CC BY
78
8 Grekhova O.N., Lushnikov N.A. Khimicheskii sostav bentonitov Zyryanskogo mestorozhdeniya i ikh ispol'zovanie v APK (Chemical composition of bentonites from Zyryanskoe deposit), Nauka i obrazovanie Zaural'ya, 2002, No. 1, pp. 120-124.
9 Khlopin A.A., Grekhova O.N. Pozdnyakova N.A. Prirodnye sorbenty Zaural'ya v ratsionakh sel'skokhozyaistven-nykh zhivotnykh (Natural sorbents of Zauralie in the rations of livestock), sbornik nauchnykh trudov Ural'skoi gosudarstven-noi akademii veterinarnoi meditsiny. T.XV. Troitsk, 2009, pp. 157-160.
10 Antonova V.S., Topuriya G.M. Metodologiya nauchnykh issledovanii v zhivotnovodstve (Methodology of scientific investigations in livestock production), Orenburg: Izdatel'skii tsentr OGAU, 2011, 246 p.
11 Prudnikov S.N., Prudnikova T.M. Kontseptsiya obespecheniya produktivnogo zdorov'ya svinei v sovremennykh usloviyakh intensivnogo vedeniya otrasli (Conception of provision of swine's productive health in the current conditions of intensive branch management), Novosibirsk, 2011, 36 p.
12 Leikus P. The effect of enzymes on the quality of pigs performance // Veterinary and zootechnik. Vol. 36 (58). 2006, pp.28-31.
13 Mori A., Kluess J. Performances and phosphorus status of growing pigs are improved by a multienzymecomplex containing NSP enzymes and photoset. -Dairi Sci, 2007. Vol. 90. Suppl 1. P. 439
14 Dr. Mike A. Varley. Pig progress alternative troths promotion special, 2012, Alternatives to ATB - the Asian perspective, pp. 14-15.
УДК 68.41.41
ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
В ДИАГНОСТИКЕ ТЕСТИКУЛЯРНЫХ НЕОПЛАЗИЙ У КОБЕЛЕЙ
С. В. Седегов, и.о. директора учебно-научного центра «Ветлайн» при Пермской государственной сельскохозяйственной академии имени академика Д.Н. Прянишникова, ул. Петропавловская, 23, г. Пермь, Россия, 614990 E-mail: gd@parmail.ru
Аннотация. Люминесцентная микроскопия с применением флуорохрома акридинового оранжевого является высокочувствительным диагностическим методом и может широко использоваться в ветеринарной практике для выявления онкологических заболеваний семенников у кобелей. При люминесцентной микроскопии гистопрепаратов с использованием вышеуказанного флуорохрома здоровая тестикулярная ткань приобретает специфическое свечение. ДНК в такой ткани излучает зеленое свечение, а РНК - оранжевое, оранжево-красное. При окраске акридин оранжевым тестикулярных опухолей можно отметить резкое снижение количества ДНК и увеличение РНК красно-оранжевого цвета. В центральных участках опухолевых узлов красно-оранжевое свечение менее выражено, чем на периферии патологического очага.
Необходимо проводить дифференциальную диагностику между опухолевыми процессами, заболеваниями воспалительного характера и пороками развития. Люминесцентная микроскопия может использоваться в гистопатологических ветеринарных лабораториях совместно с традиционной световой микроскопией при дифференциальной диагностики различных тестику-лярных новообразований у собак.
Ключевые слова: флуоресценция, микроскопия, флуорохром, семенник, опухоль.
