Научная статья на тему 'Формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis'

Формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
319
65
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
Y. PSEUDOTUBERCULOSIS / БИОПЛЕНКА / ФУКОИДАНЫ (СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ) / ИНГИБИРОВАНИЕ / БУРЫЕ ВОДОРОСЛИ / ДИНАМИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Ляпун Ирина Николаевна, Бынина Марина Павловна, Кусайкин Михаил Игоревич, Андрюков Борис Георгиевич, Матосова Екатерина Владимировна

Цель исследования: изучить влияние сульфатированных полисахаридов (фукоиданов) бурых водорослей Fucus evanescens, Saccharina cichorioides и Saccharina japonica на формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis на абиотических поверхностях в динамической модели. Материалы и методы: на слайды со специальным адгезивным покрытием в качестве абиотической подложки сорбировали водные растворы сухих экстрактов (1, 10 и 20 мг/мл) сульфатированных полисахаридов. Далее обработанные подложки помещались в закрытую систему, в которой циркулировала взвесь бактерий Yersinia pseudotuberculosis вирулентного штамма 512 I серовара из коллекции микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова в смеси бульона Хоттингера с физраствором (1:2), для формирования биопленки. Результаты: наибольший антипленочный эффект был выявлен у фукоидана водоросли F. evanescens. Выводы: исследованные сульфатированные полисахариды обладают ингибирующей активностью в отношении формирования биопленки Y. pseudotuberculosis на абиотической поверхности. Это наиболее выражено у полисахарида водоросли F. evanescens. Использование фукоиданов может стать альтернативной стратегией защиты от бактериальных инфекций.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Ляпун Ирина Николаевна, Бынина Марина Павловна, Кусайкин Михаил Игоревич, Андрюков Борис Георгиевич, Матосова Екатерина Владимировна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Formation biofilms of Yersinia pseudotuberculosis

Objective: the aim of the research was to study the effect of sulfated polysaccharides (fucoidans) of brown algae Fucus evanescens, Saccharina cichorioides and Saccharina japonica on the formation biofilms of Yersinia pseudotuberculosis on abiotic surfaces in a dynamic model. Materials and methods : aqueous solutions of dry extracts (1, 10 and 20 mg/ml) of sulfated polysaccharides were adsorbed onto slides with a special adhesive coating as abiotic substrates. Then the processed substrates were placed in a closed system where a suspension of bacteria of Y. pseudotuberculosis (a virulent strain 512 of a 1th serovar) from a collection of microorganisms of Somov Institute of Epidemiology and Microbiology circulated in a mix of Hottinger Broth with saline solution (1: 2) for the formation of biofilms. Results: The greatest antibiofilm effect was detected on slides with fucoidan of F. evanescens alga. Conclusion: The investigated sulfated polysaccharides have inhibitory effect to the formation of biofilm of Y. pseudotuberculosis on the abiotic surface. This is most shown by the polysaccharide of F. evanescens alga. The use of fucoidans may be an alternative strategy to protect against bacterial infections.

Текст научной работы на тему «Формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis»

74. Кузнецова Т.А. Коррекция нарушений иммунитета и гемостаза биополимерами из морских гидробионтов (экспериментальные и клинические аспекты). Дисс____докт. мед. наук. Москва.

2009. 296 с.

75. Крыжановский С.П. Биологически активные вещества из морских гидробионтов в коррекции метаболических нарушений при дислипидемии (экспериментально-клиническое исследование). Авто-реф....дисс. д.м.н. Владивосток. 2016. 49 с.

Сведения об авторах

Беседнова Наталия Николаевна, академик РАН, докт. мед. наук, главный науч. сотр. лаб. иммунологии «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (4232)244-24-46, е-mail: besednoff_lev@mail.ru);

Крыжановский Сергей Петрович, докт. мед. наук, главный врач Медицинского объединения ДВО РАН, зав. кафедрой ФГОУ ВО ТГМУ Минздрава России; (690022, г. Владивосток, ул. Кирова, 95. Тел. 8 (423) 231-09-10; е-mail: priemmodvoran@mail.ru);

Кузнецова Татьяна Алексеевна, докт. мед. наук, зав. лаб. иммунологии «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (4232)244-24-46, е-mail: takuznets@mail.ru);

Смолина Татьяна Павловна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. иммунологии «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова»; (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (4232)244-24-46, е-mail: tsmol@mail.ru);

Макаренкова Илона Дамировна, докт. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. иммунологии «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова»; (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (4232)244-24-46, е-mail: ilona_m@mail.ru);

