CC BY
66
Цитотоксичность нитроксильных радикалов в отношении опухолевых и диплоидных клеток человека in vitro и оценка их противовирусной активности
И. А. КИРИЛЮК1, В. А. СВЯТЧЕНКО2, Д. А. МОРОЗОВ1, Е. И. КАЗАЧИНСКАЯ2, Н. Н. КИСЕЛЕВ2,
С. М. БАКУНОВА1, М. А. ВОЙНОВ1, В. Б. ЛОКТЕВ2, И. А. ГРИГОРЬЕВ1
1 Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН, Новосибирск
2 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области
In vitro Cytotoxicity of Nitroxyl Radicals with Respect to Tumor and Diploid Human Cells and Estimation of Their Antiviral Activity
I. A. KIRILYUK, V. A. SVYATCHENKO, D. A. MOROZOV, E. I. KAZACHINSKAYA, N. N. KISELEV,
S. M. BAKUNOVA, M. A. VOINOV, V. B. LOKTEV, I. A. GRIGORYEV
N.N.Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry,
Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
State Scientific Centre of Virology and Biotechnology Vektor, Koltsovo, Novosibirsk Region
Проведён химический синтез 39 водорастворимых нитроксильных радикалов различных классов, относящихся к радикалам пиперидинового, пирролидинового и имидазолидинового рядов. Среди 39 исследованных нитроксильных радикалов 27 препаратов обладают цитотоксичностью in vitro в отношении культуры опухолевых клеток А431. Наиболее активные нитроксильные радикалы имели CC50 для клеток SW480 и А431 в пределах 0,16—2,5 мМ при индексе селективности 3,91—7,81 по отношению цитотоксичности препаратов к клеткам нормального фенотипа Л68 и опухолевым клеткам. Тестирование противовирусной активности показало, что 16 и 22 нитроксильных радикалов проявляют противовирусную активность в культуре клеток Vero в отношении вируса Западного Нила и вируса простого герпеса второго типа соответственно, а ЕС50 колебалась в пределах 0,09—3,45 мМ. Некоторые нитроксильные радикалы обладают только противовирусной активностью, а ряд соединений проявляли цитотоксичность и противовирусную активность одновременно.
Ключевые слова: нитроксильные радикалы, цитотоксичность, противовирусная активность, опухолевые клетки.
Thirty nine water soluble nitroxyl radicals of various classes, belonging to piperidine, pyrrolidine and imidazolidine series were synthesized. Twenty seven of them were cytotoxic in vitro with respect to the tumor cell culture A431. The CC50 of the most active nitroxyl radicals with respect to cells SW480 and A431 was within 0.16—2.5 mM at the selectivity index of 3.91—7.81 in relation to cytotoxicity of the compounds for the cells of the normal L68 phenotype and tumor cells. The tests on the antiviral activity showed that 16 out of 22 nitroxyl radicals had antiviral activity in Vero cell culture with respect to the West Nile virus and Herpes simplex virus of type II respectively. The EC50 ranged within 0.09—3.45 mM. Some of the nitroxyl radicals had only antiviral activity, but a number of the compounds had both cytotoxic properties and antiviral activity.
Key words: nitroxyl radicals, cytotoxicity, antiviral activity, tumor cells.
Введение
Нитроксильные радикалы — обширный класс стабильных органических радикалов, который уже много лет используется в биофизических исследованиях благодаря устойчивости и простому спектру электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), чувствительному к различным параметрам окружения [1]. Устойчивый парамагнетизм нитроксильных радикалов делает возможным их использование в качестве контрастирующих агентов
© Коллектив авторов, 2012
Адрес для корреспонденции: 630090 Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 9. Новосибирский институт органической химии им.
Н. Н. Ворожцова
в ядерной магнитной томографии, а также спиновых зондов в различных модификациях ЭПР-спе-ктроскопии и ЭПР-томографии [2—4]. Другое важное качество нитроксильных радикалов — их выраженные антиоксидантные свойства [2, 5]. В настоящее время признано, что одним из факторов ответственных за возникновение и развитие различных форм злокачественных новообразований является окислительное поражение клеток тканей, включая повреждение ДНК во время окислительного стресса [6]. Показано, что нитроксильные радикалы, модифицируя окислительный стресс и изменяя окислительно- восстановительный статус тканей, способны изменять
многие метаболические процессы. Например, нитроксильные радикалы активизируют процесс апоптоза опухолевых клеток [У]. Нитроксильный радикал TEMPOL (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-оксил, 1) при использовании совместно с химиопрепаратами доксорубицином или митохант-ром потенцирует противоопухолевый эффект in vivo, что выражается в более эффективном подавлении роста клеток карциномы простаты человека, привитых бестимусным мышам [8]. Показана также перспективность применения нитроксильных радикалов при проведении радиотерапии злокачественных новообразований [9].
