CC BY
2
УДК 615.285.7.099.015.44
М. В. Малышева ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПЕСТИЦИДА РОМУЦИДА
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Исследования на клеточных культурах проведены в целях установления токсичности на уровне клетки фунгицид-ного препарата ромуцида (диэтиловый эфир л-нитрофенил-гидразономезоксалевой кислоты), предназначенного для борьбы с мучнисто-росяными грибами. Препарат растворяется в спирте, ацетоне, бензоле, ксилоле, нерастворим в воде.
Объектом воздействия ромуцида служили перевиваемые культуры линии СаОУ и Нер-2, поддерживаемые в моно-слойной культуре на средах 199 и Игла с сывороткой крупного рогатого скота
Обе культуры являются клетками опухоли человека: СаОУ — карциномы яичника, Нер-2 — карциномы гортани.
Изучение кинетики клеточной пролиферации осуществляли в пенициллиновых флаконах путем посева 2105 клеток в 2 мл среды 199 с 10 % сыворотки. Через сутки проводили замену среды 199 на среду Игла с глутамином, в которой был растворен исследуемый пестицид в концентрациях от 0,01 до 100 мкг/мл.
Через сутки после посева и в каждый последующий ♦^ЯЯрнь 5—10 флаконов промывали раствором Версена для отслаивания клеток и подсчитывали их число на автоматическом счетчике клеток. Оценку кинетики клеточной пролиферации проводили путем анализа числа выросших клеток через 24, 48 и 72 ч от начала контакта с веществом.
В опытах с СаОУ ромуцид в концентрации 100 мкг/мл вызывал явное отставание прироста клеток во все периоды наблюдений. Так, если через 24 ч число клеток в контроле составляло 260,3±15,3 тыс. (127,18% от исходной численности), то в опытной группе оно было равно 198,20± ±21,1 тыс. (96,84 %), причем эти различия сохранялись через 48 и 72 ч от начала опыта.
Концентрация ромуцида 10 мкг/мл вызывала отставание прироста только в первый срок регистрации (210,17± ±15,0 тыс. клеток), что позволило расценить се как пороговую.
Недействующая концентрация ромуцида составила 1 мкг/мл.
В опытах на культуре карциномы гортани установлено, что действующей концентрацией препарата является 100 мкг/мл, пороговой — 75 мкг/мл и недействующей — 50 мкг/мл.
Оценка цитотоксичности ромуцида проведена в опытах х односуточными культурами, выращенными при вы-Ашеописанных условиях и сроках воздействия. Регистрацию рживых и мертвых клеток осуществляли под микроскопом в камере Горяева после их окраски эозином и трипановым синим.
Полученные результаты показали, что в контроле процент погибших клеток колеблется в достаточно узком пределе: от 19,1 до 31,33 (см. рисунок). При внесении ромуцида в питательную среду процент мертвых клеток увеличивается. Гибель 50 % клеток вызывает концентрация ромуцида 750 мкг/мл. Пороговая величина составляет 150 мкг/мл.
С целью радиометрической индикации цитотоксическего эффекта ромуцида на клетки линии СаОУ проведены опыты с внесением в культуру меченого предшественника ДНК. В опытах использовали 3Н-тимидин отечественного производства с удельной активностью 15 мкКи/мл. За 1 ч до окончания инкубации культур в термостате во флаконы с растущей культурой добавляли 3Н-тимидин в концентрации 1 мкКи/мл в количестве 0,1 мл на флакон. Затем измеряли уровень радиоактивности слоя клеток на дне флаконов, экстрагировали нуклеиновые кислоты и спектрофотометриче-
ским методом проводили раздельное определение ДНК и РНК.
Наивысшая из испытанных концентраций (100 мкг/мл) вызывала резкое снижение включения 3Н-тимиднна до 20,57 % от уровня контроля. Пороговая величина ромуцида по данному показателю составила I мкг/мл, недействующая— 0,1 мкг/мл. Количественное определение нуклеиновых кислот в клетках при воздействии ромуцида позволяет считать дозу 100 мкг/мл действующей, а 1 мкг/мл недействующей.
Для изучения митотической активности клетки Нер-2 выращивали на стеклах в пробирках с 3 мл питательной среды обычного для этой культуры состава (100 тыс. клеток в 1 мл). Действию ромуцида подвергали суточные культуры, выросшие на стекле.