Маляренко Олеся Сергеевна, канд. хим. наук, науч. сотр. лаб. химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН; (690022, г. Владивосток, пр.100 Вл-току, д. 159. Тел. +7(914)-967-35-32, e-mail: vishchuk@mail.ru);

Ермакова Светлана Павловна, докт. хим. наук, проф., зав. лаб. химии ферментов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, (690022, г. Владивосток, пр.100 Вл-току, д. 159. Тел. +7(950)285-58-38, е-mail: swetlana_e@mail.ru);

Запорожец Татьяна Станиславовна, докт. мед. наук, зам. директора по науч. работе «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова»; (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1. Тел. (4232)244-24-46, е-mail: niiem_vl@mail.ru).

© Коллектив авторов, 2018 г DOI: 10.5281/zenodo.1488020

Удк 582.272:54.056

И.Н. Ляпун1, М.П. Бынина1, М.И. Кусайкин2, Б.Г. Андрюков1, Е.В. Матосова1, И.Д. Макаренкова1, С.П. Ермакова2, Т.Н. Звягинцева2

формирование биопленки yersinia pseudotuberculosis в токе жидкости на абиотических поверхностях, обработанных фукоиданами бурых водорослей японского моря

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток

Цель исследования: изучить влияние сульфатированных полисахаридов (фукоиданов) бурых водорослей Fucus evanescens, Saccharina cichorioides и Saccharina japonica на формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis на абиотических поверхностях в динамической модели. Материалы и методы: на слайды со специальным адгезивным покрытием в качестве абиотической подложки сорбировали водные растворы сухих экстрактов (1, 10 и 20 мг/мл) сульфатированных полисахаридов. Далее обработанные подложки помещались в закрытую систему, в которой циркулировала взвесь бактерий Yersinia pseudotuberculosis вирулентного штамма 512 I серовара из коллекции микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова в смеси бульона Хоттингера с физраствором (1:2), для формирования биопленки. Результаты:наибольший антипленочный эффект был выявлен у фукоидана водоросли F evanescens. Выводы: исследованные сульфатированные полисахариды обладают ингибирующей активностью в отношении формирования биопленки Y. pseudotuberculosis на абиотической поверхности. Это наиболее выражено у полисахарида водоросли F evanescens. Использование фукоиданов может стать альтернативной стратегией защиты от бактериальных инфекций.

Ключевые слова: Y pseudotuberculosis, биопленка, фукоиданы (сульфатированные полисахариды), инги-бирование, бурые водоросли, динамическая модель.

Для цитирования: Ляпун И.Н., Бынина М.П., Кусайкин М.И., Андрюков Б.Г., Матосова Е.В., Макаренкова И.Д., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis в токе жидкости на абиотических поверхностях, обработанных фукоиданами бурых водорослей Японского моря// Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2018; 3: 19-26. DOI: 10.5281/zenodo.1488020.

Для корреспонденции: Андрюков Б.Г., e-mail: andrukov_bg@mail.ru.

Поступила 06.10.18

I.N. Lyapun1, M.P. Bynina1, M.I. Kusaykin2, B.G. Andryukov1, E.V. Matosova1, I.D. Makarenkova1, S.P. Ermakova2, T.N. Zvyagintseva2

FORMATION BIOFILMS OF yersinia pseudotuberculosis IN FLUID FLOW ON ABIOTIC SURFACES PROCESSED BY FUKOIDANES OF BROWN ALGAE OF THE JAPANESE SEA

1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia

2 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia

Objective: the aim of the research was to study the effect of sulfated polysaccharides (fucoidans) of brown algae Fucus evanescens, Saccharina cichorioides and Saccharina japonica on the formation biofilms of Yersinia pseudotuberculosis on abiotic surfaces in a dynamic model. Materials and methods: aqueous solutions of dry extracts (1, 10 and 20 mg/ml) of sulfated polysaccharides were adsorbed onto slides with a special adhesive coating as abiotic substrates. Then the processed substrates were placed in a closed system where a suspension of bacteria of Y. pseudotuberculosis (a virulent strain 512 of a 1th serovar) from a collection of microorganisms of Somov Institute of Epidemiology and Microbiology circulated in a mix of Hottinger Broth with saline solution (1: 2) for the formation of biofilms. Results: The greatest antibiofilm effect was detected on slides with fucoidan of F. evanescens alga. Conclusion: The investigated sulfated polysaccharides have inhibitory effect to the formation of biofilm of Y. pseudotuberculosis on the abiotic surface. This is most shown by the polysaccharide of F. evanescens alga. The use of fucoidans may be an alternative strategy to protect against bacterial infections.

