МЕТОД ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКАХ ОДНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

валирующей роли СО среди включенных в модель атмосферных загрязнений (рис. 1). Связно это, по-видимому, с тем, что повышенное содержание данного вещества в атмосферном воздухе городов встречается более часто и размеры этого превышения более значительны. Между тем СО и остальные включенные в модель вещества относятся к разным классам опасности. Это послужило поводом для пересчета полученных зависимостей с учетом того, что равный эффект воздействия на организм достигается при разной кратности ПДК различных веществ. Для внесения поправок в изучаемую модель использованы номограммы, полученные М. А. Пинигиным. В результате зависимости между заболеваемостью населения и атмосферными загрязнениями существенно изменили свой вид (рис. 2), что более соответствует представлениям о биологическом действии атмосферных загрязнений, полученных на основе экспериментальных данных.

Таким образом, с помощью многофакторного регрессионного анализа установлены зависимости, позволяющие с определенной степенью достоверности (от 30 до 12%) прогнозировать уровни заболеваемости детского населения под влиянием природно-климатических условий и атмосферных загрязнений.

ЛИТЕРАТУРА. Корнеев Ю. Е. — В кн.: Общие методические и теоретические вопросы гигиены атмосферного воздуха. М., 1973, с. 75—80. — ПинигннМ. А.— В кн.: Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. Вып. 3. М., 1976, с. 14— 16. — Ч е р е п о в Е. М. — <Гиг. и сан.», 1974, № 4, с. 65—68. — Шандала М. Г., Звнняцковский Я. И. — Там же, № 11, с. 5—10.

Поступила 27/1X 1976 г.

УДК 615.9:632.951.015.44:612-085.21

О. Н. Елизарова, Д. П. Нуждина

МЕТОД ОЦЕНКИ ИЗМЕНЕНИЯ СОСТОЯНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КЛЕТКАХ ОДНОСЛОЙНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Московский научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана

Метод перевиваемых однослойных клеточных культур все шире применяется для оценки токсичности пестицидов. Он позволяет определить не только цитотоксичность, но и изменения других сторон жизнедеятельности клетки: влияние пестицидов на митотическую активность клеток, состояние нуклеиновых кислот и др.

Среди методов, предлагаемых для изучения изменений нуклеиновых кислот в клетках перевиваемых культур, значительное место занимает лю-минесцентно-микроскопический анализ. К достоинствам его относятся высокая чувствительность и специфичность, четкость и контрастность микроскопических картин, отражающих изменения в состоянии ДНК и РНК. Метод люминесцентно-микроскопического анализа подробно разработан А. В. Зелениным, М. П. Мейселем и др. и широко применяется для оценки состояния нукленновых кислот. Метод основан на взаимодействии ДНК и РНК с флюорохромом, что обусловливает зеленую люминесценцию нативной двух-цепочечной ДНК и красную люминесценцию нативной одноцепочечной РНК. При потере нативности цвет нуклеиновых кислот изменяется.

В работе использованы стабильные клеточные линии RH, МК и F1, поддерживаемые в виде однослойных культур, адаптированных к условиям существования in vitro. Культуры клеток выращивали общепринятым методом на стенках пробирок и на стеклышках, помещенных в пробирки, с использованием питательной среды № 199, куда добавляли нормальную бычью сыворотку и антибиотики. Когда на стенках пробирок или на стеклышках появлялся островковый рост, питательную среду, служившую для выращивания клеток, заменяли на такую же по составу среду, в которую был вне-

и

сен пестицид. В опытах с выращиванием клеточных культур на стенках пробирок определяли цитотоксичность пестицидов при просмотре препаратов в световом микроскопе при малом увеличении через 4, 24 и 48 ч. Подсчитывали ТДЬ0 — среднетоксическую дозу, вызывающую деструкцию 50% клеток через 48 ч экспозиции. Это обозначение, предложенное ОаЬ-Нкв и Рпеёешапп, весьма удобно для сравнительной оценки токсичности исследуемых веществ. Кроме того, определяли пороговую дозу, равную примерно 1 баллу по общепринятой 4-баллльной системе (М. К. Ворошилова и соавт.), и недействующую. Вынув стеклышки в те же сроки исследования, производили люминесцентно-микроскопический анализ. Препараты фиксировали, а затем обрабатывали акридиновым оранжевым согласно методике, разработанной А. В. Зелениным и соавт.

Для анализа препаратов использовали микроскоп МЛ-2. При просмотре препаратов отмечена линейная зависимость «доза — эффект»: чем больше было количество введенного пестицида, тем более выраженные изменения наступали. Это побудило нас провести количественный подсчет изменений путем визуальной оценки состояния нуклеиновых кислот по цвету люминесценции и распределению ее в клетках.

