CC BY
42
УДК 543.05:543.544.5
ЦВЕТОМЕТРИЧЕСКОЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ТЕТРАЦИКЛИНА И ДОКСИЦИКЛИНА В МОЛОКЕ
И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ ПОСЛЕ СОРБЦИОННОГО
КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ НА ХИМИЧЕСКИ
МОДИФИЦИРОВАННОМ АЛЮМОСИЛИКАТЕ
Э.Р. Оскотская*, Е.Н. Грибанов, М.Н. Калинин, Е.В. Митяева, Е.В. Панферова
(Орловский государственный университет; *e-mail: osckotskaya@yandex.ru)
Разработана методика цветометрического и тест-определения тетрациклина и док-сициклина по реакции с железом(Ш) на поверхности химически модифицированного алюмосиликата. Достоинством методики является экспрессность, простота исполнения, экономическая доступность и хорошие метрологические характеристики. Методика может быть использована в практике лабораторий химического анализа пищевых продуктов.
Ключевые слова: тетрациклин, доксициклин, алюмосиликат, цветометрия, молоко и молочные продукты.
Расширение спектра объектов химического анализа (пищевые продукты, лекарственные препараты, биологические жидкости, объекты окружающей среды и т.д.), а также многообразие определяемых в них аналитов приводит к значительному увеличению числа анализируемых проб. В связи с этим актуальным является проведение скрининга - предварительного анализа проб экспрессным, доступным, дешевым и простым методом с возможностью проведения дальнейшего химического анализа при положительном результате определения аналита [1]. Скрининг приобретает особое значение при контроле содержания антибактериальных препаратов, которые нашли широкое применения в пищевой промышленности, в животноводстве и ветеринарии в качестве ингибиторов патогенной микрофлоры [2-4]. Данная группа веществ вызывает ряд негативных эффектов (аллергические реакции, дисбактериоз, подавление активности некоторых ферментов, изменение микрофлоры кишечника и т. д.) при поступлении в организм человека в дозах, превышающих ПДК [5, 6]. Среди препаратов данной группы ведущую роль играют тетрациклиновые антибиотики (тетрациклин, доксициклин) - более 75% всех случаев применения [7].
Известны разные методы количественного определения антибиотиков тетрациклинового ряда: фотометрический [8, 9], ВЭЖХ с масс-спектрометрическим или УФ-детектированием [10, 11], иммуноферментный анализ [12]. К их недостаткам можно отнести сложность, низкую
чувствительность и высокую стоимость проведения анализа.
Цель настоящей работы состояла в разработке полуколичественной (тест) и количественной (цветометрия) методик определения следов тетрациклина и доксициклина в продуктах питания (молоко и молочные продукты), пригодных для проведения скрининга большого числа проб.
Экспериментальная часть
Реагенты и аппаратура. Исходные маточные растворы тетрациклина, доксициклина и Ре(Ш) с концентрацией 0,5 мг/мл готовили растворением точных навесок фармацевтических препаратов или соли металла в бидистиллиро-ванной воде. Рабочие растворы готовили разбавлением исходных растворов непосредственно перед использованием. Необходимые значения рН устанавливали добавлением ацетатного буферного раствора.
Все использованные в работе реактивы относятся к подгруппам чистоты «х.ч.» и «ч.д.а.». Для хроматографирования применяли ацетонитрил для ВЭЖХ.
В качестве сорбционного материала использовали синтетический алюмосиликат типа НаХ, полученный по методике [13]. Его идентифицировали по соответствию ИК-спектра стандартному из базы данных.
Кислотность среды измеряли рН-метром «Ио-номер И-500» с точностью измерения ±0,05 ед. рН. Концентрацию тетрациклина и доксици-клина в растворе после сорбции контролиро-
вали хроматографическим способом. В работе использовали жидкостной микроколоночный хроматограф «Милихром-6» с УФ-детектором. Разделение проводили в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Использовали хроматографиче-скую колонку КАХ-6-80-4 (сорбент Сепарон-С18; 80x2,0 мм). Колонку термостатировали при 35 °С. Математическая обработка хроматограмм осуществлялась в программе ИшСгош. В качестве подвижной фазы использовали смеси на основе ацетонитрила и 0,025 М водного раствора окса-лата аммония. Концентрацию Ре(Ш) в растворе после сорбции контролировали спектрофотоме-трически (спектрофотометр «СФ-56») с использованием салициловой кислоты при оптимальных условиях определения (520 нм, рН 2,6-2,8) [14]. Растворы перемешивали на магнитных мешалках «ПЭ-6100». Для центрифугирования применяли лабораторную центрифугу «ОПн-8».