Действие ромуцида в больших концентрациях (900, 600 и 300 мкг/мл) проявляется гибелью клеток — па стеклах встречаются лишь единичные клетки. Ромуцид в концентрациях от 200 до 50 мкг/мл вызывает замедление роста клеток. Митотическая активность клеток изменялась при концентрациях препарата до 50 мкг/мл.
Наряду со снижением мнтотического индекса отмечено уменьшение числа метафаз. Однако при действии наименьшей из испытанных концентраций (10 мкг/мл) снижение числа метафаз (8,96±0,99 против 11,3±0,98 в контроле) было статистически незначимым.
Испытанные концентрации ромуцида от 900 до 75 мкг/мл вызывали также снижение числа профаз, а при действии вещества в концентрациях 150—90 мкг/мл отмечено снижение количества анафаз. Тенденция к снижению числа тело-фаз наблюдалась только при действи ромуцида в концентрации 90 мкг/мл (4,00±0.96 против 7,75±0,68 в контроле, /=1,93).
Одновременно под влиянием препарата снижался и коэффициент фаз митоза, однако эти изменения были статистически значимы только при концентрации 75 мкг/мл.
По результатам исследования можно сделать вывод об ингибнрующем действии пестицида на процессы митоза, о чем свидетельствует снижение основных изученных показателей митотической активности культуры Нер-2.
Действующей концентрацией ромуцида по влиянию на митотическую активность клеток можно считать концентрацию 50 мкг/мл, пороговой — 20 мкг/мл, недействующей — 10 мкг/мл.
Обе линии культур оказались достаточно чувствительными модельными системами для изучения цитотоксичности ромуцида. Однако при сравнительной еценке линия клеток CaOV была несколько белее чувствительной.
Анализ данных по оценке изменений включения в клетки меченого тимидина, содержания ДНК в культуре позво-
ль? во во <о го
- - - - У /
- /Г ____• 1 ------ 1
1 .......! . ■ ■
1 Исследования на СаОУ проведены под руководством ироф. Я. В. Добрынина и Т. Г. Николаевой.
юо аоо зоо <юо sao eco 700 eco soo tooo
Содержание мертвых клеток в культуре Нер-2 при воздействии ромуцида. По ос» абсцисс — концентрация ромуцида (в мкг/мл); по оси ординат — число мертвых клеток (в %). / — опыт; 2 — контроль.
лил сделать предположение о нарушении синтеза ДНК при воздействии изучаемого пестицида. Нарушение количества ДНК может привести к генным мутациям, что и было обнаружено в опытах на мышах |1].
С этими данными согласуются выявленные изменения ми-тотической активности клеток Нер-2, свидетельствующие о возможном повреждении ядерных структур.
Зона действующих доз ромуцида, установленных по разным показателям цитотоксичности, находится в пределах от 50 до 150 мкг/мл. Пороговые величины укладываются в еще более узкий интервал — от 1 до 75 мкг/мл.
По результатам исследований наиболее чувствительными являются методы цитогенетических исследований: определение включения 3Н-тимидина, содержания ДНК и мито-тической активности.
Литература
1. Рязанова Р. А., Гафурова Т. В. // Гиг. и сан.— 1986.— № 9. — С. 82—83.
Поступила 08.02.88
УДК 613.632:546.21 ] :574.&35
И. П. Козярин
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ ПРИ ДЫХАНИИ ЭЛЕКТРОЛИЗНЫМ КИСЛОРОДОМ, ПОЛУЧЕННЫМ ИЗ ДИСТИЛЛИРОВАННОЙ воды
Киевский медицинский институт
В последние годы в различных отраслях народного хозяйства все шире используются герметично замкнутые помещения, где для дыхания людей применяют искусственную газовую атмосферу (ИГА), в которой содержание и качество кислорода должно приближаться к атмосферному [1, 2). Обеспечение условий жизни, профессиональной деятельности и сохранение высокого уровня работоспособности людей в таких помещениях связано с поиском новых источников получения кислорода, что невозможно без детальных физиолого-гигиенических исследований [3].
Целью настоящей работы явилась токсиколого-гигиенн-ческая оценка электролизного газообразного кислорода (ЭГК), полученного из дистиллированной воды методом электролитического разложения в установке на твердом полимерном электролите. Качество дистиллированной воды соответствовало требованиям ГОСТа 6709—72 «Вода дистиллированная».
