Взаимодействие фибробластов с протетическими материалами (экспериментальное исследование) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 615.46.03:616.314-089.28].015.44

Узунян Н.А., Адамчик А.А., Бронштейн Д.А., Лернер А.Я., Гришкова Н.О., Тихонов А.И., Повстянко Ю.А.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФИБРОБЛАСТОВ С ПРОТЕТИЧЕСКИМИ МАТЕРИАЛАМИ

ФГБОУ ДПО «Институт повышения квалификации ФМБА России», 125371, Москва

Проведено экспериментальное изучение биосовместимости основных протетических материалов в клеточной культуре фибробластов человека. Выявлено негативное влияние на морфологию клеток хромокобальтового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата, композита светового отверждения. К л ю ч е в ы е с л о в а: фибробласты; клеточная культура; протетические материалы.

Для цитирования: Российский стоматологический журнал. 2015; 19(5): 4-6. Uzunyan N.A., AdamchikA.A., Bronshteyn D.A., Lerner A.Ya., Grishkova N.O., Tikhonov A.I., Povstyanko Yu.A. INTERACTION OF FIBROBLASTS WITH PROSTHETIC MATERIALS «Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia», 125371, Moscow, Russia

Experimental study of the biocompatibility of the main prosthetic materials in cell culture of human fibroblasts. It revealed a negative effect on cell morphology hromokobaltovogo alloy material for dentures, based on polymethylmethacrylate, light-cured composite.

Keywords: fibroblasts; cell culture; prosthetic materials.

Gtation: Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal. 2015; 19(5): 4-6.

Организм человека все в большей степени подвергается психологическим и экологическим нагрузкам, способствующим искажению реактивности иммунной и эндокринной систем. На этом фоне материалы имплантатов и зубных протезов могут вызывать нетипичные аллергические и токсико-химические реакции. В связи с этим актуальны сравнительные исследования биосовместимости стоматологических материалов с использованием тонких методов оценки их токсичности в клеточных культурах, в частности фибробластов человека.

Материал и методы

Из коллекции культур тканей НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского выбраны нормальные клетки фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ-Т). Для культивирования использовали среду Игла (производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова).

Для изучения биосовместимости и влияния на ростовую активность клеток ФЭЧ-Т стоматологических материалов применяли метилтетразолиевый тест (МТТ). МТТ - колориметрический тест, который является биологическим стандартом и рекомендован в этом качестве для оценки цитотоксиче-ского действия различных чужеродных веществ на клетки. Тест основан на прямой коррекции количества жизнеспособных клеток и интенсивности метаболизма специального реактива МТТ до водорастворимого темноокрашенного фор-мазана под действием митохондриальной сукцинатдегидро-геназы (мертвые клетки и клетки со сниженной жизнеспособностью такой способностью не обладают). Последующая фотометрия растворенного с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) формазана позволяет точно сопоставить изменение оптической плотности (ОП) раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а

Для корреспонденции: Узунян Нарине Адольфовна, uzunyan. narina@mail.ru

For correspondence: Uzunyan Narine Adolfovna, uzunyan.narina@ mail.ru

в цитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным цитотоксиче-ским агентом. Предварительно отмытые и автоклавирован-ные образцы исследуемых материалов укладывали в лунки 24-луночного планшета Costar (США). Суспензию клеток в посевной дозе 13-105 кл/мл в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПО «ПанЭко», Москва) вносилаи в каждую лунку планшета. Планшеты с образцами и клетками инкубировали в термостате с СО2 при 37°С в течение 48 ч. После инкубации культуральную среду удаляли и проводили МТТ [1-3]. Культуральную среду отсасывали из лунок, добавляли по 1 мл среды с 200 мкл МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия, «Sigma») в исходной концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Затем среду с МТТ удаляли и добавляли по 1 мл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Осадок клеток ресуспендировали в течение 5 мин пипетированием. Жизнеспособность клеток оценивали по интенсивности окраски раствора, измеряя ОП при длине волны 545 нм фотометра Immunochem 2100 (США) (см. рисунок).