Keywords: Y pseudotuberculosis, biofilms, fucoidans (sulfated polysaccharides), inhibitory effect, brown algae, dynamic model.

For citation: Lyapun I.N., Bynina M.P., Kusaykin M.I., Andryukov B.G., Matosova E.V, Makarenkova I.D., Ermakova S.P., Zvyagintseva T.N. Formation biofilms of Yersinia pseudotuberculosis in fluid flow on abiotic surfaces processed by fukoidanes of brown algae of the Japanese sea. Health. Medical ecology. Science. 2018; 3: 19-26 (in Russia). DOI: 10.5281/zenodo.1488020.

For correspondence: Andrukov B.G., MD, e-mail: andrukov_bg@mail.ru. Conflict of interests. The authors are declaring absence of conflict of interests. Financing.The study was carried out without the involvement of sponsorship.

Received 06.10.18 Accepted 22.11.18

Введение

Формирование биопленок бактериями - естественный процесс в природных условиях. Таким образом, микроорганизмы переживают неблагоприятные условия [21, 30], в том числе действие различных антимикробных факторов. Биопленка может образовываться на различных поверхностях или на границе сред в токе жидкости [16], представляя собой сообщество клеток, заключенных в матрикс из внеклеточных полимерных веществ и объединенных системой Quorum Sensing. При этом бактериальные клетки имеют модифицированный фенотип, который проявляется измененными параметрами роста и экспрессии специфических генов [9, 13]. Матрикс имеет особое значение в жизнедеятельности биопленки. С помощью слизи микроорганизмы удерживаются между собой и на поверхности субстрата. И, что особенно важно, внеклеточный матрикс слу-

жит защитным барьером, который не позволяет неблагоприятным факторам, в том числе антибиотикам и бактерицидным средствам, воздействовать на бактериальную клетку [28]. Это привносит в инфекционный процесс негативные характеристики: резистентность к традиционным антимикробным препаратам, склонность к хронизации и рецидивам.

Среди возбудителей сапронозных инфекций бактерии Yersinia pseudotuberculosis привлекают особое внимание. Это связано с тем, что биопленкообра-зование у данного вида является важным фактором патогенности [8, 11, 17, 20]. А также с эволюционной близостью к нему Y. pestis - возбудителя высоковирулентной чумы, образующему биопленку в преджелудке блох [12, 20, 30]. Оба патогена имеют высокую степень геномной гомологии, и формирование биопленки регулируется идентичным генетическим опероном hmsHFRS [18, 20]. Благода-

ря своим уникальным психрофильным свойствам, Y pseudotuberculosis способны выживать и сохранять патогенность при различных условиях окружающей среды. Бактерии этого вида могут существовать как в объектах окружающей среды (почва, вода, в том числе морская, растения и т.д.), так и в организме животных (наземных и морских) и человека, вызывая инфекционный процесс [4, 10]. Во многом это связано со способностью иерсиний формировать биопленки [11]. Это обуславливает актуальность поиска препаратов, обладающих ингибирующим действием в отношении биопленок Y. pseudotuberculosis.

В этом отношении особый интерес представляют бурые водоросли в связи с их доступностью в прибрежной зоне морей, в том числе Дальнего Востока. Они содержат уникальные по химической структуре и биологическому действию соединения - сульфати-рованные полисахариды (СПС, фукоиданы), аналогов которым нет у других организмов, обладающих низкой токсичностью [23] по отношению к макроорганизму и обширным спектром антибактериального действия (иммуномодулирующее, антиадгезивное, бактериостатическое) [2] в отношении грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, в том числе, против Y pseudotuberculosis [2, 6, 7].

Цель иследования: изучить влияние сульфати-рованных полисахаридов (фукоиданов) бурых во-

Далее обработанные подложки помещались вертикально в закрытую систему, в которой циркулировала взвесь бактерий Y. pseudotuberculosis в смеси бульона Хоттингера с физраствором (1:2) в концентрации 109 мк/мл, для формирования биопленки. В исследовании применялась динамическая модель [29]. Ток жидкости, 50 мл/мин, обеспечивался перистальтическим насосом (Суперстальтик-02, Россия) (рис.1). Применение динамической модели обусловлено тем, что движение жидкости для формирования биопленки является естественным условием [16].