Биологическая активность нитроксильных радикалов может определяться не только свойствами нитроксильного фрагмента, но и наличием фармакофорных фрагментов в составе их молекул или в составе молекул их метаболитов. Присоединение нитроксильных фрагментов к молекулам известных биологически активных соединений, в том числе противораковых препаратов, по-разному влияет на противораковую активность таких спин-меченных препаратов [10—16]. В то же время некоторые проявления биологической активности нитроксильных радикалов, например TEMPOL, могут быть не связаны со свободно-радикальной природой соединений [17].
В данной работе представлены результаты исследования цитоксической активности панели синтезированных нитроксильных радикалов в отношении опухолевых и диплоидных клеток человека in vitro и оценка их противовирусной активности в отношении ДНК-содержащего вируса простого герпеса второго типа (ВПГ-2) и PH^ содержащего вируса Западного Нила (ВЗН).
Материал и методы
Нитроксильные радикалы. CMmra нитроксильных радикалов, представленных в таблице 1, соединений 1—8 [18], 9 [39], 10 [19], 11 [20], 12 [6], 13 [21], 14 [22], 15 [23], 16 [24], 17 [25], 18—19 [26], 20 [27], 21 [28], 22 [29], 23 [30], 24 [31], 25—27 [У], 28 [32], 29—31 [33] осуществляли в соответствии с методиками, приведёнными в литературе. Использовали аналитические образцы или образцы с COb не менее 97% по данным ВЭЖХ. ИК-спектры препаратов определяли на спектрометре Bruker Vector 22 FT-IR в KBr при концентрации 1:150 или в тонком слое. УФ спектры снимались на приборе HP Agilent 8453 в EtOH (10-4 M растворы). ^еирь: ЯMP 1Н и 13C записаны на спектрометрах Bruker AV300 и AV400 в 5—10% растворах при температуре 300 К. В качестве стандарта использовали сигнал растворителя. Температуры плавления определены на микро-нагревательном столике Кофлера. Контроль за ходом реакций осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (TCX) на пластинках Sorbfil UV-254. Для хроматографической очистки полученных веществ использовали силикагель для колоночной хроматографии Kieselgel 60 (Merck).
Исследуемые соединения растворяли в 1 мл физиологического раствора из расчёта получения 100 мM исходных растворов. Нерастворимые в физиологическом растворе соединения растворяли в ДMCO. Для нескольких соединений готовились исходные растворы меньшей концентрации: 30 и 32—25 мM, 39—50 мM.
Клеточные линии. В исследовании использовали культуры опухолевых клеток А431 (клетки эпидермоидной карциномы человека) и SW480 (клетки аденокарциномы толстой кишки человека), а также культуры клеток Л68 (диплоидная культура клеток лёгкого человека) и Vero (перевиваемая культура клеток почки зелёной мартышки). Клетки культивировали в среде Игла ДMEM (Gibco BRL), содержащей 5—10% эмбриональной сыворотки телёнка (Gibco BRL), 2мM L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина сульфата при 37°C в культуральных пластиковых флаконах (Costar, C0A).
Исследование цитотоксической активности соединений в отношении опухолевых клеток in vitro (МТТ-тест). MTT-тест выполняли по методике, описанной в [34] с использованием клеток А431, SW480 или Л68. Каждая экспериментальная точка выполнялась в трёх повторностях. Учёт результатов проводили на микропланшетном спектрофотометре Multiscan при длине волны 492 hM. Значения 50% цитотоксической концентрации (CC50) рассчитывали согласно [34].
Исследование противовирусной активности препаратов. Штамм Eg101 ВЗН был получен из коллекции вирусных препаратов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского. Штамм MS ВПГ-2 был получен из Американской коллекции типовых культур. Вирусы культивировали на культуре клеток Vero в среде Игла-MEM с содержанием 2% эмбриональной сыворотки. Tитpoвaниe инфекционной активности ВПГ-2 и ВЗН проводили, как описано [35, 36]. Противовирусную активность исследуемых соединений in vitro оценивали в соответствии с [37].