Подсчет выросших клеток, определение их размера и объема в виде гистограммы производили с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток пипетки Scepter Millipore (Германия), которая позволяет получить данные о популяции клеток, концентрации, распределении по размеру и объему. Инкубацию фибробластов выполняли в течение 96 ч. Затем монослой выросших на дне лунок клеток изучали визуально в световом микроскопе Olympus СКХ41 (Япония), снимали смесью 0,02% Версена-Химопсина и разводили в 1 мл среды Игла для подсчета пипеткой Scepter Millipore.

Для изучения морфологии клеток, характера их прикрепления к субстрату прибегали к окрашиванию акридином оранжевым. При взаимодействии с чистыми нуклеиновыми кислотами акридиновый оранжевый образует комплексы, флюоресцирующие зеленым при связывании с ДНК и красным при связывании с РНК. После инкубации в течение 96 ч удаляли культуральную среду, лунки промывали дважды 1 мл фосфатного буфера и добавляли по 1 мл 95% спирта.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Таблица 1. Определение влияния на ростовую активность и жизнеспособность клеток ФЭч-образцов с помощью МТТ

Образец и его положение ОП 545 нм Разность с контролем, %

Титан Grade 4 0,727 ± 0,087 +4,8

Никелид титана 0,657 ± 0,07 -5,1

Титан-ниобий-циркониевый 0,679 ± 0,016 -1,9

сплав

Титан-ниобий-танталовый сплав 0,619 ± 0,011 -10,6

Хромокобальтовый сплав 0,767 ± 0,095 + 9,8

Диоксид циркония для каркасов 0,741 ± 0,047 +6,6

несъемных протезов

Прессованная керамика 0,620 ± 0,053 -10,4

Диоксид циркония для денталь- 0,749 ± 0,09 +7,6

ных имплантатов

Композит светового отверждения 0,496 ± 0,098 -28,3

Материал для съемных протезов 0,650 ± 0,027 -6,1

на основе нейлона

Материал для съемных протезов 0,567 ± 0,061 -18,1

на основе полиметилметакрилата

Контроль клеток

0,692 ± 0,071

Через 15 мин удаляли спирт и высушивали лунки. Затем добавляли по 1 мл 0,01% акридинового оранжевого на 10 мин, отмывали дважды 1 мл фосфатного буфера. Покровные стекла с окрашенными клетками вынимали и изучали во флюоресцентном микроскопе Opton Ах^кор (Германия).

Исследовали следующие материалы известных фирм производителей:

Таблица 2. Определение среднего размера и объема клеток с помощью автоматического счетчика клеток Scepter Millipore

Показания пипетки Scepter Millipore

Образец и его положение средний объем, пл средний диаметр, мкм концентрация, кл/мл соотношение клеток образец/ контроль, %

Контроль клеток 3,38 18,63 6,78-104

Титан Grade 4 2,86 17,62 9,21-104 + 135,8

Никелид титана 2,65 17,18 7,64-104 + 112,7

Титан-ниобий- 2,44 16,71 9,64-104 + 142,2

циркониевый сплав

Титан-ниобий- 1,45 14,06 6,96-104 + 102,7

танталовый сплав

Хромокобальтовый 2,46 16,76 4,22-104 -62,2

сплав

Диоксид циркония 2,95 17,80 6,34-104 -93,5

для каркасов несъемных протезов Прессованная керамика Диоксид циркония для дентальных имплантатов Материал для съемных протезов на основе нейлона Материал для съемных протезов на основе полиме-тилметакрилата

2,18 1 6,09 5,99-104 -88,4 2,7 17,27 6,11 104 -90,1

3,02 17,93 5.43-104

,1

2,8 17,52 4,88-104 -72,0

- титан Grade 4;

- титан-ниобий-циркониевый сплав;

- титан-ниобий-танталовый сплав;

- никелид титана;

- хромокобальтовый сплав;

- диоксид циркония для каркасов несъемных протезов;

- диоксид циркония для дентальных имплантатов;

- прессованную керамику;

- композит светового отверждения;

- материал для съемных протезов на основе полиметил-метакрилата;

- материал для съемных протезов на основе нейлона. Результаты

В опытах на биосовместимость установлено, что влияние на ростовую активность ФЭЧ-Т с помощью МТТ все образцы (за исключением композита светового отверждения) через 24 ч инкубации не оказывали токсического влияния на клетки, поскольку показатели не выходили за пределы 20% разницы с показателями контрольного образца (табл. 1). Однако обращает на себя внимание заметная разница с контролем, характерная не только для светоотверждаемого композита (-28,3%), но и для материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата (-18,1%).

