CC BY
7
УДК 618.9.074:543.42.063
Проф. И. М. Трахтенберг, кандидаты мед. наук И. С. Брит и Я. И. Моргунова
ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОСПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ ОЦЕНКИ СРАВНИТЕЛЬНОЙ токсичности НОВЫХ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Киевский научно-исследовательский институт гигиены труда и профзаболеваний. Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
Развитие химической промышленности, массовое производство и широкое внедрение в различные отрасли народного хозяйства новых химических соединений диктуют необходимость постоянного изыскания и совершенствования современных эффективных методов их токсико-гигиениче-ской оценки. С этих позиций особого внимания заслуживает дальнейшая разработка быстрого, достаточно надежного, экономичного и легко воспроизводимого способа оценки сравнительной токсичности различных производственных ядов, пестицидов, высокомолекулярных соединений и др. В значительной степени этим требованиям отвечает метод культуры ткани, различные варианты которого стали использоваться в последние годы в практике санитарно-токсикологических исследований (Л. 3. Гомелаури и В. И. Бахуташвили; О. Б. Ермолова и А. Ф. Зак; Л. В. Григорьева и соавт.). Однако учет цитотоксического эффекта по степени нарушения целости клеточного монослоя, как это делается в большинстве случаев, не может служить критерием оценки выраженности цитотоксического действия препаратов, поскольку выраженная дегенерация клеток является по существу конечным этапом цитотоксического эффекта и может отсутствовать. Появление дегенерации монослоя может, очевидно, рассматриваться только как первичная оценка токсичности вещества, а доза препарата, вызвавшего дегенерацию, — как высшая доза для инокуляции культур.
Учитывая, что при координации обменных процессов используется генетическая информация клетки, и функциональные реакции, выявляемые качественными и количественными методами по нуклеиновым кислотам, могут стать критерием оценки степени воздействия экзогенных факторов, мы рекомендуем для промышленной гигиены метод, позволяющий получать сведения о нуклеиновой кислоте цельнофиксированных клеток,— цитоспектрофлюориметрический анализ с полихромным красителем — акридиновым оранжевым. Флюорохромирование препаратов, рекомендованное 1^1ег, позволяет четко различать красное свечение РНК-АО ядрышек и цитоплазмы, а также зеленое — ДНК-АО ядер, зерен хроматина и хромосом. Сами же локальные спектры таких структур клетки дают в той или иной мере смешанное свечение (^акс 530 и 640 нм), указывающее на то, что функционировавшие биополимеры — ДНК бывают частично расплетенными, а РНК могут иметь двуспиральные участки. В отношении интенсивности красной и зеленой компоненты спектра И ¡ё1ег предложил рассчитывать структурную упорядоченность — коэффициент а как качественный показатель состояния фиксированных комплексов нуклеиновая кислота — краситель клетки, который учитывают при количественном определении нуклеиновых кислот, связанных с молекулами акридинового оранжевого. Использование такого анализа дает возможность выявить закономерности на молекулярном уровне, свойственные клеткам при развитии в них патологических состояний, которые приводят к появлению отличающихся от нормы функциональных реакций. Возможность определения по нуклеиновым кислотам взаимодействия клеток с химическими соединениями была положена в основу примененного метода как критерий оценки степени цитотоксического действия. В связи с этим порог действия исследуемых токсических веществ может быть установлен и при весьма низких дозах, при которых общепринятыми методами определить его нельзя.
п
Рис. 1. Деструктивные изменения в клетках крысиной эмбриональной ткани..Воздействие ГМД.
Окрашивание акрндииовым оранжевым. Ув. 840Х-
Сошлемся на результаты экспериментов, проведенных с 2 химическими веществами — гексаметилендиамином (ГМД) и производным тио-мочевины (препарат КПИ-14). Эти соединения применяются также в промышленности (ГМД как промежуточный продукт в производстве солей А Г и СГ — материал для^изготовления пластмасс) и внедряются в качестве ингибиторов коррозии металлов в нейтральной водной и кислотной среде.