После инкубации в течение 72 часов (температура +22-24°C) слайды трехкратно промывались

дорослей Fucus evanescens, Saccharina cichorioides и Saccharina japonica на формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis на абиотических поверхностях в динамической модели.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования были использованы бактерии Yersinia pseudotuberculosis (штамм 512, I серотип) коллекции микроорганизмов НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова. Бактерии выращивали в течение 48 часов на скошенном агаре при температуре +4-6°C, после чего инокулировали их в жидкую питательную среду.

На слайды со специальным адгезивным покрытием в качестве абиотической подложки: Polysine™ Adhesion Slides с электростатической и биохимической адгезией и Superfrost™ Plus с постоянным положительным зарядом на поверхности (ThermoFisher Scientific, США), сорбировали водные растворы сухих экстрактов (1, 10 и 20 мг/мл) сульфатированных полисахаридов бурых водорослей. Фукоиданы были выделены в Тихоокеанском институте биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН (Владивосток) по методу Т. Звягинцевой и соавторов (2005) [31] из водорослей: Saccharina cichorioides (ламинария цикориевидная) и Saccharina japonica (ламинария японская), Fucus evanescens (фукус исчезающий), собранных вблизи российского побережья Японского моря (табл. 1).

дистиллированной водой для освобождения от планктонных форм бактерий. После этого препараты окрашивали в течение 15 мин, используя метод Stemheimer-MalЫn [21]. Предварительно краситель А (кристаллический фиолетовый 3,0 г, этиловый спирт 95% - 20,0 мл, дистиллированная вода 80,0 мл и оксалат аммония 0,8 г) смешивали с красителем Б (сафранин О - 0,25 г, этиловый спирт 95% - 10,0 мл, дистиллированная вода 90,0 мл) в отношении 1:1. Далее слайды промывали дистиллированной водой, подсушивали на воздухе 5 мин и измеряли значения оптической плотности в разных точках поверхно-стис помощью спектрофотометра АКИЦ-01 (све-

Таблица 1

Таксономическая характеристика исследуемых бурых водорослей*

Название водоросли Научная классификация

Латинское Синонимичное Русское Класс Семейство Род

Saccharina cichorioides Laminaria coriacea Сахарина [= Ламинария] цикориевидная Phaeophyceae Laminariaceae Saccharina

Saccharina japonica Laminaria fragilis, Laminaria ochotensis Сахарина [= Ламинария] японская Phaeophyceae Laminariaceae Saccharina

Fucus evanescens Fucus bursigerus, Fucus distichus subsp. evanescens Фукус исчезающий Phaeophyceae Fucaceae Fucus

'Источник - WoRMS taxon details: http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=526662; http://www.marinespecies.org/aphia. php?p=taxdetails&id=377084; http://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=145545

Рис. 1. Динамическая модель формирования биопленки Y. pseudotuberculosis под влиянием фукоидана бурых водорослей: А - выделение чистой культуры Y. pseudotuberculosis; Б - накопление бактериальной массы на скошенном агаре; В - инокулирование планктонных форм бактерий в смесь бульона Хоттингера с физраствором (1:2); Г - слайды со специальным адгезивным покрытием

в качестве абиотической подложки: Г1 - слайды без фукоидана для контроля эксперимента; Г2 - слайды с сорбированным на поверхности фукоиданом; Д - культивирование биопленки на слайдах в динамической закрытой системе; Е - слайды контроля со сформированной биопленкой Y. pseudotuberculosis; Ж - ингибирование роста биопленки на слайдах с фукоиданом

тофильтр 585 нм).Таким образом проводилась количественная оценка биомассы биопленки за счет способности компонентов красителя (кристаллического фиолетового и сафранина) связываться с ма-триксом биопленок [21, 25, 26].

Полученные результаты обрабатывали, используя библиотеку статистических методов Microsoft Excel для Windows.

Результаты

В результате проведенных нами исследований выявлена динамика роста биопленки Y pseudotuberculosis на всех слайдах. Установлено, что процесс образования биопленки под влиянием фукоиданов, выделенных из различных водорослей, отличался. Но дальнейшая оценка результатов проводилась только на основании данных, полученныхсо слайдов Super Frost™ Plus Adhesion Slides, так как расчёт показателей коэффициентов вариации разбросов (Vx) значений экстинкций показал незначительную степень рассеивания данных с этих поверхностей (среднее значение Vx = 8,58 при n = 720). Это позволило сделать предположение о более равномерных адгезивных характеристиках поверхности, оптимальных для формирования биопленки.

