверхностях человека. Обработка эпителиальных клеток гортани человека препаратом такого фермента значительно снижала адгезию возбудителя дифтерии С. diphtheriae [7].

Современные представления о биопленках требуют изменения подходов к диагностике и лечению инфекций в самых различных областях медицины и ветеринарии. Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы

первоначальной адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно может сочетаться с собственно бактерицидными агентами. Подобное лечение, действующее на структуру или функции биопленок, может оказаться более эффективным, чем стандартная антибактериальная терапия.

Работа поддержана грантами РФФИ (13-0400806, 15-04-08654) и Научным фондом ДВФУ (14-08-06-10_и).

ЛИТЕРАТУРА

1. Андрюков Б.Г., Тимченко Н.Ф. Базовые методы описательной статистики в микробиологических исследованиях // Профилактическая и клиническая медицина, 2012, №4(45). С.104-7.

2. Андрюков Б.Г., Тимченко Н.Ф. Первичная обработка исходных данных микробиологических исследований // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2013. Т. 53. № 4. С. 5-11.

3. Белик А.А., Захаренко А.М., Кусайкин М.И., Балабанова Л.А., Рассказов В.А.. Особенности каталитической активности рекомбинантной эндо-1,3-ß-D-глюканазы из морской бактерии Formosa algae // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014. № 57. C. 16-17.

4. Видяева Н.А., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю., и др. Изучение способности к образованию биопленок у штаммов Yersinia pestis основного и неосновного подвидов // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2009. №5. С. 13-19.

5. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л, Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. №11. С. 1-12

6. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Бактериальные биоплёнки как естественная форма существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 2011. №33. С. 99-109.

7. Терентьева Н.А., Тимченко Н.Ф., Рассказов В.А. Исследование влияния биологически активных веществ на формирование бактериальных биопленок // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014. Т. 57. № 3. С. 54-55.

8. Balabanova L.A., Bakunina I.Y., Nedashkovskaya

0.1. et al. Molecular Characterization and Therapeutic Potential of a Marine Bacterium Pseudoalteromonas sрp. KMM 701 a-Galactosidase. Mar Biotechnol. 2010; 12: 111-20.

9. Balabanova L.A., Golotin V.A., Bakunina

1.J., Rasskazov V.A. Plasmid 40Gal determining synthesis of a-galactosidase a-PsGal, strain E.coli Rosetta(DE3)/40Gal - producer of chimeric protein

containing amino-acid sequence a-PsGal, and method for its production. Патент RU 2 504 583 C1 03.10.2012.

10. Boles B. R., Horswill A. R. Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms. PLOS Pathogens. 2008;4:e1000052.

11. Boyd A., Chakrabarty A.M. Role of alginate lyase in cell detachment of Pseudomonas aeruginosa. Appl. Environ. Microbiol. 1994; 60: 2355-9.

12. Chaignon P., Sadovskaya I., Ragunah C. et al. Susceptibility of Staphylococcal biofilms to enzymatic treatments depends on their chemical composition. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007; 75(1): 125-32.

13. Chambless J.D., Hunt S.M., Philip S.S. A three-dimensional computer model of four hypothetical mechanisms protecting biofilms from antimicrobials. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72: 2005-13.

14. Costerton, J. W., Stewart P. S., and E. P. Greenberg. Bacterial biofilms:a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284: 1318-22.

15. Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat. Rev. Drug Discov. 2003; 2: 114-22.

16. Dow J.M., Crossman L.K. Findlay Y.Q. et al. Biofilm dispersal in Xanthomonas campestris is controlled by cell-cell signaling and is required for full virulence to plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 10995-1000.

17. Flemming H.C., Neu T. R., Wozniak D. J. The EPS matrix: The House of Biofilm Cells. J. Bacteriology. 2007; 189(22): 7945-7.

18. Fong J.C.N., Syed K.A., Klose K.E., Yildiz F.H. Role of Vibrio polysaccharide (vps) genes in VPS production, biofilm formation and Vibrio cholerae pathogenesis. Microbiology. 2010; 156: 2757-69.

19. Gilan I., Sivan A. Effect of proteases on biofilm formation of the plastic-degrading actinomycete Rhodococcus ruber C208. FEMS Microbiol Lett. 2013; 342(1): 18-23.

20. Gilan I., Sivan A. Extracellular DNA plays an important structural role in the biofilm of the plastic degrading Actinomycete Rhodococcus rubber. Adv. Microbiology. 2013; 3. 543-51.

21. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2(2): 95-108.

22. Itoh Y., Wang X., Hinnebusch B.J., Preston J. F. Depolymerization of beta-1,6-N-acetyl-D-glucosamine disrupts the integrity of diverse bacterial biofilms. J. Bacteriol. 2005; 187: 382-7.

23. Kaplan J.B. Biofilm dispersal. J. Dent Res. 2010; 89: 205-18.

24. Karatan E., Watnick P. Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms. Microbiol. Mol. Biol. Rew. 2009; 73(2): 310-47.

25. Kovalchuk, S. N., Bakunina, I. Y., Burtseva, Y. V. et al. An endo-(1-->3)-beta-D-glucanase from the scallop Chlamys albidus: catalytic properties, cDNA cloning and secondary-structure characterization. Carbohydr. Res. 2009; 344(2): 191-7.

26. Landini P., Antoniani D., Burgess J.G, Nijland R. Molecular mechanisms of compounds affecting bacterial biofilm formation and dispersal. Appl Microbiol Biotechnol. 2010; 86(3): 813-23.

27. Lyubov V., Didenko L.V., Avtandilov G.A., et al. Nanoparticles production and inclusion in S. aureus incubated with polyurethane: An electron microscopy analysis. Open J. Medical Imaging. 2013; 3: 69-73.

28. Mulcahy H., Charron-Mazenod L., Lewenza S. Extracellular DNA chelates cations and induces antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. PLoS Pathogens, 2008; 4(11): 27. e1000213.

29. Nijland R., Hall M.J., Burgess J.G. Dispersal of biofilms by secreted, matrix degrading, bacterial DNAse. PLoS One. 2010; 5: 12 : e15668.

30. O'Toole G.A., Kolter. R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways:

a genetic analysis. Mol. Microbiol. 1998; 28: 449-61.

31. O'Toole G.A. Microtiter dish biofilm formation assay. J. Vis. Exp. 2011; 47; pii: 2437.

32. Meng Chen. Qingsong Yu, Hongmin Sun. Novel strategies for the prevention and treatment of biofilm related infections. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14: 18488-501.

33. Shakir A., Reda M., Badawey E. et al. Removal of biofilms from tracheoesophageal speech valves using a novel marine microbial deoxyribonuclease. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 2012; 147(3): 509-14.

34. Shields R.C., Mokhtar N., Ford M., et al. Efficacy of a marine bacterial nuclease against biofilm forming microorganisms isolated from chronic rhinosinusitis. PLoS ONE. 2013; 8(2). e55339.

35. Tetz G.V, Artemenko N.K., Tetz V.V. Effect of DNase and Antibiotics on Biofilm Characteristics. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53(3): 1204-9.

36. Zakharenko A. M., Kusaykin M. I., Kovalchuk S. N. et al. Enzymatic and molecular characterization of an endo-1,3-beta-d-glucanase from the crystalline styles of the mussel Perna viridis. Carbohydr Res, 2011; 346(2): 243-52.

N.A. Terentieva1, N.F. Timchenko2, L.A. Balabanova13, B.A. Golotin1, A.A. Belik13,

I.Yu Bakunina1, L.V. Didenko4, V.A. Rasskazov1

THE INFLUENCE OF ENZYMES

ON THE FORMATION OF BACTERIAL BIOFILMS

1 Federal State Budget Institution of Science «Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, G. B. Elyakova», Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Vladivostok, Russia;

2 Federal State Budgetary Scientific Institution «Research Somov Institute of Epidemiology and Microbiology», Vladivostok, Russia;

3 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia;

4 Federal State Budget Institution «Federal Research Center of Epidemiology and Microbiology, N.F. Gamaleya» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia.

Until the end of the last century, microbiology developed mainly based on studies of pure cultures of microorganisms. It is thanks to the research of pure cultures of bacteria formed a concept of how to single-celled microorganisms. Currently in microbiology is a recognized fact that the majority of microorganisms in natural and laboratory conditions exist in the form of biofilms. Many acute and chronic infections caused by bacteria's ability to form biofilms, which ensures their increased resistance to antibacterial agents. For inhibiting the formation or destruction of bacterial biofilms can be used low-molecular substances or enzymes. The purpose of the study was the effect of hydrolytic enzymes on the formation and destruction of biofilm Yersinia pseudotuberculosis and Bacillus subtilis. There was shown the possibility of studies on the action of enzymes on the model of biofilm formed by bacteria. It is established that DNase I inhibited the formation of biofilm by the bacterial strains of Y. pseudotuberculosis and B. subtilis, partially destroying the matural biofilm. In contrast, a-D-Galactosidase from the marine bacteria Pseudoalteromonas sрp. was found to stimulate the growth of Y. pseudotuberculosis and B. subtilis biofilms, whereas endo-1,3-p-D-glucanase from the marine bacterium Formosa algae inhibited the formation of Y. pseudotuberculosis biofilms, but did not destroy already formed biofilm.

