CC BY
34
27. Rioux L.E., Turgeon S.L., Beaulieu M. Structural characterization of laminaran and galactofucan extracted from the brown seaweed Saccharina longicruris. Phytochemistry. 2010; 71(13): 1586-95. doi: 10.1016/j.phytochem.2010.05.021.
28. Singh S., Singh S.K., Chowdhury I, Singh R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiol J. 2017; 11: 53-62. doi: 10.2174/1874285801711010053.
29. Sternberg C., Bjarnsholt T., Shirtliff М. Methods for Dynamic Investigations of Surface-Attached In Vitro
Bacterial and Fungal Biofilms. Methods Mol Biol. 2014; 1147: 3-22. doi: 10.1007/978-1-4939-0467-9_1.
30. Zhou D., Yang R. Formation and regulation of Yersinia biofilms. Protein & Cell. 2011; 2: 173-179.
31. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Naza-renko E.L., Gorbach V.I., Urvantseva A.M., Kiseleva M.I., Isakov V.V. Water-soluble polysaccharides of some brown algae of the Russian Far-East. Structure and biological action of low-molecular mass polyuronans. J Exp Marine Biol Ecol. 2005; 320: 123-131.
Сведения об авторах
Ляпун Ирина Николаевна, к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток, irina-lyapun@list.ru;
Бынина Марина Павловна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;
Кусайкин Михаил Игоревич, д.б.н., заместитель директора по научным вопросам, Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток.
Андрюков Борис Георгиевич, д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;
Матосова Екатерина Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;
Макаренкова Илона Дамировна, д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, г. Владивосток;
Ермакова Светлана Павловна, д.х.н., зав. лабораторией химии ферментов, Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток.
Звягинцева Татьяна Николаевна, д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории химии ферментов, Тихоокеанский институт биоорганической химии имени Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток.
© Коллектив авторов, 2018 г. DOI: 10.5281/zenodo.1489152
Удк 577.114: 582.232: 578.825.11
И.Д. Макаренкова1, А.И. Тухватулин2, С.П. Ермакова3, Д.Ю. Логунов2, А.Ш. Джаруллаева2, А.С. Ерохова2, Н.Н. Беседнова1, Т.Н. Звягинцева3
влияние фукоидана и трансформированных дериватов из бурой водоросли fucus evanescens на активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова, Владивосток
2 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, г. Москва
3 Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, г. Владивосток
Цель: изучить влияние различных по химической структуре трансформированных фукоиданов из бурой водоросли Fucus evanescens на активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB. Материалы и методы: изучение специфического взаимодействия фукоиданов с Toll-рецепторами (TLR) проведено на клеточной линии эмбрионального почечного эпителия человека (HEK293), содержащую определенный TLR, репортерный ген щелочной фосфатазы - SEAP (HEK293h-TLR2/CD14-NF-kB-SEAP, -TLR4/CD14-MD2-NF-kB-SEAP) или Р-галактозидазы (-TLR4/CD14-MD2-NF-kB). Измерение уровня ферментативной активности NF-kB определяли колориметрическим методом. Токсическое действие фукоиданов исследовали в МТТ-тесте. Результаты: установлено, что нативный фукоидан из F evanescens и его дериваты в исследуемых концентрациях не оказывают влияния на контрольную линию клеток HEK293-null1K, не экспрессирующую TLR. При взаимодействии полисахаридов с TLR2 и TLR4 на линии клеток HEK294, содержащих щелочную фосфатазу, показано, что полисахариды способствуют активации NF-kB только в концентрации 1000 мкг/мл, о чем свидетельствует увеличение уровня экспрессии NF-kB-зависимой SEAP. Результаты взаимодействия полисахаридов с TLR-4 на линии клеток, содержащей репорторный ген Р-галактозидазы свидетельствуют, что наибольшим действием обладает нативный фукоидан, способствующий активации NF-kB в концентрации от 10 до 1000 мкг/мл, тогда
как фукоидан, освобожденный от комплекса полифенолов и фракция, полученная путем ферментативного гидролиза - от 100 до 100 мкг/мл. Увеличение уровня экспрессии NF-kB-зависимой Р-галактозидазы под действием полисахаридов (концентрация 100 и 1000 мкг/мл) было сопоставимо с действием классического лиганда TLR-4 -липополисахарида E. coli. Выводы: 1. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens и трансформированные дериваты способствуют активации NF-kB, о чем свидетельствует увеличение уровня экспрессии NF-kB-зависимой SEAP и NF-kB-зависимой Р-галактозидазы. 2. При специфическом взаимодействии с TLR-2, на линии клеток, содержащих SEAP, наибольшим активирующим действием обладает фукоидан (F-3; М.м. 51 кДа) из F evanescens, полученный путем ферментативного гидролиза.3. При специфическом взаимодействии с TLR-4, на линии клеток, содержащих SEAP или Р-галакгозидазу наибольшим индуцирующим действием обладает нативный фукоидан (F-1; М.м. 130-430 кДа) из F. evanescens, в состав которого входит полифенольный комплекс и моносахариды (Fuc:Gal:Xyl Xyl).