Значения приведены в виде средних величин с указанием стандартной ошибки (М±т). Статистическая значимость различий между массивами данных оценивалась по критерию Стьюдента. Обоснованность применения критерия определялась проверкой гипотезы о нормальности распределения выборки по количественным характеристикам распределения (коэффициенты ассиметрии и эксцесса) и равенству дисперсий с использованием библиотеки статистических методов Microsoft Excel и таблиц критических значений. Критический уровень значимости статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

При анализе результатов влияния на формирование биопленок представленных сульфатированных полисахаридов наибольший антипленочный эффект был выявлен у фукоидана водоросли F. evanescens (рис. 2).

Ингибирование роста бактериальной биопленки достигало 29% по сравнению с контролем (Р<0,001). Как и в случае с результатами, полученными при использовании фукоидана S. japonica, влияние на рост биопленки было наиболее выраженным в средней (10 мг/мл) и высокой (20 мг/мл) концентрации (рис. 3).

На слайдах с фукоиданом S. cichorioides ингиби-рования роста биопленки, соответствующего критическому уровню значимости, не было. При средней и высокой концентрациях полисахарида (10 и 20 мг/ мл соответственно) наблюдалась индукция роста биопленки (р<0,001) (рис. 4).

Обсуждение

В конце XX века появилась теория о том, что микроорганизмы в природе существуют в виде сообществ [22], и в настоящее время это уже является неопровержимым фактом. По оценкам Международного центра по контролю за заболеваниями (CDC) и Американского национального института здоровья (NIH) до 80% инфекций, вызываемых бактериями, в мире связаны с биопленками [16, 21]. При этом не менее 80% возбудителей заболеваний, образующих биопленки, связаны с персистентной инфекцией [13]. Зачастую это приводит к тяжелым последствиям, хроническим заболеваниям и даже гибели пациентов. Особенно опасно то обстоятельство, что микроорганизмы в виде биопленок устойчивы к различным воздействиям, в том числе при обработке поверхностей и медицинских приборов, и устройств [19]. В связи с этим исследователи во всем мире ведут поиск новых веществ, которые будут препятствовать образованию биопленки.

Рис. 2. Влияние фукоидана F. evanescens на формирование биопленки Y. pseudotuberculosis

Экстинция, y.e. 50,00 45,00 40,00 35,00

Saccharina japónica

I

1 mg/ml 10 mg/m! ¿0 mg/ml контроль Кон центрацкя фукоидана

Superfrost Phis Adhesion Slides Показатели Концентрация, mg/ml Контр ОЛЬ

1 шаml 10 ша ml 20 maïul

Эксшнщия (M±m), y. e. 41,15±3,88 38,20±1,81 38,25±2,77 42,15±3,00

Коэффициент вариации. V, °o 9,44 4 "4 7,23 7,12

Число наблюдении. и 60 60 60 60

Значимость различий с контролем, Р >0,05 <0.001 <0,001

Рис. 3. Влияние фукоидана S. japónica на формирование биопленки Y. pseudotuberculosis

Экстинция y.e. Saccharina cichorioides

70,00 65,00 60,00 55,00

lmg/ml 10 mg/ml 20mg/ml контроль Концентрация фукоидана

Superfrost Plus Adhesion Slides Показатели Концентрация, nig'iul Конгроль

1 mg/ml 10 mg/ml 20 mg/ml

Зксшнкцня (М±ш), у. е. 6 0,6 5 ±4,43 65.33±6.S6 05,28±б;Л 61,60±5,13

Коэффициент вариации, V,0 о 7,31 10,5 9,97 8,32

Число на блюденгш. ы 60 60 60 60

Значимость pa зличии с контролем, Р >0,05 <0,001 <0,001

Рис. 4. Влияние фукоидана S. cichorioides на формирование биопленки Y. pseudotuberculosis

В качестве таковых в нашем исследовании были использованы сульфатированные полисахариды (фу-коиданы) бурых водорослей Японского моря. Это уникальные по своей химической структуре соединения, которые обладают особыми свойствами [23]. Учитывая неограниченные возможности по добыче биологического материала (водорослей) у побережья Дальнего Востока для выделения данного типа веществ, изучение антипленочных свойств сульфатированных полисахаридов и применение их в практических целях становится перспективным направлением.