Методика эксперимента. Сорбцию Ре(Ш), тетрациклина и доксициклина из водных растворов изучали в статических условиях методом ограниченного объема при периодическом перемешивании. Определение оптимальных условий сорбции проводили в растворах объемом 25 мл, содержащих 32 мкг антибиотика или 300 мкг Ре(Ш) и 0,1 г сорбента. Из зависимости Я,%-рН, где Я - степень сорбции, находили оптимальный интервал рН протекания процесса. Величину СЕС определяли как число молей аналита, сорбированного 1 г алюмосиликата, в определенных ранее оптимальных условиях.
Оптимальные настройки цифрового фотоде-тектирующего устройства (ЦФУ) - фотоаппарата (время экспонирования, использование различных комбинаций осветительных приборов: лампа - вспышка, вспышка, лампа), при которых наблюдается максимальная чувствительность при определении тетрациклина или доксицикли-на по реакции с Ре(Ш) на поверхности сорбента, находили экспериментально. Для этого готовили серию растворов, содержащих разное количество тетрациклина или доксициклина (от 0 до 400 мкг в пробе). Устанавливали оптимальную кислотность сорбции антибиотика алюмосиликатом и пропускали раствор через слой сорбента (0,3 г) в сорбционном патроне (диаметр 3 мм) со скоростью ~2 мл/мин. Далее патрон с исследуемым раствором помещали в держатель (схема экспериментальной установки использовалась нами ранее [15]), перпендикулярно устанавливали объектив цифрового фотоаппарата, сопряженный с персональным компьютером. Светосила и глубина резкости, определяемая диафрагмой
объектива в цифровом фотоаппарате во всех опытах постоянна (диафрагма 36). Управление ЦФУ и характеристиками фотосъемки осуществлялось программными средствами. Для устранения артефактов, связанных с неоднородностью плотности светового потока, эксперимент проводили в светонепроницаемой камере. В качестве осветительного элемента использовали вакуумные лампы накаливания мощностью 60 Вт и цветовой температурой 3300 К, а также фотовспышку «Canon Speedlite 430EX» c цветовой температурой 6500 К.
Полученный массив цифровых изображений анализировали с помощью программы Adobe Photoshop CS4 (определяли интенсивность компонент цветности в системе RGB) [16]. По полученным данным строили зависимость интенсивности компоненты цвета от содержания антибиотика.
Результаты и их обсуждение
Качественной реакцией на антибиотики те-трациклинового ряда является образование окрашенного комплекса с Fe(III), имеющего красный цвет. Нами предложен способ проведения реакции взаимодействия тетрациклина и доксициклина с Fe(III) на поверхности матрицы-носителя, что существенно повышает чувствительность регистрации аналитического сигнала за счет эффекта концентрирования.
Матрицей для химического модифицирования железом служил синтетический алюмосиликат типа NaX. Выбор данного материала обусловлен простотой его получения, высокими сорбционными свойствами, дешевизной и хорошими цветометри-ческими характеристиками (порошок белого цвета, что является важным при визуальной и инструментальной фиксации изменения характеристик цветности материала). Для определения оптимальных условий иммобилизации Fe(III) на матрице-носителе изучена сорбция металла алюмосиликатом.
Сорбция железа(Ш) синтетическим алюмосиликатом. Количественное извлечение железа (R > 95%) алюмосиликатом происходит в статических условиях в интервале значений рН 4,5-6,3 при 20±1 °С в течение 5-10 мин. Оптимальные значения рН и времени находили графическим способом (рис. 1, 2). При pH > 6,4-6,5 для водных растворов железа(Ш) с изучаемой концентрацией наблюдается гидролиз.