Ключевые слова: фукоиданы, бурые водоросли, Toll-подобные рецепторы, транскрипционный ядерный фактор NF-kB, врожденный иммунитет.
Для цитирования: Макаренкова И.Д., Тухватулин А.И., Ермакова С.П., Логунов Д.Ю., Джаруллаева А.Ш., Ерохова А.С., Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н. Влияние фукоидана и трансформированных дериватов из бурой водоросли Fucus evanescens на активацию транскрипционного ядерного фактора Nf-kb // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2018; 3(75): 26-33. DOI: 10.5281/zenodo.1489152.
Для корреспонденции: Макаренкова Илона Дамировна, д.м.н.; e-mail: ilona_m@mail.ru.
Поступила 11.11.18
I.D. Makarenkova1, A.I. Tukhvatulin2, S.P. Ermakova3, D.Yu. Logunov2, A.Sh. Dzharullayeva2, A.S. Erokhova2, N.N. Besednova1, T.N. Zvyagintseva3 INFLUENCE OF FUKOIDAN AND TRANSFORMED DERIVATIES FROM BROWN ALGAE FUCUS EVANESCENS ON ACTIVATION OF NF-KB TRANSCRIPTION NUCLEAR FACTOR
1 Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia
2 Gamalei National Research Center for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia
3 Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry FEB RAS, Vladivostok, Russia
Objective: to study the effect of transformed fucoidans from the brown alga Fucus evanescens with different chemical structures on the activation of the transcriptional nuclear factor NF-kB. Materials and methods: the study of the specific interaction of fucoidans with Toll receptors (TLR) was carried out on a human embryonic renal epithelium cell line (HEK293) containing a specific TLR, reporter alkaline phosphatase gene SEAP (HEK293h-TLR2 / CD14-NF-kB-SEAP, -TLR4 / CD14-MD2-NF-kB-SEAp) or p-galactosidase (-TLR4 / CD14-MD2-NF-kB). Measurement of the level of enzyme activity of NF-kB was determined by the colorimetric method. The toxic effect of fucoidans was investigated in the MTT test. Results: It was established that the native fucoidan from F. evanescens and its derivatives in the studied concentrations do not affect the control line of HEK293-null1K cells not expressing TLR. When polysaccharides interact with TLR2 and TLR4 on the HEK294 cell line containing alkaline phosphatase, it has been shown that polysaccharides only activate NF-kB at a concentration of 1000 ^g / ml, as indicated by an increase in the expression level of NF-kB-dependent SEAP. The results of the interaction of polysaccharides with TLR-4 on the cell line containing the reporter gene of P-galactosidase indicate that the native fucoidan has the greatest effect, contributing to the activation of NF-kB in a concentration from 10 to 1000 ^g / ml, whereas fucoidan, released from the polyphenol complex and the fraction obtained by enzymatic hydrolysis is from 100 to 100 ^g / ml. An increase in the expression level of NF-kB-dependent P-galactosidase under the action of polysaccharides (concentrations of 100 and 1000 ^g / ml) was comparable to the action of the classical TLR-4 ligand, the E. coli lipopolysaccharide. Conclusions: 1. Fucoidan from the brown alga F. evanescens and transformed derivatives promote the activation of NF-kB, as evidenced by an increase in the expression level of NF-kB-dependent SEAP and NF-kB-dependent P-galactosidase. 2. When specifically interacting with TLR-2, on cell lines containing SEAP, fucoidan (F-3; M.m 51 kDa) from F. evanescens, obtained by enzymatic hydrolysis, has the greatest activating effect. In the case of specific interaction with TLR-4, the native fucoidan (F-1; M.m. 130-430 kDa) from F. evanescens, the composition of which contains the polyphenol complex, has the greatest inducing effect on cell lines containing SEAP or p-galactosidase. monosaccharides (Fuc: Gal: Xyl Xyl).