В экспериментах использованы первичные (крысиная эмбриональная ткань, клетки человеческого амниона) и пе ревивные культуры (HeLa, L, Нер-2, Vero), приготовленные по стандартным методам. Клетки выращивали в пробирках и флаконах Карреля на покровных стеклах. Для первичной оценки токсичности и выбора исходной дозы использовали 3—4-дневные первичные культуры и 2—3-дневные перевивные. Культуры инокулиро-вали раствором испытуемых веществ в среде № 199 в концентрации от 10 до 0,0185 мг/мл. Результаты учитывали через 24 ч. Покровые стекла извлекали из флакона, отмывали, фиксировали в растворе Карнуа, окрашивали раствором акридинового оранжевого в соотношении 1:10 000 и заключали в каплю стабилизатора люминесценции (И. С. Брит). Контролем специфичности окраски служили препараты, обработанные РНК-азой и ДНК-азой (Э. Пирс). Спектральный анализ проводили на микроспектро-флюориметре фоторегистрационного типа, изготовленном на базе микроскопа МКФ-ЗМ со спектральной насадкой, подобной СПО-1. Локальные спектры клеток расшифровывали на регистрирующем микрофотометре МФ-4. Зоны возбуждения люминесценции 8 мкм, зоны измерения в клетке 3 мкм.
Особенностью примененной методики фоторегистрационной микро-спектрофлюориметрии являлось то, что выбор морфологически однородных интерфазных клеток и локальных мест измерений в них (цитоплазма, ядро) осуществляли под контролем светоизмерительной иглы, позволяющей ориентироваться на средний уровень яркости типичных мест измерений в клетках препарата. Последнее в свою очередь позволяет использовать методику интегрального суммирования заданного числа (по 10) равноценных спектров с нескольких клеток при групповой расшифровке суммарного промера на микрофотометре (И. С. Брит).
Флюорохромирование клеток АО позволяет оценивать не только общее содержание и вторичную структуру нуклеиновых кислот, но и морфологию клеток (рис. 1). О степени поражения клеток можно судить по деструктивным изменениям, изменению яркости свечения и перераспределению цвета, окрашенных структур; о воздействии токсических веществ на геном клетки (ДНК) по изменению коэффициента а; о воздействии токсических веществ на РНК — по наличию относительного содержания дву-спиральных форм этих нуклеиновых кислот (Я. И. Моргунова и И. С. Брит).
Результаты исследований с использованием ГМД и производных тио-мочевины показали, что оба препарата обладают цитотоксическим действием,
вызывая деструктивные изменения в клетках культуры (рис. 1). Более выраженный эффект выявлен при воздействии ГМД, порог общетоксического действия которого оказался равным 0,039 мг/мл; в то же время аналогичный показатель при воздействии КПИ-14 составляет 0,15625 мг/мл. Оба препарата нарушают биосинтез РНК, поражая цитоплазму (снижается общее содержание РНК и появляются гранулы, содержащие двуспиральную РНК); оба препарата нарушают биосинтез ДНК, вызывая фазное изменение содержания при введении 500 (530) 550 воо \650700750hm уменьшающихся доз пре-
парата с коэффициентом
Рис. 2. Спектры люминесценции РНК-АО (а) и разведения 2 и увеличе-ДНК-АО (б) комплексов клеток контрольных культур. . ние относительного количества расплетенных участков ДНК; кроме того, ГМД воздействует на геном клетки, изменяя коэффициент а (рис. 2).
Изложенные выше общие предпосылки к применению цитоспектрофлюо-риметрии, опыт проведения экспериментальных исследований и анализ полученных результатов позволяют считать, что рекомендуемый метод дает возможность определять сравнительную токсичность исследуемых веществ в весьма низких концентрациях для быстрой первичной оценки токсичности новых химических соединений.
ЛИТЕРАТУРА. ГомелауриЛ. 3., Бахуташвили В. И.— «Гиг. и сан.», 1971, № 12, с. 61—63. — Григорьева Л. В., Корчак Г. И., Г у д з и н а Г. Д. — Там же, 1974, №3, с. 93—95. — Е р м о л о в а О. Б., 3 а к А. Ф.— «Антибиотики», 1972, № 7, с. 598.— Мор гуноваЯ- И., Брит И. С.— В кн.: Биология злокачественного роста, диагностика и лечение опухолей. Киев, 1968, с. 78—80. — Они же. — В кн.: Канцерогенез, методы диагностики и лечения опухолей. Киев, 1968, с. 66—67. — Пирс Э. Гистохимия. М., 1962, с. 850—851. -Rig-ler R. J.—«Acta physiol. scand.», 1966, v. 67, p. 267.
Поступила 7/X 1975 r.
УДК 612.015.3-08:612.39 + 613.2-07:6 12.01S.3
H. С. Железнякова, A.A. Муромцева
МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ В СВЯЗИ С ПИТАНИЕМ
Одесский медицинский институт
Эффективность углубленного медицинского контроля в значительной мере определяется целенаправленным использованием математической обработки и анализа результатов биохимических исследований продуктов обмена веществ. В задачу работы входило выяснение некоторых вопросов,