При действии пестицидов ДНК в ядрах клеток меняла свою ярко-зеленую люминесценцию, характерную для нативной ДНК, на светло-зеленую, тускло-зеленую, желтовато-зеленую и при больших дозах — на желтую люминесценцию. Нативная ДНК дает равномерную люминесценцию всего ядра, а при воздействии пестицидов часть ДНК в ядре теряет способность к люминесценции — ядро приобретает сетчатый вид или на черном фоне выявляются только отдельные гранулы ярко-зеленого цвета. РНК в цитоплазме под влиянием пестицидов также изменяла цвет люминесценции — вместо ярко-красной она становилась темно-красной, а при больших дозах цитоплазма была темной, несветящейся. В ряде случаев люминесценция оставалась по периферии клетки, занимая большее или меньшее пространство цитоплазмы. Отмеченные особенности в люминесценции характеризовали изменения в состоянии ДНК- и РНК-клеток под воздействием пестицидов.

Для количественной оценки в поле зрения микроскопа учитывали все клетки с дифференцировкой по цвету и распределению люминесценции в ядрах и цитоплазме по схеме, в которой были перечислены все возможные изменения. Такой подсчет давал возможность выявить не только количество клеток с измененным состоянием ДНК и РНК, но и степень их изменений. Так, например, желтая люминесценция ядра указывала на выраженные изменения ДНК, а вариации зеленого цвета свидетельствовали о менее выраженном измеиении.

Подсчет производили не менее чем в 200 клетках, находящихся в разных полях зрения. Результат выражали в процентах.

Для сравнения полученных результатов использовали общепринятую 4-балльную оценку, по которой регистрируют цитотоксичность. Мы регистрировали все изменения люминесценции как по цвету, так и по ее распределению. Один балл характеризуется небольшим количеством измененных клеток (примерно 20—25% от общего количества), при 2 баллах изменена половина клеток, при 3 баллах клеток с изменениями примерно 75%, при 4 баллах все клетки имеют изменения в состоянии ДНК или РНК. Если число клеток находилось посредине 2 баллов, обозначали промежуточные баллы, с дробью. Для 0,5 балла количество измененных клеток было равно 10—12%.

Степень изменения нуклеиновых кислот зависит от дозы вводимых пестицидов. Так, доза ТД50 всех исследованных пестицидов влияла на состояние ДНК и РНК. Пороговые дозы (по цитотоксичностн) хлорофоса и цинеба вызывали резко выраженные изменения. Действие препарата 27&

и КСДК в этих дозах было выражено более слабо. Хлорофос оказывал влияние на РНК даже в дозе, недействующей по цитотоксичности, что говорит о высокой чувствительности нуклеиновых кислот к воздействию пестицидов. Наиболее резко во всех случаях были выражены изменения РНК.

Таким образом, с помощью метода клеточных культур открываются возможности в короткие сроки наряду с оценкой цитотоксичности химических соединений дать предварительное заключение о действии препаратов на нуклеиновые кислоты. Это в значительной степени может предопределить целесообразность изучения в опытах на животных состояния этих кислот. Люмннесцентно-микроскопический анализ может быть с успехом использован при изучении состояния ДНК и РНК клеток под воздействием пестицидов. Предлагаемый нами способ количественной регистрации изменений нуклеиновых кислот является объективным и позволяет учитывать не только количественные, но в какой-то мере и качественные изменения этих кислот в зависимости от дозы вещества.

ЛИТЕРАТУРА. Ворошилова М. К., Жевандрова В. И., Бала я н М. С. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. М., 1964.— Зеленин А. В. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот. М., 1967. — О н же. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой. М., 1971.— Мей-с е л ь М. П., 3 е л е н и н А. В. — «Успехи совр. биол.», 1967, т. 64, вып. 2 (5), с. 221— 247. —Gabi iks J., F г i е d е m a n n L. — «Proc. Soc. exp. Biol. (N. Y.)», 1965, v. 120, p. 163—168.

Поступил« 29/111 1976 г.

УДК 614.72-073:621.375.82«

И. М. Липовский, доктор мед. наук В. Н. Козлов, канд. хим. наук

М. А. Липовский

КОНТРОЛЬ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРЫ ОПТИЧЕСКИМИ КВАНТОВЫМИ ГЕНЕРАТОРАМИ

Саратовский политехнический институт

Используемые до сих пор методы диагностики загрязнений атмосферы недостаточно эффективны и не удовлетворяют современным требованиям. Большую роль в изучении загрязнений атмосферы может сыграть метод лазерного зондирования, с помощью которого можно не только количественно оценить загрязнение атмосферы аэрозолями в любой доступной лазерному импульсу области, но и исследовать пространственно-временную структуру загрязнений (В. Е. Зуев, 1973; Kent и Wright).

Лазерный контроль за чистотой атмосферы основывается на том, что, распространяясь в атмосфере, импульс лазерного излучения взаимодействует с последней, оставляя за собой определенный след (В. Е. Зуев, 1972). Кроме указанного эффекта взаимодействия светового лазерного импульса с атмосферными образованиями, можно назвать изменение формы импульса и состояния его поляризации при распространении в молекулярной атмосфере.

Регистрируя следы лазерного импульса в атмосфере с помощью высоко чувствительных приемников, например фотоэлектронных умножителей, и расшифровывая результаты записи по определенным правилам, можно получить количественные и качественные данные о том или ином изучаемом параметре, загрязнителя атмосферы.

Метод лазерного зондирования загрязнений атмосферы очень чувствителен: локатор улавливает эхо-сигнал от невидимых глазом частиц аэрозолей при их относительно небольшой концентрации. Barret получил