Key words: fucoidans, brown algae, Toll-like receptors, nuclear transcription factor NF-kB, innate immunity.
For citation: Makarenkova I.D., Tukhvatulin A.I., Ermakova S.P., Logunov D.Yu., Dzharullayeva A.Sh., Erokhova A.S., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N. Influence of fukoidan and transformed derivatives from brown algae Fucus evanescens on activation of Nf-kb transcription nuclear factor. Health. Medical ecology. Science. 2018; 3: 26-33 (in Russia). DOI: 10.5281/zenodo.1489152.
For correspondence: Makarenkova I.D., MD; mail: ilona_m@mail.ru. Conflict of interests. The authors are declaring absence of conflict of interests. Financing. The study was carried out without the involvement of sponsorship.
Введение
Активация Толл-подобных рецепторов (TLR) при взаимодействии с эндо- (DAMP - damage-associated molecular pattern) и экзогенными лигандами (PAMP - pathogen-associated molecular patterns) является важным фактором для реализации эффекторных механизмов врожденного иммунитета против патогенных микроорганизмов различных таксономических групп и решающим фактором для формирования адаптивного иммунного ответа за счет индукции внутриклеточного сигнального каскада, способствующего активации адаптерных молекул, транскрипционных ядерных факторов и экспрессии широкого спектра генов цитокинов [1, 2, 3].
Большой интерес для исследования в качестве потенциальных агонистов/антогонистов TLR и функций врожденного иммунитета представляют иммунобиологические препараты природного происхождения - сульфатированные гетерополисаха-риды морских бурых водорослей и их структурно трансформированные дериваты. Известно, что низкотоксичные сульфатированные полисахариды - фу-коиданы обладают высокой биодеградируемостью и полифункциональным спектром фармакологического действия [4, 5, 6, 7, 8, 9, 10], в связи с чем, изучение механизма их действия и влияния структурных композиций на активацию TLR, будут способствовать направленной индукции иммунных реакций врожденного иммунитета, необходимых для формирования защиты организма.
Цель: изучить влияние различных по химической структуре трансформированных фукоиданов из бурой водоросли Fucus evanescens на активацию транскрипционного ядерного фактора NF-kB.
Материалы и методы:
Фукоиданы
Определение химической структуры сульфатирован-ных полисахаридов, выделенных из бурой водоросли Fucus evanescens проведены в ТИБОХ ДВО РАН с использованием современных методов исследования.
F-1 - нативный фукоидан, содержит комплекс полифенолов (интервал М.м.: 130-430 кДа), Содержание SO3Na составляет 27%, моносахаридный состав представлен Fuc:Gal:Xyl Xyl в соотношении 94,1:3,8:2.1 [8; 11].
F-2 - фукоидан, освобожденный от полифенолов (интервал М.м.: 130-400 кДа). Содержание SO3Na составляет 28,1%, моносахаридный состав представлен Fuc:Gal:Xyl Xyl в соотношении 94,1:3,5:2.1 [12, 13].
F-3 - продукт ферментативного гидролиза фу-коидана (интервал М.м.: 51 кДа), по данным ЯМР-
Received 11.11.18 Accepted 25.11.18
спектроскопии, практически полностью состоит из фукозы и представляет собой регулярный полисахарид следующей структуры: [^-3)-a-L-Fucp(2,4-SO-3)-(1^4)-a-L-Fucp(2-SO-3)-(1^]n, содержание SO3Na - 29,7%, моносахаридный состав представлен Fuc и Gal в соотношении 94,1:3,8:2.1 [14].