В задачи исследований входило изучить качество ЭГК, соответствие его ГОСТу 5583—78 «Кислород технический и медицинский», а также оценить влияние данного кислорода на организм теплокровных животных при вдыхании газовоздушной смеси, содержащей ЭГК и газообразный азот в соотношении 1:4 (20% кислорода и 80 % азота).
Выполненные санитарно-химические исследования показали, что ЭГК, получаемый из дистиллированной воды, содержит в среднем 99,41 ±0,01 % кислорода (по объему)' и менее 0,01 % диоксида углерода. Оксид углерода, газообразные кислоты и оснозания, озон и другие газы-окислители, а также щелочь в исследуемом ЭГК не обнаружены. По данным наших исследований, ЭГК, полученный из дистиллированной воды, запаха не имеет.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что ЭГК, получаемый из дистиллированной воды в системе с твердым полимерным электролитом, соответствует требованиям ГОСТа 5583—78, за исключением содержания в нем водяных паров. Генерируемый установкой ЭГК может быть полностью освобожден от влаги при помощи известных методов осушения.
Для проведения токсикологических исследований нами была создана система для затравки животных с использованием 120-литровых затравочных камер, изготовленных из металлизированной стали и органического стекла. Изучение токсикологических свойств ЭГК проводила яа 30 беспородных белых крысах-самцах, которых распределили на 2 группы по 15 животных в каждой. Крысы опытной группы получали для дыхания газовоздушную смесь ЭГК и газообразного азота (ГОСТ 9293—74 «Азот газообразный») в соотношении 1:4 (20% кислорода и 80% азота по объему), а контрольные животные — атмосферный воздух. Скорость и количество газовоздушной смеси, подаваемой в затравочные •камеры и удаляемой из них, были равноценны и регулиро-
вались при помощи ротаметров. Продолжительность эксперимента составила 30 дней при ежедневной 6-часовой затравке. Остальное время суток животные обеих групп дышали воздухом вивария.
При проведении эксперимента нами использован комплекс интегральных и специфических показателей, позволяющих всесторонне изучить реакции организма на разных структурно-функциональных уровнях, отражающих функциональное состояние печени, почек и ЦНС. Биохимические и гематологические показатели определяли до начала опыта, а затем 1 раз в 2 нед на протяжении всего эксперимента. Патоморфологические исследования проводили в конце эксперимента.
Из числа интегральных показателей изучали динамику массы тела, массу внутренних органов, статистическую работоспособность (утомляемость) животных по длительности удерживания на наклонном шесте, состояние сердечно-сосудистой системы (ЭКГ). Исследовали также функциональное состояние ЦНС (суммационно-пороговый показатель — СПП, норковый рефлекс, активность холинэстеразы в крови), гипофизарно-адреналовой системы (содержание аскорбиновой кислоты в надпочечниках, их массу), печени (длительность гексеналового сна, активность аминотранс-фераз), окислительно-восстановительных процессов (активность каталазы, пероксидазы в крови), морфологический состав крови (количество эритроцитов, лейкоцитов), морфологию внутренних органов.
На протяжении всего эксперимента регистрировали па раметры микроклимата (температура, относительная влаж ность) и барометрическое давление как в лаборатории, где проводились опыты, так и в затравочных камерах (см. таблицу). Производительность установки по кислороду составляла 20—25 л/ч.
Как показали результаты исследований, на протяжении всего эксперимента и контрольные и подопытные животные были активны, охотно поедали корм и пили воду. Изме-менений со стороны шерстного покрова, слизистых глаз и носа, выделений из носа не зарегистрировано. Однако следует отметить, что из-за высокой влажности ЭГК шерсть животных была влажной, суточный диурез мочи у подопытных животных был выше, чем у контрольных.
Масса тела экспериментальных животных равномерно увеличивалась как в контрольной, так и в опытной группе и к концу эксперимента соответственно составила 164,2±6,0 и 151,9±5,2 г.
Со стороны нервной системы у животных опытной группы через 2 нед наблюдений отмечалось уменьшение СПП и норкового рефлекса, носящее, вероятно, адаптационный характер, так как изучаемые показатели к концу опыта находились на уровне контрольных величин.