Введение. Существует множество видов опухолей семенников у собак. Все тестику-лярные новообразования делятся на две группы: герминогенные (происходят из клеток семенного эпителия) и негерминогенные (из других тканевых элементов) [1, 2, 3]. Клиническое значение в ветеринарной практике, в настоящее время, имеют три основных вида опухоли семенников: семинома, сертолиома (синонимы: опухоль клеток Сертоли, андроб-
ластома, опухоль из сустентоцитов), лейдиго-ма (синонимы: опухоль из клеток Лейдига, опухоль из гландулоцитов, интерстициально-клеточная опухоль) [4,5]. Гистопатологиче-ское исследование в настоящее время является основным методом в ветеринарии, подтверждающим наличие опухоли семенников у кобелей. При световой микроскопии используют наиболее зарекомендовавшие себя методы окраски - эозином и гематоксилином и по
Ван-Гизон. Люминесцентная микроскопия с применением флуорохрома акридинового оранжевого является высокочувствительным диагностическим методом и может широко использоваться в ветеринарной практике для выявления онкологических заболеваний семенников у кобелей.
Методика. Методом люминесцентной микроскопии были обследованы семенники 24 кобелей с различными тестикулярными неоплазиями. Билатеральную орхидэктомию (кастрацию) у собак проводили под общей анестезией с предварительно проведенной премедикацией. Для премедикации пациентам, за 20 минут до инъецирования средств для общей анестезии, вводились следующие препараты: атропина сульфат (в дозе 0,04 мг на 1 кг массы тела животного, подкожно), димедрол (в дозе 0,04 мг на 1 кг массы тела животного, подкожно), дицинон (в дозе 0,05 мг на 1 кг массы тела животного, подкожно). Общая анестезия производилась внутримышечным введением препарата Золетил-100 в дозе 5 мг на 1 кг массы тела животного, в сочетании с кси-лозином в дозе 2 мг на 1 кг массы животного.
Прошедший визуальный осмотр тестикул помещался в 10% раствор формальдегида. Взятые для исследования гистологические образцы укладывали в пластмассовые кассеты для вырезки оперативно удаленных объектов размерами 2,8x4x0,5 см. Далее осуществлялась проводка операционного материала по спиртам возрастающей крепости для обезвоживания и уплотнения ткани с использованием гистопроцессора - автомата LEICA TP 1020 с заданным циклом проводки 18 часов. После проводки кусочки подвергались заливке в особо чистый парафин (среда гистомикс) с температурой плавления 56 градусов. Для этого использовался аппарат для заливки кусочков в парафин Thermo scientific Histostar. С полученных парафиновых блоков изготавливались срезы толщиной 2-3 микрона на микротоме-полуавтомате Microm HM 325.
Люминесцентно-микроскопическое исследование проводилось с использованием флуорохрома - акридин оранжевый (производство: Acros organics) в разведении 1:10000 в цитратно-фосфатном буфере c pH 5 и pH 6. Экспозиция от 30 секунд до 10 минут. Дезок-сирибонуклеиновая кислота (ДНК) и двуце-почная рибонуклеиновая кислота (РНК) окрашиваются акридиновым оранжевым в светло-зеленый или зелено-желтый цвет, а РНК, од-
ноцепочная ДНК и полисахариды - в красный, оранжево-красный. Идентификация ДНК и РНК (контроль) осуществлялась выдерживанием гистологических препаратов в 1 М растворе соляной кислоты при 37°С при экспозиции 1 час для ДНК и 3 часа - РНК. После чего проводилась вторичная окраска гистологического среза по вышеизложенной технике. Исследование проводилось на люминесцентном микроскопе OLYMPUS СХ 41 с окуляром 10х и объективами 4х; 10х.; 40х.; 100х
Результаты. В семенниках кобелей без признаков тестикулярной патологии хорошо просматривается наружная оболочка, представленная зрелой волокнистой тканью, в которой проходят толстостенные щелевидные сосуды неравномерного кровенаполнения. Семенные канальцы расположены упорядо-ченно, имеют округлую форму с сохранением всех слоев сперматогенного эпителия. При детальном изучении микропрепарата можно проследить все стадии сперматогенеза вплоть до зрелых сперматозоидов, которые расположены в просвете канальцев в центральной их части. Строма семенника рыхлая, нежново-локнистая, в ней проходят тонкостенные кровеносные сосуды и немногочисленные лимфатические сосуды.