Линия клеток HEK293
Изучение способности фукоиданов (концентрация от 1 до 1000 мкг/мл) в условиях in vitro специфически взаимодействовать с TLR проведено на линии эука-риотических клеток эмбрионального почечного эпителия человека HEK293 (HEK293-hTLR2/CD14-NF-kB-SEAP, -hTLR4/CD14-MD2-NF-kB-SEAP), геном которых содержит соответствующие TLR человека (TLR-2, TLR-4), ген SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase - cекретируемая эмбриональная щелочная фосфатаза) или ген фермента ß-галактозидазы (HEK293-hTLR4/CD14-MD2), которые находятся под контролем NF-kB зависимого промоутера для детекции взаимодействия лиганда с соответствующим рецептором. Контролем, подтверждающим специфичность активации рецепторов, являлись клетки HEK293-null 1k, не экспрессирующие TLR. В качестве положительного контроля, подтверждающего функциональность рецепторов, использовали соответствующие лиганды: синтетический диациллипо-пептид - Pam2CSK4 (100 нг/мл, InvivoGen, USA) для TLR2, липополисахарид Escherichia coli (100 нг/мл, Sigma, USA) - TLR4 и TNF-a (10 нг/мл) для контрольной линии клеток HEK293-null 1k.
Колориметрический метод
Клетки сеяли в 96-луночный культуральный планшет из расчета 2,5х104 в 100 мкл культуральной среды. Через 24 часа инкубации при температуре +37°С в 5% С02 инкубаторе, в клетки вносили исследуемые препараты и контроли. Уровень экспрессии ферментативной активности репортерного гена - NF-kB-зависимой SEAP измеряли на следующий день после внесения лигандов колориметрическим методом [15]. Метод основан на определении скорости расщепления бесцветного субстрата нитрофенилфосфа-та динатриевой соли, с образованием окрашенного паранитрофенола. Свежеприготовленный раствор субстрата (4-нитрофенил фосфат гексагидрат дина-триевая соль) в SEAP-буфере (0,5М NaHCO3, 0,5мМ MgCl2, pH 9,8) в концентрации 2 мг/мл, разносили по 150 мкл в каждую лунку нового 96 луночного планшета и добавляли 50 мкл среды с культурой клеток для измерения активности щелочной фосфатазы.
Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 405 нм (0D0, T0). Планшет инкубиро-
вали при 37°С, в течение 10-60 минут (время зависит от скорости развития окраски) и снова измеряли оптическую плотность на спектрофотометре iEMS Reader MF (Thermolabsystems, USA) при длине волны 405 нм (OD1, T1). Уровень активности щелочной фосфатазы рассчитывали по формуле:
ОШ-ШО где Т1-Т0
ЕА - единицы активности щелочной фосфатазы, ODO - оптическая плотность при первом измерении, OD1 - оптическая плотность при последнем измерении,
Т0 - время первого измерения, Т1 - время последнего измерения. Уровень экспрессии репортерного гена NF-kB-зависимой ß-галактозидазы измеряли через 24 часа по скорости расщепления добавляемого неокрашенного субстрата о-нитрофенил^-В-галактопиранозида в окрашенный продукт - орто-нитрофенол. Для этого отбирали культуральную среду из лунок планшета, а затем вносили буфер с субстратом для ß-галактозидазы (1 мМ MgCl2; 0,25 M трис-HCl, pH 7,4; 0,02% NP40; 2 мг/мл о-нитрофенил^-Д-галактопиранозид). Уровень активности ß-галактозидазы измеряли на спектрофотометре iEMS Reader MF (Thermolabsystems, USA) при длине волны 405 нм, по изменению степени окраски субстрата в лунках. МТТ-тест
Токсическое действие фукоиданов, которое может являться причиной неспецифической активации NF-kB и повышения уровня экспрессии ß-галактозидазы определяли с использованием МТТ-теста. Анализ выживаемости клеток проводился согласно стандартной методике. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре, используя фильтры 540 нм и 620 нм. Результаты рассчитывали по формуле Х = 0D620 nm - 0D540 nm, где Х - искомое значение.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью математического пакета «Statistiсa 10».
Результаты исследования
Исследование специфического взаимодействия фукоидана ^-1) из бурой водоросли F. evanescens и его трансформированных дериватов ^-2; F-3) показало, что полисахариды в исследуемых концентрациях от 1 до 1000 мкг/мл не оказывают влияния на контрольную линию клеток НЕК293-пи111К, не экспрессирующую TLR, но содержащую репор-терный ген щелочной фосфатазы - SEAP. Достоверность результатов подтверждается активацией транскрипционного ядерного фактора под действием классического лиганда - ТОТ-а, который взаимодействуя с собственным ТОТ-рецептором на поверхности клеток, активирует ядерный фактор ОТ-кВ, инициируя SEAP (5,88±0,02 ЕА -единица активности).