Результаты и обсуждение
Нитроксильные радикалы. В работе использована серия водорастворимых нитроксильных радикалов различных классов 1-39 (табл. 1). Для придания гидрофильности исследуемым соединениям использовались карбоксильная группа, аминогуанидиновый фрагмент или спиртовые группы. На рисунке 1а-е приведены схемы синтезов для оригинальных соединений 32—39. Седине -ние 33 (рис. 1 а) получали по аналогии с разработанными ранее методиками синтеза производных 4-амино-2,5 -дигидроимидазол-1 - оксилов [38]. Для этого 4,4-диметил-2-(2-пиридил)-4Н-имида-зол-5-карбонитрил-3-оксид (40) обрабатывали 4 -метиламино-2,2,6,6-тетраметилпиперидином (41). В соответствии с литературными данными, взаимодействие приводит к замещению циано-группы, причём в качестве нуклеофила выступает менее стерически затруднённый метиламиновый фрагмент. Полученный 4Н-имидазол-3-оксид 42 обрабатывали этилмагнийбромидом, и образовавшийся после разложения избытка реактива Гри-ньяра водой гидроксиламин 43 без выделения окисляли диоксидом свинца в соответствующий нитроксильный радикал 33.
По аналогии с литературной методикой синтеза 3-((3-карбоксипропанамидо)-метил)-2,2,5,5-тетраметилпиперидин-1-оксила (9) [39] ацилиро-ванием 3-аминометил-проксила (13) янтарным ангидридом получали нитроксильный радикал 34 (рис. 1 а). Tpифeнилфocфoниeвую соль 35 получали из того же аминометильного производного 13 по аналогии с методикой получения нитроксильного радикала 14 [40]. Для этого амин 13 сначала
Таблица 1. Определение цитотоксичности исследуемых соединений в отношении опухолевых клеток А431 и исследование антивирусной активности нитроксильных радикалов в отношении ВЗН и ВПГ-2 in vitro
1,25+0,20
0,63+0,07
1,14+0,35
1,38+0,40
1,25+0,15
>10,00
2,50+0,23
5,00+0,35
1,79+0,45
1,28+0,30
> 10,00
0,53+0,15
2,50+0,25
1,30+0,25
0,51+0,10
> 10,00
0,23+0,14
10
1,25+0,13
0,22+0,
11
2,50+0,22
3,45+0,84
12
0,63+0,06
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Продолжение табл. 1.
14
10,00+0,70
15
> 10,00
1,90+0,55
0,21+0,14
16
> 10,00
1,43+0,40
1,02+0,35
17
2,50+0,22
18
2,50+0,28
0,64+0,25
19
0,63+0,0
0,54+0,15
20
1,25+0,12
1,86+0,52
0,12+0,05
21
2,50+0,30
0,24+0,10
0,32+0,12
22
0,32+0,02
>0,15
>0,15
23
10,00+0,63
24
1,25+0,18
0,16+0,07
Продолжение табл. 1.
Цитотоксичность (СС50 ± БЕ, мМ)
26
> 10,00
0,60+0,20
27
2,5+0,22
0,34+0,12
28
> 10,00
0,11+0,05
29
>10,00
3,07+0,57
30
> 2,50*
31
> 2,50*
32
> 2,50
0,24+0,11
33
> 6,00
0,43+0,14
34
1,25+0,15
0,09+0,03
35
> 2,50*
37
2,50+0,24
0,16+0,05
38
2,50+0,22
0,67+0,14
0,81+0,20
39
0,32+0,02
>0,15
>0,15
Эмбихин
0,03+0,004
Цисплатин
0,10+0,01
Рибавирин
0,10+0,03
0,16+0,04
Примечание. > — отсутствие цитотоксического эффекта исследуемых соединений в указанной и меньших концентрациях; >* — возможный цитотоксический эффект исследуемых соединений в точках с максимальными концентрациями перекрывается цитотоксичностью ДМСО, содержащегося в растворах соединений (10 и 5%, соответственно). «—» отсутствие эффекта ингибирования вирусной репликации при концентрациях препарата 5.00 мМ и менее; БЕ — стандартная ошибка средней величины СС50 или ЕС50 ^<0,05); н. и. — не исследовали.
ацилировали хлорацетилхлоридом, а затем полученную хлорацетамидную спиновую метку 44 использовали для алкилирования трифенилфосфина (рис. 1 б). 3,4-Бис-(метоксикарбонил)-2,2,5,5-тет-раметилпирролидин-1-оксил (32) получали алки-лированием дикарбоновой кислоты 20 диазометаном (рис. 1 в).
Удобным методом введения гидрофильной группы оказалась реакция карбонильных производных, например, 4-оксо-ТЕМПО (2), с амино-гуанидином. Карбонильное соединение может быть получено т situ, например гидролизом ими-на. Таким образом, из липофильного трет-бути-лимина 45 был получен гидрофильный радикал
37. Водорастворимость полученных НР 36 и 37 обеспечивается высокой основностью гуанидинового фрагмента, благодаря которой эти радикалы в нейтральной среде существуют в виде катионов (рис. 1 г). Сложноэфирная группа 4-метоксикар-бонил-2,2,5,5-тетраметил-2,5-дигидроимидазол-1-оксила (46) [41] легко реагирует с аминами, в том числе с трис-гидроксиметиламинометаном (рис. 1 д). Помимо описанного в литературе ни-тронилнитроксильного радикала 22 в работе использовали его цинковый комплекс. Любопытно, что комплекс, не содержащий аммиака, образуется при действии аммиачного комплекса хлорида цинка (рис. 1 е).