При люминесцентной микроскопии гистологических срезов здоровой тестикулярной ткани отмечается интенсивная люминесценция молекулярных компонентов. Зеленое свечение в большей степени излучает окрашенная флуорохромом ДНК, а оранжево-красное или красное свечение - РНК. Распределение свечения по сперматогенному эпителию в здоровой ткани семенника распределяется относительно равномерно (рис.1).
При люминесцентной микроскопии гистологических срезов с семиномой отмечается изменение соотношения флюоресцирующих цветов в пораженной ткани. Основными являются оранжево-красный и красный цвета с незначительными включениями зеленого цвета (рис. 2, 3). После проведения контроля с помощью 3х-часовой экспозиции в 1 М растворе соляной кислоты визуализируется полное отсутствие свечения, свойственное для ДНК (зеленое) и РНК (оранжево-красное, красное) в семенных канальцах (Рис.4), что еще раз подтверждает способность акридинового оранжевого специфически окрашивать тестикулярную ткань.
Рис. 1. Люминесцентная микроскопия. Норма. Семенной каналец. ДНК - зелёное свечение (1), РНК -оранжево-красное (2). Окраска акридиновым оранжевым. Ок. 10 х Об. 10
Рис. 2. Интратубулярная семинома. Небольшие очаги люминесценции зелёного цвета (1). Окраска акридиновым оранжевым. Об. 10 х Ок. 10
Чу
«с*
Л
V
уч •I ^ 1 •
_
Рис. 3. Семинома. Опухолевая ткань семенника (1) с единичными участками
здоровой ткани органа. Окраска акридиновым оранжевым. Об. 10 х Ок. 4
Рис. 4. Ротвейлер, 10 лет. Семенные канальцы, поражённые семиномой (1). Окраска акридиновым оранжевым. Об. 10 х Ок. 4
Рис. 5. Сертолиома. Вакуолизированные клетки (1). Окраска акридиновым оранжевым. Об. 10 х Ок. 100
При люминесцентной микроскопии гистологических срезов с сертолиомой также отмечается специфическая окраска патологической ткани со скудным содержанием РНК, особенно в центральных частях опухолевых узлов. Флуорохром акридиновый оранжевый также позволяет выявлять вакуолизацию се-
менных канальцев (рис. 5, 6). Лейдигома является опухолью стромы органа и при люминесцентной микроскопии визуализируется как активное разрастание тестикулярного интер-стиция с различной степенью выраженности компрессии семенных канальцев.
1
-—т-
Рис. 6. Сертолиома. Вакуолизация опухолевой ткани (1). Окраска акридиновым оранжевым. Об. 10 х Ок. 4
'"Л -v "
- ' %
•V » 1
/
—•
■» «
> V
Рис. 7. Лейдигома. Диффузный рост. Окраска акридиновым оранжевым. Об. 10 х Ок. 4
1
Выводы. При люминесцентной микроскопии препаратов с использованием флуо-рохрома акридинового оранжевого здоровая тестикулярная ткань приобретает специфическое свечение. ДНК в такой ткани излучают зеленое свечение, а РНК - оранжевое, оранжево-красное. При окраске акридиновым оранжевым тестикулярных опухолей можно отметить резкое снижение количества ДНК и увеличение РНК красно-оранжевого цвета. Хотелось бы отметить, что в центральных участках опухолевых узлов красно-оранжевое свечение менее выражено, чем на периферии патологического очага. Скорее всего, это связано с тем, что в центре опухоли тканевой патологический рост замедлен, а на периферии он активный, что объясняет концентрирование здесь РНК. Раково-измененная тестикулярная ткань в темном поле зрения светится специфиче-
ским оранжево-желтым ярким светом. Здоровая тестикулярная ткань, не подвергшаяся перерождению, светится с обильным включением зеленого цвета.