При взаимодействии фукоиданов с TLR-2 установлено (рис. 1), что только в концентрации 1000 мкг/мл полисахариды способствуют активации ядерного фактора NF-kB, о чем свидетельствует увеличение уровня экспрессии NF-kB-зависимого репортерного гена SEAP (секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы) в клетках НЕК293^1ЪЯ2^14-ОТ-кВ^ЕАР (Б-1: 1,49±0,04; F-2: 1,22±0,03; F-3: 1,77±0,07 ЕА) по сравнению с контролем (1,0±0,02). Наибольшим действием обладал фукоидан F-3. Активация NF-kB, подтверждающая функциональность рецептора при взаимодействии с диациллипопептидом (положительный контроль) составила 3,4±0,05 ЕА.
Аналогичные результаты получены и при взаимодействии фукоиданов с TLR-4 на клеточной линии HEK293-hTLR4/CD14-MD2-NF-kB-SEAP (рис. 2). Увеличение экспрессии индуцибельного репортер-ного гена под действием полисахаридов установлено только в концентрации 1000 мкг/мл. Следует
Рис. 1. Активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB-SEAP при взаимодействии фукоиданов с Т1^-2 Примечание: OD - оптическая плотность; К(-) - клетки линии НЕК293, содержащие репортерный ген SEAP, Т1^2 и адаптерную молекулу CD14; К(+) Pam2CSK4 - синететический диациллипопептид (100 нг/мл).
отметить, что наибольшей активностью обладал нативный фукоидан F-1 (1,7±0,04 ЕА), фукоиданы F2 и F-3 практически не различались по спектру действия (1,44±0,03 и 1,5±0,07, соответственно). Действие липополисахарида (положительный контроль), подтверждающее функциональность рецептора составило 2,7±0,05 ЕА.
Для исключения возможности неспецифической активации NF-kB при взаимодействии различных по химической структуре дериватов из бурой водоросли Е evanescens с TLR-2 было проведено исследование их токсического действия на клетки линии HEK293hTLR2/CD14-NF-kB-SEAP (рис. 3). Установлено, что полисахариды в исследуемых концентрациях не оказывают выраженного токсического действия на культуру эукариотических клеток, что подтверждает их специфическое взаимодействие с рецептором.
Результаты взаимодействия полисахаридов с TLR-4 на клеточной линии HEK294-hTLR4-CD14-MD2, содержащий репорторный ген NF-kB-зависимой ß-галактозидазы свидетельствуют (рис. 4), что наибольшим действием обладает нативный фукоидан (F-1), способствующий активации NF-kB в концентрации от 10 до 1000 мкг/мл (1,32±0,04; 1,57±0,07 и 1,83±0,06 ЕА, соответственно), тогда как фукоидан, освобожденный от комплекса полифенолов (F-2) и фракция, полученная путем ферментативного гидролиза - от 100 до 100 мкг/мл. Увеличение уровня экспрессии ß-галактозидазы под действием фукоидана F-2 составило 1,39±0,07 и 1,58±0,028, а под влиянием фракции F-3 - 1,55±0,02 и 1,49±0,04 ЕА по сравнению с контролем (1±0,04 ЕА). Следует отметить, что влияние фукоиданов (концентрация 100 и 1000 мкг/мл) на активацию NF-kB было сопоставимо с действием классического лиганда TLR-4 -липополисахарида E.coli (1,6±0,5 ЕА).
Рис. 2. Активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB-SEAP при взаимодействии фукоиданов с TLR-4 Примечание: OD - оптическая плотность; К (-) - клетки линии HEK293, содержащие репортерный ген SEAP, TLR4 и адаптерную молекулу CD14 и белок MD-2; К (+) LPS - липополисахарид E. coli (100 нг/мл)
Рис. 3. Исследование токсического действия фукоиданов на линии клеток HEK293hTLR2/CD14-NF-kB-SEAP Примечание: OD - разность оптической плотности (540-620 нм); К (-) - клетки линии НЕК293, содержащие репортерный ген SEAP,
TLR2 и адаптерную молекулу CD14.