При изучении морфологии клеток после 96 ч инкубации большинство материалов не угнетало ростовую активность клеток, а сами фибробласты не отличались от контроля. В то же время выявлен процесс дегенерации клеток ФЭЧ, что выражалось в округлении клеток, их укорачивании и откреплении от пластика на дне лунки, в присутствии хромокобаль-тового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата и композита светового отверждения (табл. 2; рис. 2). Так, концентрация клеток в присутствии указанных материалов составляла в сравнении с контрольной соответственно 62,2, 72, 64,3%.

После окрашивания клеточной культуры акридиновым оранжевым клетки контроля флюоресцировали в ультрафиолетовом свете желтым цветом, максимально при 550 нм, ядро клеток испускало яркую флюоресценцию, цитоплазма тоже излучала свечение. Клеточная культура в присутствии хро-мокобальтового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата и композита светового отверждения испускали флюоресцентный свет меньшей интенсивности (рис. 3).

Заключение

Возможности современных методов изучения биосовместимости стоматологических материалов, в частности в клеточной культуре фибробластов человека, позволяют дифференцировать материалы по степени воздействия на клетки. В данном экспериментальном исследовании удалось выявить определенное негативное воздействие на фибробласты человека таких материалов, как хромокобальтовый сплав, материал для съемных протезов на основе полиметилметакрилата и композит светового отверждения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Грудянов А.И., Ерохин А.И., Миронова Л.Л., Конюшко О.И. Лабораторное исследование активности фибробластов в сочетании с различными видами подсадочных материалов in vitro. Цитология. 2001; 43(9): 854.

2. Макаренков А.С., Терехов С.М., Калашникова Е.А., Смирнова Т.Д. Изучение вариабельности интенсивности метаболизма МТТ в культуре клеток при оценке пролиферации и гибели клеток с помощью МТТ-теста. Цитология. 2003; 45(9): 899.

3. Подчерняева Р.Я., Суетина И.А., Михайлова Г.Р., Лопатина О.А., Бобринецкий И.И., Морозов Р.А., Селезнев А.С. Культивирование перевиваемых клеточных линий на подложках из углеродных нанотрубок и влияние электростимуляции на пролиферацию клеток. Вопросы вирусологии. 2012; 57(5): 46-8.

Поступила 28.08.15

REFERENCES

1. Grudyanov A.I., Erokhin A.I., Mironova L.L., Konyushko O.I. A laboratory study of the activity of fibroblasts in combination with various types podsadecki materials in vitro Tsitologija. 2001; 43(9): 854. (in Russian)

2. Makarenkov A.S., Terekhov S.M., Kalashnikova E.A., Smirnova T.D. Study of the variability in the intensity of metabolism of MTT

in cell culture in the evaluation of cell proliferation and cell death using MTT assay. Citologiya. 2003; 45(9): 899. (in Russian) 3. Podchernyaeva R.Ya., Suetina I.A., Mikhaylova G.R., Lopatina O.A., Bobrinetskiy I.I., Morozov R.A., Seleznev A.S. The cultivation of continuous cell lines on substrates of carbon nanotubes and the effect of electrical stimulation on cell proliferation. Voprosy viru-sologii. 2012; 57(5): 46-8. (in Russian)

Received 28.08.15

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 615.46.03:616.314-089.28]:981.31

Лебеденко И.Ю., Назарян Р.Г., Щепинова И.В.

СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ КОМПЬЮТЕРНОГО СОПОСТАВЛЕНИЯ ЦИФРОВЫХ КОПИЙ ГИПСОВЫХ МОДЕЛЕЙ

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, 127473, Москва

Данное исследование доказывает целесообразность применения методики компьютерного сопоставления цифровых копий гипсовых моделей, изготовленных по силиконовым оттискам. Методика позволяет объективно оценить клиническую эффективность несъемных зубных протезов в аспекте выявления сколов керамической облицовки и других дефектов, возникающих в процессе эксплуатации, величиной более 51 мкм.

К л ю ч е в ы е с л о в а: сколы керамической облицовки; диоксид циркония; цифровые модели; сопоставление.

Для цитирования: Российский стоматологический журнал. 2015; 19(5): 6-7. Lebedenko I.Yu., Nazaryan R.G., Shchepinova I.V.

COMPUTER AIDED EVALUATION METHOD OF CLINICAL EFFICACY OF FIXED DENTAL PROSTHESES "A.I.Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry", 127473, Moscow

The presented study proves the viability of comparing digital models of fixed dental prostheses to objectively evaluate their clinical efficacy. This method enables us to reveal the defects of prostheses such us chipping of ceramic veneer structure ranging from 51 micron.

Keywords: chipped ceramic lining; zirconia; digital models; mapping; chipping.

Gtation: Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal. 2015; 19(5): 6-7.

Проблема возникновения сколов керамической облицовки зубных протезов по-прежнему является актуальным вопросом современной ортопедической стоматологии. Сколы керамической облицовки в протезах с диоксидциркониевым каркасом - достаточно частое осложнение: у разных авторов процент таких неудач колеблется от 6 до 25 за период менее 5 лет, причем большая часть сколов обнаруживается в многозвеньевых протезах (протяженность 3-4 ед.) (Raig-orodski, Sailer, Molin, Roediger и соавт., 2006-2010). Нет единой причины, вызывающей данное явление, а различная локализация, глубина и площадь таких сколов затрудняют их систематизацию по механизму возникновения.

Нередко локализация или размер скола не позволяют распознать дефект на контрольных осмотрах визуальным методом. Однако не вызывает сомнений важность такой диагностики в связи с возможным риском повышенного износа зубов-антагонистов в зоне, контактирующей с обнажившейся шероховатой поверхностью дефектного участка, потерей окклюзионных взаимоотношений, накоплением зубного налета и др.

Дентальная фотография позволяет под большим увеличением рассмотреть интересующие участки протеза, однако этого недостаточно для решения научных проблем сравнительной оценки различных зубопротезных технологий и материалов.

Для корреспонденции: Лебеденко Игорь Юльевич, lebedenkoi@ mail.ru

For correspondence: Lebedenko Igor Yul'yevich, lebedenkoi@mail.ru

На кафедре комплексного зубопротезирования МГМСУ им. А. И. Евдокимова ведется научная работа по изучению клинической эффективности мостовидных зубных протезов на основе диоксида циркония, изготовленных по различным комбинированным технологиям, для выбора наиболее эффективной в профилактике сколов керамической облицовки.

Для объективной оценки клинической эффективности несъемных мостовидных зубных протезов на основе диоксида циркония применяется следующая методика: после фиксации в полости рта мостовидного протеза и далее через 1, 3, 6, 12, 24 мес по одноэтапному двухслойному А-силиконовому оттиску изготавливают гипсовые модели из сканируемого гипса. Эти модели сканируются лабораторным сканером типа Zirkonzahn S600 АКГ1 (<^гкошакп», Италия) и сохраняются в памяти компьютера. Затем при помощи программного обеспечения Avantis 3D (Россия) производится сопоставление изучаемого фрагмента (в нашем случае им является мо-стовидный протез) с цифровой моделью, характеризующей состояние полости рта сразу после фиксации протеза. Сопоставив таким образом модели, можно оценить размерные расхождения в сравниваемых объектах в числовом и цветовом вариантах (рис. 1 на вклейке). Мы предполагали, что проанализировав эти данные, можно получать объективные показатели изменений в протезе в процессе клинической эксплуатации, фиксируя наличие сколов, их площадь, глубину и точную локализацию.

Однако, понимая многоэтапность данной методики и связанные с этим возможные погрешности, накапливающиеся на каждом из этапов, мы провели уточняющее исследование. Цель исследования - определение суммарного числового