Таким образом, исследование патологических состояний половых органов самцов должно сочетать в себе клинические, параклинические, и, особенно, морфологические методы исследования в случае удаления патологически измененного семенника. При этом необходимо проводить дифференциальную диагностику опухолевых процессов от заболеваний воспалительного характера и пороков развития. Люминесцентная микроскопия может использоваться в гистопатологических ветеринарных лабораториях совместно с традиционной световой микроскопией при дифференциальной диагностике различных тести-кулярных новообразований у собак.
Литература
1. Madewell, B.R. Veterinary Cancer Medicine, 2nd ed. / B.R. Madewell, G.H. Theilen. - Philadelphia, Lea & Fe-biger, 1987. P.600.
2. Черенков В.Г. Клиническая онкология. М.: ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2005. 448 с.
3. Swerdlow, A.J. The epidemiology of testicular cancer / A.J. Swerdlow // Eur Urol. 1993. Vol. 23 (Suppl 2). P. 35 - 38.
4. Nieto, J.M. Canine testicular tumors in descended and cryptorchid testes / J.M. Nieto, M. Pizarro, L.M. Balaguer et al. // Dtsch. Tier- arztl. Wochenschr. 1989. Vol. 96. P. 186-189.
5. Verstegen, J.P. BSAVA Manual of Small Animal Reproduction and Neonatology / J.P.Verstegen, G.M. Simpson, G.C.W. England, M. Harvey. - Cheltenham: British Small Animal Veterinary Association, 1998. P. 71.
6. Гурарий Л.Л., Волкова М.И., Халафьян Э.А., Захарова Т.И. Сертолиома яичка. М., 2002. №4. С. 10-14.
7. Симпсон Д, Ингланда Г., Харви М. Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек. М.: Софи-он, 2005. 290 с.
8. Тельцов Л.П. Идентификация молекулярных компонентов при люминесцентной цито - и гистохимии // Российские морфологические ведомости. М., 1997. №1 (6). С. 140-144.
9. Фелдмен Э., Нелсон Р. Эндокринология и репродукция собак и кошек. М.: Софион, 2008. 1256 с.
10. Целищев Л.И. Практическая ветеринарная андрология. М.: Мир, 1982. 176 с.
11. Чиссов В.И., Дарьялова С.Л. Клинические рекомендации. Онкология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. 638 с.
12. Kessler, M. Onkologie. Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen bei Hunden und Katzen. 2. Auflage / M. Kessler. - Stuttgart: Parey in MVS Medizinverlage Stuttgart GmbH & Co, 2005. P. 520.
13. Peters, M.A.J. Spermatogenesis and testicular tumours in the ageing dog. Advances in Dog, Cat and Exotic Carnivore Reproduction / M.A.J. Peters // Book of Abstracts. The 4th International Symposium on Canine and Feline Reproduction and the 2nd Congress of the European Veterinary Society for Small Animal Reproduction (June 29-July 1, 2000). - Oslo, 2000. P. 35.
14. Ulbright, T.M. Atlas of tumor Pathology. Tumors of the testis, adnexa, spermatic cord and scrotum. Third series. Fascicle 25. / T.M. Ulbright, M.B. Amin, R.H. Young. - Washington: Armed forces institute of pathology, 1999. P. 385.
FLUORESCENCE MICROSCOPY IN THE DIAGNOSIS OF TESTICULAR NEOPLASIA IN DOGS
S.V. Sedegov, Acting Director of the Research and Training Centre Vetlain Perm State Agricultural Academy 23 Petropavlovskaya St, Perm 614990 Russia E-mail: gd@parmail.ru
ABSTRACT
Fluorescence microscopy with acridine orange fluorochrome is a highly sensitive diagnostic method and can be widely used in veterinary practice to identify cancer of the testes in male dogs. In fluorescence microscopy of histological slides using the above mentioned fluorochrome, healthy testicular tissue has a peculiar glow. The DNA in such tissue emits a green glow, and RNA - orange, orange-red. When colouring with acridine orange testicular tumors we may note a sharp decline in the number of DNA and increase in RNA of red-orange colour. In the central areas of tumor sites red-orange glow is less than on the periphery of the pathological focus.