Из предыдущих публикаций было известно, что действие фукоиданов может быть связано с подавлением адгезии бактерий - начальной стадии формирования биопленки, которая опосредуется целым рядом факторов колонизации [15, 24, 29]. У Y pseudotuberculosis адгезия является ключевым этапом патогенеза псевдотуберкулезной инфекции и необходима для прикрепления микробной клетки к поверхности слизистой оболочки кишечника и последующей инвазии [17, 20, 30]. Кроме того, ключевую роль в жизненном цикле данного микроорганизма - возбудителя сапрозо-онозной инфекции, играет способность формировать биопленку для сохранения патогенных свойств этих бактерий не только в организме, но и в объектах окружающей среды [20, 30]. В связи с этим в качестве модели для исследования авторами были выбраны бактерии Y pseudotuberculosis. Кроме того, определяющее значение имело и то обстоятельство, что инфекции, связанные с данным возбудителем регистрируются повсеместно на территориях с умеренным и холодным климатом, включая Австралию и Новую Зеландию [14].

В исследовании для стандартизации условий были использованы специальные слайды Polysine™ Adhesion Slides с электростатической и биохимической адгезией и Superfrost™ Plus с постоянным положительным зарядом на поверхности (ThermoFisher Scientific, США). При обработке данных, полученных с данных типов слайдов, было сделано предположение о более равномерных адгезивных свойствах покрытия Superfrost™ Plus, которой было оптимально для формирования бактериальной биопленки. При использовании двухкомпонентной окраски по Sternheimer-Malbin мы опирались на те сведения, что кристаллический фиолетовый, являясь основным красителем, связывается с отрицательно заряженными поверхностными молекулами полисахаридов матрикса [25], а сафранин, суправитально окрашивая бактериальные клетки в биопленке, сохраняет их подвижность [21, 25].

При обработке полученных результатов с использованием библиотеки статистических методов программы Microsoft Excel для Windows было выявлено статистически значимое подавление формирования биопленки под влиянием фукоиданов S. japonica (в высоких и средних концентрациях) и F evanescens. При этом наиболь-

ший антипленочный эффект наблюдался у фукоидана водоросли F. evanescens (1, 10 и 20 мг/мл). Выявленная индукция биопленкообразования сульфатированным полисахаридом S. cichorioides расценивается авторами как следствие увеличения рельефа слайдов в концентрациях 10 и 20 мг/мл или отсутствия ингибирующей способности данного вещества.

По мнению исследователей, биологическая активность фукоиданов обусловлена достаточно высоким содержанием сульфатов (до 39% у S. cichorioides) и углеводов: частично ацетилированый 1^-3; 1^4-а^-фукан из F. evanescens содержит Fuc:Gal:Xyl:Man всоотношении: 77,9:9,5:8,4:4,2 мол.%. Фукоидан S. japonica отличается высоким содержанием галактозы (Fuc:Gal:Xyl:Rha в соотношении: 60:35:2:3 мол.%) и является частично аце-тилированным 1^■3-a-L-фуканом, сульфатированным в основном по положению С-4 и в меньшей степени по С-2 остатков фукозы. ^^З^^-фукан S. àchorioides полностью сульфатирован по положениям С-2 и С-4 остатков фукозы [23].

Содержанием фукоидана в бурых водорослях, обитающих в водах Дальнего востока и Японского моря в частности, непостоянно и определяется сезонными изменениями таких абиотических факторов как температура, концентрация элементов минерального питания, освещенность и зависит от репродуктивного статуса водоросли [27]. Это требует стандартизации получаемой продукции для дальнейших исследований.

Однако, не смотря на это, полученные результаты говорят об эффективности применения сульфати-рованных полисахаридов для ингибирования формирования и роста бактериальной биопленки, что исследователи связывают с подавлением адгезии, блокированием образования клеточной стенки грамо-трицательных бактерий, активностью гиалуронидазы и индукцией гибели клеток бактерий [1, 3, 5, 31].

Выводы

Исследованные сульфатированные полисахариды обладают ингибирующей активностью в отношении формирования биопленки Y. pseudotuberculosis на абиотической поверхности. Это наиболее выражено у полисахарида водоросли F. evanescens. Использование фукоиданов может стать альтернативной стратегией защиты от бактериальных инфекций.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Анастюк С.Д., Беседнова Н.Н., Богданович Л.Н. и др. Фукоиданы - сульфатированные полисахариды бурых водорослей. Структура, ферментативная трансформация и биологические свойства. Владивосток: Дальнаука; 2014; 380 с.

2. Беседнова Н.Н. Морские гидробионты - потенциальные источники лекарств // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2014; 3 (57): 4-10.

3. Беседнова Н.Н., Макаренкова И.Д., Звягинцева Т.Н., Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С. Ингиби-рующее действие полисахаридов морских гидроби-онтов на формирование биопленок // Антибиотики и химиотерапия. 2016; 61(9-10): 64-73.