Сорбционная емкость материала по железу(Ш) в оптимальных условиях кислотности среды составляет ~0,23 ммоль/г. Коэффициенты распределения в системе алюмосиликат-железо при концентрации аналита до 2,4 10-4 г/мл и оптимальных условиях сорбции достигают ~2,5 104.
4 5 6 7
рН
Рис. 1. Влияние кислотности среды на степень сорбции Ре(Ш) алюмосиликатом. Звездочкой (*) отмечено начало гидролиза
60 4020-
0 10 20 30 40 50 60
/, мин
Рис. 2. Влияние времени на степень сорбции Ре(Ш) алюмосиликатом
Сорбция тетрациклина и доксициклина химически модифицированным алюмосиликатом (ХМА). Количественное извлечение тетрациклина и доксициклина (Я > 95%) химически модифицированным алюмосиликатом происходит в статических условиях в интервале значений рН 2,3-3,4 при 20±1°С в течение 15-20 мин (рис. 3, 4).
Сорбционная емкость по тетрациклину и док-сициклину в оптимальных условиях кислотности среды составляет ~0,21 и ~0,19 ммоль/г соответственно. Коэффициенты распределения в системе сорбент-антибиотик при концентрации аналита до 2,010-4 г/мл и оптимальных условиях сорбции достигают ~1104.
В основе сорбции лежит комплексообразова-ние антибиотиков с железом, входящим в состав минерала. На это указывают следующие факторы: появление характерной окраски на поверхности ХМА; соотношение компонентов в системе железо-антибиотик, равное 1:1; изотерма сорбции (изотерма Лэнгмюра) имеет выпуклую форму с выходом на насыщение (рис. 5); для тетрациклина и доксициклина найденные константы устойчивости комплексов на поверхности сорбента (^Р « 7,1) хорошо согласуются с константами устойчивости комплекса в растворе.
70 ч ' ' ' ' ' ' ' ' 1 0123456 789
рН
Рис. 3. Влияние кислотности среды на степень сорбции тетрациклина (1) и доксициклина (2) ХМА
100-1 1
4020
0-1-.-.-.-I-.-1
О 10 20 30 40 50 60
г, мин
Рис. 4. Влияние времени на степень сорбции тетрациклина (1 ) и доксициклина (2) ХМА
Цветометрическое детектирование аналитического сигнала. Высокий уровень развития техники и программного обеспечения для получения и обработки цифрового изображения обусловил внедрение в аналитическую практику устройств, совмещенных с компьютером, видеосигнал от которого используется в качестве аналитического [17, 18]. Мгновенные значения видеосигнала несут информацию о цвете и интенсивности цвета изучаемого объекта в зависимости от концентрации в нем определяемого вещества.
Нами изучено влияние суммарного содержания тетрациклина и доксициклина в пробе на интенсивность компоненты цвета аналитического сигнала ЦФУ. Для данного цветного теста на рис. 6 приведены зависимости изменения среднего значения цветности 1Я, 1О, 1в на поверхности химически модифицированного железом(Ш) алюмосиликата от содержания антибиотика в пробе, где 1Я, 1О,1в - интенсивность цветности Я (красный), О
Рис. 5. Изотермы сорбции тетрациклина (1) и доксици-клина (2) ХМА
Рис. 6. Зависимость 11 от содержания тетрациклина или доксициклина в водных растворах (выдержка 1/10; источник освещения: лампа, вспышка)
(зеленый) и B (синий) компонент соответственно в цветовой модели RGB.
Характер зависимости интенсивности I компоненты цвета от содержания антибиотика линеен. Для синей (B) компоненты изменение содержания антибиотика в растворах оказывает слабое влияние на величину IB, что отражает разница между максимальным и минимальным значениями показателя цветности (Д! < 20 о.е.). Для красной и зеленой компонент в зависимости от концентрации антибиотика выражены два участка: первый с содержанием антибиотика 0-50 мкг в пробе (Д^(макс) ~ 43 о.е., MG (макс) ~ 54 о.е.; второй с содержанием антибиотика 20-400 мкг в пробе (Д! ~ 30 о.е.).