There should be differential diagnosis between neoplastic diseases, inflammatory processes, and developmental disabilities. Fluorescence microscopy can be used in histologic-pathologic veterinary laboratories in conjunction with traditional light microscopy with differential diagnosis of testicular tumors in dogs.
Key words: fluorescence, microscopy, fluorochrome, testis, tumor.
References
1. Madewell, B.R. Veterinary Cancer Medicine, 2nd ed. / B.R. Madewell, G.H. Theilen. - Philadelphia, Lea & Fe-biger, 1987. P.600.
2. Cherenkov V.G. Klinicheskaya onkologiya (Clinic oncology), M.: FGOU «VUNMTs Roszdrava», 2005, 448 p.
3. Swerdlow, A.J. The epidemiology of testicular cancer / A.J. Swerdlow // Eur Urol. 1993, Vol. 23 (Suppl. 2), pp. 35 - 38.
4. Nieto, J.M. Canine testicular tumors in descended and cryptorchid testes / J.M. Nieto, M. Pizarro, L.M. Balaguer et al. // Dtsch. Tier- arztl. Wochenschr. 1989, Vol. 96, pp. 186-189.
5. Verstegen, J.P. BSAVA Manual of Small Animal Reproduction and Neonatology / J.P.Verstegen, G.M. Simpson, G.C.W. England, M. Harvey. - Cheltenham: British Small Animal Veterinary Association, 1998, 71p.
6. Gurarii L.L., Volkova M.I., Khalafyan E.A., Zakharova T.I. Sertolioma yaichka (Certoli cell tumour of testes) M., 2002, No.4, pp. 10-14.
7. Simpson D, Inglanda G., Kharvi M. Rukovodstvo po reproduktsii i neonatologii sobak i koshek (Guide on reproduction and neo-pathology in dogs and cats), M.: Sofion, 2005, 290 p.
8. Tel'tsov L.P. Identifikatsiya molekulyarnykh komponentov pri lyuminestsentnoi tsito - i gistokhimii (Identification of molecular components under luminescent cyto-and histochemistry), Rossiiskie morfologicheskie vedomosti. M., 1997, No.1 (6), pp. 140-144.
9. Feldmen E., Nelson R. Endokrinologiya i reproduktsiya sobak i koshek (Endocrinology and reproduction in dogs and cats), M.: Sofion, 2008, 1256 p.
10. Tselishchev L.I. Prakticheskaya veterinarnaya andrologiya (Practical veterinarian andrology), M.: Mir, 1982, 176 p.
11. Chissov V.I., Dar'yalova S.L. Klinicheskie rekomendatsii. Onkologiya.(Clinic recommendations. Oncology), M.: GEOTAR-Media, 2006, 638 p.
12. Kessler, M. Onkologie. Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen bei Hunden und Katzen. 2. Auflage / M. Kessler. - Stuttgart: Parey in MVS Medizinverlage Stuttgart GmbH & Co, 2005, 520 p.
13. Peters, M.A.J. Spermatogenesis and testicular tumours in the ageing dog. Advances in Dog, Cat and Exotic Carnivore Reproduction / M.A.J. Peters // Book of Abstracts. The 4th International Symposium on Canine and Feline Reproduction and the 2nd Congress of the European Veterinary Society for Small Animal Reproduction (June 29-July 1, 2000). - Oslo, 2000, pp. 35.
14. Ulbright, T.M. Atlas of tumor Pathology. Tumors of the testis, adnexa, spermatic cord and scrotum. Third series. Fascicle 25. / T.M. Ulbright, M.B. Amin, R.H. Young. - Washington: Armed forces institute of pathology, 1999, pp. 385.