4. Бынина М.П., Тимченко Н.Ф., Терентьева Н.А. Характеристика формирования биопленки на абиогенной поверхности бактериями рода Yersinia при низкой температуре в разных средах обитания // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2016; 65 (2): 55-57.doi: 10.18411/hmes. d-2016-079.

5. Запорожец Т.С., Макаренкова И.Д., Бакунина И.Ю., Бурцева Ю.В., Кусайкин М.И. Балабанова Л.А., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Рассказов В.А. Инги-бирование адгезии С. Diphtheriae к буккальному эпителию человека гликозид гидролазами из морских гидробионтов // Биомедицинская химия. 2010; 56(3): 350-358.doi: 10.18097/pbmc20105603350.

6. Имбс Т.И., Красовская Н.П., Ермакова С.П., Макарьева Т.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. Сравнительное исследование химического состава и противоопухолевой активности водно-этанольных экстрактов бурых водорослей Laminaria cichorioides, Costaria costata и Fucus evanescens // Биология моря. 2009; 35 (2): 140-146.

7. Имбс Т.И., Харламенко В.И., Звягинцева Т.Н. Оптимизация процесса экстракции фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens // Химия растительного сырья. 2012; 1: 143-147.

8. Масюк А.Г., Елисейкина М.Г., Терентьева Н.А., Долматова Л.С., Тимченко Н.Ф. Влияние биологически активных веществ из морских организмов на формирование биопленки Yersinia pseudotuberculosis на биотической поверхности // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2017; 72 (5): 88-90. doi: 10.5281/zenodo.1115939.

9. Матосова Е.В., Андрюков Б.Г. Антимикробные механизмы нейтрофилов как перспективные мишени для фармакологической модуляции неспецифической защиты организма // ЖМЭИ. 2018; 3: 87-96.

10. Сомов Г.П. Современные представления о са-пронозах и сапрозоонозах // Ветеринарная патология. 2004;3:31-35.

11. Андрюков Б.Г., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Перспективные стратегии поиска новых средств борьбы с инфекционными заболеваниями // Антибиотики и химиотерапия 2018, 63(1-2): 44-55. doi:10.5281/ zenodo.1306245.

12. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96 (24): 14043-8.

13. Algburi A., Comito N., Kashtanov D., Dicks L.M., Chikindas M.L. Control of Biofilm Formation: Antibiotics and Beyond. Appl Environ Microbiol. 2017; 83(3): e02508-16. doi: 10.1128/AEM.02508-16.

14. Amphlett A. Far East Scarlet-Like Fever: A Review of the Epidemiology, Symptomatology, and Role of Superantigenic Toxin: Yersinia pseudotuberculosis -Derived Mitogen A. Open Forum Infect Dis. 2015; 3(1): ofv202. doi: 10.1093/ofid/ofv202.

15. Busetti A., Thompson T.P., Tegazzini D., Megaw J., Maggs C.A., Gilmore B.F. Antibiofilm activity of the brown alga Halidrys siliquosa against clinically relevant human pathogens. Mar Drugs. 2015; 13 (6): 3581-3605.

16. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 2002; 15 (2): 167-193.

17. Erickson D.L., Jarrett C.O., Wren B.W., Hinnebusch B.J. Serotype differences and lack of biofilm formation characterize Yersinia pseudotuberculosis infection of the Xenopsylla cheopis flea vector of Yersinia pestis. J Bacteriol. 2006; 188: 1113-1119. doi: 10.1128/ JB.188.3.1113-1119.2006.

18. Fang N., Yang H., Fang H., Liu L., Zhang Y., Wang L., Han Y., Zhou D., Yang R. RcsAB is a major repressor of Yersinia biofilm development through directly acting on hmsCDE, hmsT, and hmsHFRS. Sci Rep. 2015; 5: 9566. doi: 10.1038/srep09566.

19. Frieri M., Kumar K., Boutin A. Antibiotic resistance. J Infect Public Health. 2017; 10(4): 369-378. doi: 10.1016/j.jiph.2016.08.007.

20. Guo X.P., Ren G.X., Zhu H., Mao X.J., Sun Y.C. Differential regulation of the hmsCDE operon in Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis by the Rcs phosphorelay system. Sci Rep. 2015; 5: 8412. doi: 10.1038/srep08412.

21. Harr R.R. Medical Laboratory Science Review. F.A. Davis Company; 2012; 576 p.

22. Mack W.N., Mack J.P., Ackerson A.O. Microbial film development in a trickling filter. Microb Ecol. 1975; 2(3): 215-26. doi: 10.1007/BF02010441.