Результаты определения плотности цветового потока зеленой компоненты в зависимости от условий фотосъемки представлены в табл. 1, откуда следует, что для реакции тетрациклина и доксициклина с железом(Ш) на поверхности алюмосиликата наиболее подходящей по метрологическим характеристикам является градуи-ровочная зависимость компоненты IG при включенных источниках света (вспышка, лампа), выдержкой экспонирования 1/10 и в диапазоне определяемых концентраций аналита в пробе до 50 мкг.
Выполнение цветометрического и тест-определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах
Первая стадия определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах включает пробоподготовку - удаление из пробы белков и молочного жира. Для этого в 100250 мл анализируемого продукта вносят 2-3 мл концентрированной уксусной кислоты и термо-статируют при 40-45 °С в течение 5-10 мин. Не рекомендуется вести процесс при температуре выше 55-60 °С, так как это может вызвать частичную деструкцию тетрациклина. Далее пробу перемешивают и центрифугируют 5-7 мин при 3000-5000 об/мин. Центрифугат переносят в колбу, доводят кислотность среды до pH ~2,5 азотной кислотой (5 М) и добавляют 25 мл ацетатного буферного раствора (рН 2,50).
Вторая стадия - сорбция антибиотика. Полученный центрифугат пропускают со скоростью ~2,0 мл/мин через сорбционный патрон, который наполнен синтетическим алюмосиликатом, химически модифицированным железом(Ш).
Третья стадия - цветометрическое или тест-определение аналитов. Поверхность материала в сорбционном патроне анализируют сразу после
Т а б л и ц а 1
Градуировочные зависимости для IG в системе RGB от концентрации антибиотика, значения выдержки и освещения (n = 3, P = 0,95)
Условия определения [Антибиотик], мкг/проба Градуировочное уравнение r* A/g, о.е.
Свет, вспышка, выдержка 1/10 0-50 /G = -1,350-С + 186,18 0,98 53,9
50-400 /G = -0,078-С + 131,71 0,84 24,2
Свет, вспышка, выдержка 1/30 0-50 /G = -1,299- C + 22,92 0,97 53,6
50-400 /G = -0,060C + 72,66 0,77 16,0
Свет, вспышка, выдержка 1/60 0-50 1G = -1,179C +87,00 0,98 49,7
50-400 1G = -0,048C + 43,91 0,85 13,5
Свет, вспышка, выдержка 1/80 0-50 1G = -1,0413C + 4,97 0,97 43,9
50-400 /G = -0,036C + 36,02 0,76 9,1
Свет, вспышка, выдержка 1/160 0-50 1G = -0,638C + 43,19 0,97 27,0
50-400 1G = -0,017C + 18,71 0,80 4,6
Свет, вспышка, выдержка 1/200 0-50 1G = -0,511^C + 34,44 0,98 21,5
50-400 1G = -0,013 •C + 14,99 0,87 3,9
*r - коэффициент корреляции.
Т а б л и ц а 2
Результаты определения тетрациклина и доксициклина в молоке (^пробы = 100 мл, n = 5, P = 0,95)
Введено антибиотика, мкг/мл Результаты визуального детектирования в пробе (присутствие/отсутствие) Найдено после цветометрического детектирования, мкг/мл
0,000 отсутствует - -
0,040 присутствует/отсутствует 0,055±0,013 0,19
0,080 присутствует 0,082±0,012 0,13
0,160 присутствует 0,176±0,019 0,09
0,480 присутствует 0,468±0,039 0,07
пропускания пробы: а) визуальным полуколичественным методом, сравнивая с заранее построенной тест-шкалой; б) цветометрическим методом путем обработки сигнала ЦФУ.
Правильность разработанной методики цвето-метрического или тест-определения тетрациклина и доксициклина после предварительного сорб-ционного концентрирования проверена методом «введено-найдено» на образцах молока и молочных продуктов (табл. 2). В табл. 2 приведены результаты определения антибиотика в модельном
растворе - образце молока, не содержащего ана-литы (по данным методики [12]). Анализ метрологических характеристик способа определения тетрациклина и доксициклина в молоке и молочных продуктах показывает достаточно высокую чувствительность. Предел определения тетрациклина и доксициклина по предлагаемой методике составляет 4 мкг в пробе.