Рис. 4. Активация транскрипционного ядерного фактора NF-kB при взаимодействии фукоиданов с TLR4 Примечание: OD - оптическая плотность; К (-) - клетки линии HEK293, содержащие в своем геноме репортерный ген ß-галактозидазы, комплекс TLR4 с адаптерной молекулой CD14 и белком MD-2; К (+) LPS - липополисахарид E. coli (100 нг/мл)
Обсуждение
Toll-подобные рецепторы, расположенные на иммунокомпетентных клетках врожденного иммунитета в виде гомо- и гетеродимеров, не только выполняют сенсорную функцию PAMPs патогенных микроорганизмов или DAMP, но и способствуют развитию иммунного ответа через инициацию внутриклеточного сигнального каскада, активацией транскрипционного фактора NF-kB, что приводит к экспрессии различных генов цитокинов.
Важной задачей в исследовании механизмов активации TLR, является идентификация и исследование специфических лигандов для конкретного рецептора. Полученные нами результаты демонстрируют, что фукоидан из бурой водоросли F. evanescens и продукты его ферментативной трансформации способствуют активации ядерного фактора NF-kB, о чем свидетельствует увеличение уровня экспрессии репортерных генов щелочной фосфата-зы и Р-галактозидазы.
Активация TLR2-NF-kB через MyD88 сигнальный путь, индуцирует экспрессию широкого спектра генов провоспалительных цитокинов, тогда как активация TLR4-NF-kB, через адаптерную молекулу MyD88 и адаптерную пару TRIF/TRAM способствует эксперссии как провоспалитеьных цитокинов (MyD88 сигнальный путь), так и IFN-индуцибельных генов (TRIF/TRAM). В свою очередь, эти биохимические процессы приводят к диф-ференцировке и активации иммунокомпетентных клеток врожденного иммунитета, а также являются решающим фактором для формирования адаптивного иммунного ответа по Th-1 [1, 2, 3].
В последнее десятилетие, внимание исследователей направлено на изучение различных по структуре иммунобиологических препаратов, потенциальных модификаторов эффекторных функций врожденного иммунитета. Изучение их химического строения
и механизма действия создают научную основу для разработки лекарств нового поколения [4]. Среди природных иммуномодуляторов, особый интерес представляют водорастворимые, высоко- и низкосульфа-тированные полисахариды - фукоиданы из морских бурых водорослей, обладающие уникальной химической структурой и широким спектром биологической активности, включая иммуномодулирующее, противо-вриусное, антибактериальное, провоспалительное и противоопухолевое действие [4, 6, 9-15].
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что несмотря на различия в химической структуре, трансформированные дериваты и фукоидан из бурой водоросли Е evanescens через активацию ядерного фактора NF-kB способны индуцировать развитие генетически детерминированных биохимических процессов, направленных на активацию клеток-эффекторов врожденного иммунитета для формирования защиты организма от патогенов различных таксономических групп.
Выводы
1. Фукоидан из бурой водоросли Е. evanescens и трансформированные дериваты способствуют активации NF-kB, о чем свидетельствует увеличение уровня экспрессии ОТ-кВ-зависимой SEAP и ОТ-кВ-зависимой Р-галактозидазы.
2. При специфическом взаимодействии с TLR-2, на линии клеток, содержащих SEAP, наибольшим активирующим действием обладает фукоидан ^-3; М.м. 51 кДа) из Е. evanescens, полученный путем ферментативного гидролиза.
3. При специфическом взаимодействии с TLR-4, на линии клеток, содержащих SEAP или Р-галакто-зидазу наибольшим индуцирующим действием обладает нативный фукоидан ^-1; М.м. 130-430 кДа) из Е evanescens, в состав которого входит по-лифенольный комплекс и моносахариды ^ис: Gal:Xyl Ху1).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено без привлечения спонсорских средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Тухватулин А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Гудков А.В., Гинц-бург А.Л. Toll-подобные рецептор и их адапторные молекулы // Биохимия. 2010; 75(9): 1224-1243.
2. Тухватулин А.И., Щербинин Д.Н., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Народицкий Б.С. Роль паттерн-распоз-нающих рецепторов в противоинфекционном иммунитете // Вестник Российской академии медицинских наук. 2011; 10: 47-54.