23. Makarenkova I.D., Akhmatova N.K., Erma-kova S.P., Besednova N.N. Morphofunctional changes of dendritic cells induced by sulfated poly-saccharides of brown algae. Biomed Khim. 2017; 63(1): 39-46. doi: 10.18097/PBMC2017630139.

24. Marudhupandi T., Thangappan T., Kumar A. Antibacterial effect of fucoidan from Sargassum wightii against the chosen human bacterial pathogens. Int Current Pharmaceutical J. 2013; 2(10): 156-158.

25. Ommen P., Zobek N., Meyer R.L. Quantification of biofilm biomass by staining Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 2017; 141: 87-89. doi: 10.1016/j.mimet.2017.08.003.

26. O'Toole G.A., Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 1998; 28 (3): 449-61.

27. Rioux L.E., Turgeon S.L., Beaulieu M. Structural characterization of laminaran and galactofucan extracted from the brown seaweed Saccharina longicruris. Phytochemistry. 2010; 71(13): 1586-95. doi: 10.1016/j.phytochem.2010.05.021.

28. Singh S., Singh S.K., Chowdhury I, Singh R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiol J. 2017; 11: 53-62. doi: 10.2174/1874285801711010053.

29. Sternberg C., Bjarnsholt T., Shirtliff М. Methods for Dynamic Investigations of Surface-Attached In Vitro

Bacterial and Fungal Biofilms. Methods Mol Biol. 2014; 1147: 3-22. doi: 10.1007/978-1-4939-0467-9_1.

30. Zhou D., Yang R. Formation and regulation of Yersinia biofilms. Protein & Cell. 2011; 2: 173-179.

31. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Naza-renko E.L., Gorbach V.I., Urvantseva A.M., Kiseleva M.I., Isakov V.V. Water-soluble polysaccharides of some brown algae of the Russian Far-East. Structure and biological action of low-molecular mass polyuronans. J Exp Marine Biol Ecol. 2005; 320: 123-131.

Сведения об авторах

Ляпун Ирина Николаевна, к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток, irina-lyapun@list.ru;

Бынина Марина Павловна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;

Кусайкин Михаил Игоревич, д.б.н., заместитель директора по научным вопросам, Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток.

Андрюков Борис Георгиевич, д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;

Матосова Екатерина Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;

Макаренкова Илона Дамировна, д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;

Ермакова Светлана Павловна, д.х.н., зав. лабораторией химии ферментов, Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток.

Звягинцева Татьяна Николаевна, д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории химии ферментов, Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток.

© Коллектив авторов, 2018 г. DOI: 10.5281/zenodo.1489152

Удк 577.114: 582.232: 578.825.11

И.Д. Макаренкова1, А.И. Тухватулин2, С.П. Ермакова3, Д.Ю. Логунов2, А.Ш. Джаруллаева2, А.С. Ерохова2, Н.Н. Беседнова1, Т.Н. Звягинцева3

влияние фукоидана и трансформированных дериватов из бурой водоросли fucus evanescens на активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток

2 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, г. Москва

3 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток

Цель: изучить влияние различных по химической структуре трансформированных фукоиданов из бурой водоросли Fucus evanescens на активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB. Материалы и методы: изучение специфического взаимодействия фукоиданов с Toll-рецепторами (TLR) проведено на клеточной линии эмбрионального почечного эпителия человека (HEK293), содержащую определенный TLR, репортерный ген щелочной фосфатазы - SEAP (HEK293h-TLR2/CD14-NF-kB-SEAP, -TLR4/CD14-MD2-NF-kB-SEAP) или ß-галактозидазы (-TLR4/CD14-MD2-NF-kB). Измерение уровня ферментативной активности NF-kB определяли колориметрическим методом. Токсическое действие фукоиданов исследовали в МТТ-тесте. Результаты: установлено, что нативный фукоидан из F evanescens и его дериваты в исследуемых концентрациях не оказывают влияния на контрольную линию клеток HEK293-null1К, не экспрессирующую TLR. При взаимодействии полисахаридов с TLR2 и TLR4 на линии клеток HEK294, содержащих щелочную фосфатазу, показано, что полисахариды способствуют активации NF-kB только в концентрации 1000 мкг/мл, о чем свидетельствует увеличение уровня экспрессии NF-kB-зависимой SEAP. Результаты взаимодействия полисахаридов с TLR-4 на линии клеток, содержащей репорторный ген ß-галактозидазы свидетельствуют, что наибольшим действием обладает нативный фукоидан, способствующий активации NF-kB в концентрации от 10 до 1000 мкг/мл, тогда

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.