Таким образом, предлагаемый способ полуколичественного (тест) и количественного (цветоме-трия) определения тетрациклина и доксициклина
в молоке и молочных продуктах, включающий стадию предварительного сорбционного концентрирования антибиотиков на поверхности синтетического алюмосиликата химически модифицированного Ре(Ш) с образованием окрашенного комплекса, позволяет проводить предварительный
Работа выполнена в рамках государственного
№ госрегистраци
скрининг проб молока и молочных продуктов. Способ отличается экспрессностью, простотой исполнения и экономичностью, не требует применения дорогостоящего оборудования. Он может быть использован в практике лабораторий, осуществляющих химический анализ пищевых продуктов.
задания Министерства образования и науки РФ, и 114120507803.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа. М., 2002. 304 с.
2. Романенко Г.А. // Вестн. РАН. 2004. № 5. С. 434.
3. Аксенов В.И., Ковалев В.Ф. Антибиотики в продуктах животноводства. М., 1977.
4. Брандер Дж.К. Антибиотики и антибиоз в сельском хозяйстве. М., 1981.
5. Мелентьева Г.А., Антонова Л.А. Фармацевтическая химия. М., 1993.
6. Воробьева Т.В. Влияние на организм антибиотических примесей, обнаруживаемых в продуктах питания животного происхождения // Рациональное питание: Сб. науч. тр. Вып. 15. Киев, 1980. С. 56.
7. Кальницкая О.И. Автореф. дис. ... докт. ветерин. наук. М., 2008.
8. Соловей Н.В., Сааведра Н.Ф. // Фармация. 1974. Т. 23. № 4. С. 72.
9. Соболева О.Н. Способ определения тетрациклина: А.С. 8И 1081487 А1; заявл. 1982.08.02; опубл. 1984.03.23.
10. ГОСТ Р53601-2009. Метод определения остаточного
содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором.
11. Оскотская Э.Р., Грибанов Е.Н., Калинин М.Н. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2014. Т. 55. № 5. С. 296.
12. ГОСТ Р53774-2010. Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные методы определения наличия антибиотиков.
13. Казанцева Л.К. Способ получения цеолита типа МаА или МаХ (варианты). Пат. ЯИ 2452688 С1.
14. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М., 1971.
15. Басаргин Н. Н., Оскотская Э. Р., Грибанов Е. Н., Кузнецов Е. В. // Журн. аналит. хим. 2012. Т. 67. № 1. С. 38 .
16. Джадд Д., Вышецки Г. Цвет в науке и технике. М., 1978.
17. Иванов В.М., Кузнецова О.В. // Успехи химии. 2001. Т. 70. № 5. С. 411.
18. Мурынов А.И., Хаба Б.С. // Вестн. ИжГТУ. 2002. № 3. С. 96.
Поступила в редакцию 21.05.15
COLORIMETRIC AND TEST-DETERMINATION OF TETRACYCLINE AND DOXYCYCLINE IN MILK AND MILK PRODUCTS AFTER SORPTION CONCENTRATION AT CHEMICALLY MODIFIED ALUMINOSILICATE
E.R. Osckotskaya*, E.N. Gribanov, M.N. Kalinin, E.V. Mitayeva, E.V. Panferova
(OrelState University; *e-mail: osckotskaya@yandex.ru)
The technique of colorimetric and test-determination of tetracycline and doxycycline by reaction with iron(III) on the surface of chemically modified aluminosilicate was developed. The advantage of the technique is the rapidity, ease of performance, affordability and good metrological characteristics. The method can be used in the practice of laboratories performing chemical analysis of foodstuffs.
Key words: tetracycline, doxycycline, aluminosilicate, colorimetry, milk and milk products.
Сведения об авторах: Оскотская Эмма Рафаиловна - зав. кафедрой химии Орловского государственного университета, профессор, докт. хим. наук (osckotskaya@yandex.ru); Грибанов Евгений Николаевич - доцент кафедры химии Орловского государственного университета, канд. хим. наук (gribanovEN@gmail.com); Калинин Максим Николаевич - магистрант кафедры химии факультета естественных наук Орловского государственного университета; Митяева Екатерина Вячеславовна - студент Медицинского факультета Орловского государственного университета; Панферова Елена Викторовна - студент кафедры химии факультета естественных наук Орловского государственного университета.