3. Dowling J.K., Mansell. A. Toll-like receptors: the swiss army knife of immunity and vaccine development //Clinical & Translational Immunology. 2016; 5: e85; doi:10.1038/cti.2016.22.
4. Фукоиданы - сульфатированные полисахариды бурых водорослей. Структура. Ферментативная трансформация и биологические свойства. Дальнау-ка; 2014; 379 с.
5. Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С., Персиянова Е.В., Хотимченко Ю.С., Беседнова Н.Н. Перспективы использования сульфатированных полисахаридов бурых водорослей как вакцинных адъювантов // Биология моря. 2016; 42(6): 399-406, doi:10.1134/ S1063074016060055.
6. Fitton J.H. Therapies from fucoidan; multifunctional marine polymers // Mar. Drugs. 2011; 9: 17311760, doi: 10.3390/md9101731.
7. Fitton J.H., Stringer D.N., Karpiniec S.S. Therapies from fucoidan: an update // Mar. Drugs. 2015; 13: 5920-5946, doi: 10.3390/md13095920.
8. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Dmitrenok P.S., Zvyagintseva T.N. Structural similarities of fucoidans from brown algae Silvetia babingtonii and Fucus evanescens, determined by tandem MALDI-TOF mass spectrometry // Carbohydrate Research. 2012; 358: 78-81, doi: 10.1016/j.carres.2012.06.015.
9. Zaporozhets T.S., Besednova N.N., Kuznetsova T.A., Zvyagintseva T.N., Makarenkova I.D., Kryzhanov-
sky S.P., Melnikov V.G. The prebiotic potential of poly-saccharides and extracts of seaweeds // Russian Journal of Marine Biology. 2014; 40(1):1-9, doi: 10.1134/ S1063074014010106.
10. Lebedynskaya E.A., Makarenkova I.D., Lebe-dynskaya O.V., Akhmatova N.K., Zvyagintseva TN. Effect of sulfated polysaccharides from brown seaweed Laminaria japonica on the morfology of lymfoid organs and functional characteristics of immunocompe-tent cells // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2015; 9(1): 86-94, doi: 10.1134%2FS1990750815010060.
11. Menshova R.V., Shevchenko N.M., Imbs T.I., Zvyagintseva T.N., Malyarenko O.S., Zaporoshets T.S., Besednova N.N., Ermakova S.P. Fucoidans from brown alga Fucus evanescens: structure and biological activity // Frontiers in Marine Science, doi: 10.3389/ fmars.2016.00129.
12. Malyarenko O. S., Usoltseva R V., Shevchenko N. M., Isakov V. V., Zvyagintseva T. N., Ermakova S. P. In vitro anticancer activity of the laminarans from Far Eastern brown seaweeds and their sulfated derivatives // Journal of Applied Phycology. 2017; 29(1): 545-553.
13. Imbs T.I., Skriptsova A.V., Zvyagintseva T.N. Antioxidant activity of fucoise-containing sulfated poly-saccharides obtained from Fucus evanescens by different extraction methods // Journal of Applied Phycology. 2015. 27(1):45-553, doi:10.1007/s10811-014-0293-7.
14. Silchenko A.S., Ustyuzhanina N.E., Kusaykin M.I., Krylov V.B., Shashkov A.S., Dmitrenok A.S., Usoltseva R.V., Zueva A.O., Nifantiev N.E., Zvyagintseva T.N. Expression and biochemical characterization and substrate specificity of the fucoidanase from Formosa algae // Glycobiology. 2017; 27(3): 254-263.
15. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemicheva N.M., Burdelya L.G., Shmarov M.M., Naroditsky B.S., Gudkov A.V., Gintsburg A.L., Logunov D.Y. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and NOD1 strongly potentiates activity of NF-kB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection // Infect Immun. 2013; 81(10):3855-64, doi: 10.1128/IAI.00525-13.