Keywords: biofilm, Yersinia pseudotuberculosis, Bacillus subtilis, DN-ase I, a-D-galactosidase, endo-1,3-P-D-glucanase.

Citation: Terentieva N.A., Timchenko N.F., Balabanova L.A. et al. The influence of enzymes on the formation of bacterial biofilms. Health. Medical ecology. Science. 2015; 2(60): 86-93. URL: https://yadi.sk/i/M472oC3hfPs7A

Сведения об авторах

Терентьева Наталья Александровна, к.б.н., старший научный сотрудник ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159. тел.: 8(423) 2310703, e-mail nattere@mail.ru

Тимченко Нэлли Федоровна, д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и микробиологии. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», 690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1; Тел.: 244-11-47; e-mail ntimch@mail.ru

Балабанова Лариса Анатольевна, к.б.н., старший научный сотрудник ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159. тел.: 8(423) 2310703, инженер-микробиолог Дальневосточного федерального университета, г. Владивосток, ул. Суханова, 8. e-mail: balaban@piboc.dvo.ru

Голотин Василий Анатольевич, младший научный сотрудник лаборатории морской биохимии ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159. тел.: 8(423) 2310703, тел.: 8(423) 2310703; e-mail: golotin@bk.ru

Белик Алексей Анатольевич, младший научный сотрудник ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159. тел.: 89146640272, e-mail: belik_a_a@mail.ru;

Бакунина Ирина Юрьевна, д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории химии ферментов ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Елякова» ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159. тел.: 8(423) 2310705; e-mail: bakun@list.ru

Диденко Любовь Васильевна, д.м.н., руководитель лаборатории анатомии микроорганизмов. «Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации», 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 18. Тел.(499) 193-30-01; e-mail:lyubov_didenko@mail.ru

Рассказов Валерий Александрович, к.б.н., заведующий лабораторией морской биохимии ФГБУН «Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» ДВО РАН, 690022, г. Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159. тел.: 8(423) 2310703, e-mail: rasskaz@piboc.dvo.ru

© Коллектив авторов, 2015 г. УДК 615.468:604.4-7

Н.Ф. Тимченко1, А.Ф. Попов2, Б.Г. Андрюков1

актуальные вопросы микробиологии, клиники и диагностики

ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ СКАРЛАТИНОПОДОБНОЙ ЛИХОРАДКИ, ВыЗВАННОЙ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» г. Владивосток;

2 ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Владивосток

В обзоре изложены материалы, отражающие основные этапы развития представлений о дальневосточном варианте псевдотуберкулезе - дальневосточной скарлатиноподобной лихорадке (ДСЛ) и его возбудителе - Yersinia pseudotuberculosis, а также факторах патогенности бактерий, клинике и диагностике болезни. Отражены ключевые аспекты патогенности возбудителя, связанные с инвазией бактерий в клетки, их способностью противостоять фагоцитозу, выживать и размножаться в клетках, продуцировать токсины, а также c молекулярно-генетическими характеристиками возбудителя. Приведены данные об использовании полученных сведений для разработки специфических диагностических тест-систем.

Ключевые слова: псевдотуберкулез, дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка (ДСЛ), Yersinia pseudotuberculosis, патогенность, белки, токсины, гены, инфекция, клиника, диагностика.

Цитировать: Тимченко Н.Ф., Попов А.Ф., Андрюков Б.Г. Актуальные вопросы микробиологии, клиники и диагностики дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки, вызванной Yersinia pseudotuberculosis // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2015. №2(60). С. 94-100. URL: https://yadi.sk/i/xJVVluQYfPs7W

Сообщения о появлении новых болезней стали уже обычными для медицинской общественности, в частности, для микробиологов и инфекционистов. Ярким

примером этого являются чума и псевдотуберкулез. Род Yersinia входит в семейство Enterobacteriaceae. Он включает в себя 17 видов бактерий, среди кото-

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.