Сведения об авторах
Макаренкова Илона Дамировна - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1; Тел.: +8(423) 244-2734; e-mail: ilona_m@mail.ru);
Тухватулин Амир Ильдарович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатории клеточной микробиологии НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; Тел.: 7(499) 190-76-11; e-mail amir_tuhvatulin@yahoo.com);
Ермакова Светлана Павловна - доктор химических наук, заведующая лабораторией химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН (690022, г. Владивосток, ул. Пр. 100-лет Владивостоку, 159; Тел.: +8(423) 231-07-05, e-mail: swetlana_e@mail.ru);
Логунов Денис Юрьевич - док. биол. наук, член-корр. РАН, заведующий лабораторией клеточной микробиологии НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; Тел.: 8(499) 190-76-11, ldenisy@yahoo.com);
Джаруллаева Алина Шахмировна - научный сотрудник, лаборатории клеточной микробиологии НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; Тел.: 7(499) 190-76-11; e-mail alina-dzharullaeva@ya.ru);
Ерохова Алина Сергеевна - младший научный сотрудник, лаборатории клеточной микробиологии ФГБУ «НЩЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; Тел.: 7(499) 190-76-11; e-mail erohova.alina95@gmail.com);
Беседнова Наталия Николаевна - академик РАН, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова (690087, г. Владивосток, ул. Сельская, 1; Тел.: 8(423) 244-14-38; e-mail: besednoff_lev@mail.ru);
Звягинцева Татьяна Николаевна - доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН (690022, г. Владивосток, ул. Пр. 100-лет Владивостоку, 159; Тел.: 8(423) 231-07-05, e-mail: zvyag@piboc.dvo.ru).
© Коллектив авторов, 2018 г DOI: 10.5281/zenodo.1488034
Удк 57.088
РВ. Ромашко12, А.М. Захаренко2, Т.А. Ефимов1, Б.Г. Андрюков3
функционализация поверхности биосенсора на основе кремниевого кантилевера для детектирования концентрации биологических молекул
1 Институт автоматики и процессов управления (ИАПУ) Дальневосточного отделения российской академии наук (ДВО РАН), Владивосток
2 Дальневосточный федеральный университет (ДВФУ), Владивосток
3 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (НИИЭМ) имени Г.П. Сомова, Владивосток
В настоящей работе представлен метод функционализации кремниевого кантилевера, который может быть использован для создания биосенсора для измерения концентрации биологических молекул в жидких средах. Чувствительность биосенсора к биологическим молекулам достигается за счет присоединения к поверхности кантилевера слоя молекул БСА (бычий сывороточный альбумин), для закрепления которых на кантилевер наносится слой золота и активируется раствором NHS-EDC (N-гидроксисукцинимид + 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид). Связывание молекул, с кантилевером приводит к изменению его резонансной частоты. По изменению резонансной часты определяется масса присоединенных молекул и концентрация молекул в исследуемом растворе.
Ключевые слова: биосенсор, кантилевер, адаптивный интерферометр, биомолекулы. Для цитирования: Ромашко Р.В., Захаренко А.М., ЕфимовТ.А., Андрюков Б.Г. Функционализация поверхности биосенсора на основе кремниевого кантилевера для детектирования концентрации биологических молекул // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2018; 3: 33-35. DOI: 10.5281/zenodo.1488034.
Для корреспонденции: Ромашко Р.В., e-mail: romashko@iacp.dvo.ru.
Поступила 05.11.18
R.V. Romashko12, A.M. Zakharenko2, T.A. Efimov1, B.G. Andryukov3 FUNCTIONALIZATION OF THE SURFACE OF A BIOSENSOR BASED ON A SILICON CANTILEVER FOR DETECTING THE CONCENTRATION OF BIOLOGICAL MOLECULES
1 Institute of Automation and Control Processes (IACI) of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences (FEB RAS), Vladivostok, Russia
2 Far Eastern Federal University (FEFU), Vladivostok, Russia
3 Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology (RIEM), Vladivostok, Russia
In this paper, we present a method for the functionalization of a silicon cantilever, which can be used to create a sensor for measuring the concentration of biological molecules in liquid medium. A sensitive layer of the cantilever is BSA molecules (Bovine Serum Albumin), absorbed on gold layer deposited in vacuum. The gold layer was activated with a solution of NHS-EDC (N-hydroxysuccinimide + 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) previously. Binding of molecules with a cantilever leads to a change in its resonance frequency measured by an adaptive interferometer. The mass of the attached molecules and the concentration of the solution are determined by changing the resonance frequency.
Keywords: cantilever, biosensor, adaptive interferometer, biomolecules.