В набор нитроксильных радикалов 1-39 включены представители различных рядов, существенно различающиеся по своим физическим и химическим свойствам. Так, радикалы пиперидинового ряда (1—3, 9—13, 29, 36) некоторые представители рядов 3-имидазолина (19, 22, 24, 37, 38) и 3-имида-золин-3-оксида 18, а также нитронилнитроксиль-ные радикалы 20 и 21, являются весьма сильными окислителями, а радикалы пирролидинового 4, 5, 14—17, 31 и 35 и имидазолидинового ряда 23, напротив, имеют самые низкие окислительные потенциалы [42]. В состав исследуемой группы соединений вошёл нитроксильный радикал 30,
содержащий объёмные заместители в окружении радикального центра, придающие устойчивость к действию биогенных восстановителей [38]. Следует также отметить, что нитронилнитроксильные радикалы 20 и 21 отличаются способностью селективно реагировать с окисью азота N0, являющейся важным компонентом клеточной сигнальной системы [43]. Можно ожидать, что биологическая активность исследуемых соединений будет зависеть от их распределения в клетках — заряда, способности проникать через клеточные мембраны селективно накапливаться в различных отделах клетки. Поэтому, в набор исследуемых соедине-
ние. 1. Принципиальные схемы синтеза нитроксильных радикалов 32—39
Таблица 2. Определение цитотоксичности исследуемых соединений в отношении опухолевых клеток А431, SW480 и нормальных клеток человека Л68
Наименование препарата Цитотоксическая концентрация ^C50 + SE, мM) Индекс селективности*
Клетки A431 Клетки SW480 Клетки Л68 ^5^68/^5,^431 ^^68/ ^^480
1 1,25+0,12 2,50+0,22 2,50+0,30 2,00 1,00
2 0,63+0,05 0,63+0,04 2,50+0,25 3,97 3,97
10 1,25+0,15 1,25+0,20 1,25+0,14 1,00 1,00
12 0,63+0,04 0,63+0,07 2,50+0,17 3,97 3,97
22 0,32+0,02 0,16+0,02 1,25+0.09 3,91 7,81
24 1,25+0,07 1,25+0,09 1,25+0,12 1,00 1,00
25 0,63+0,04 0,63+0,06 0,63+0,04 1,00 1,00
34 1,25+0,12 1,25+0,09 1,25+0,10 1,00 1,00
36 0,63+0,04 0,63+0,04 0,63+0,06 1,00 1,00
39 0,32+0,03 0,32+0,02 1,25+0,17 3,91 3,91
Эмбихин 0,03+0,01 0,12+0,03 0,24+0,02 8,00 2,00
Примечание. * — Индекс селективности (ИС) — отношение СС50 исследуемого соединения для клеток нормального фенотипа к СС— для опухолевых клеток.
ний включены и липофильные (8, 19, 30, 35) и гидрофильные производные, в том числе нейтральные (15, 16, 38) катионные (20, 28, 29), анионные (5, 7, 9, 10, 17, 26, 27) и цвиттерион 11. Соединения 13, 14, 22, 24, 32, 36 и 37 способны обратимо про-тонироваться и при физиологических рН частично или полностью превращаются в катионы. Липофильные катионы 12 и 34 способны селективно накапливаться в митохондриях за счёт трансмембранного потенциала [44]. Предполагалось, что исследование такого широкого набора производных поможет выявить структурные факторы и особенности физических свойств, определяющие биологическую активность нитроксильных радикалов.
Цитотоксическая активность нитроксильных радикалов. Определение цитотоксической активности исследуемых соединений проводили в два этапа. На первом этапе был проведён скрининговый анализ цитотоксичности изучаемых нитроксильных радикалов для опухолевой культуры клеток А431, используемой для исследования активности кандидатных противоопухолевых препаратов [45, 46]. Результаты исследования цитотоксичности 39 нитроксильных радикалов в отношении клеток А431 представлены в табл. 1. СС50 удалось определить для 27 соединений. Остальные нитроксильные радикалы не проявили достоверной цитотоксической активности, в том числе при максимальных исследованных концентрациях. Для 4 нерастворимых в воде соединений СС50 не были определены вследствие того, что возможный цитотоксический эффект перекрывался цитотоксичностью ДМСО. Максимальной из исследованных соединений цитотоксичностью обладали нитроксильные радикалы 2, 12, 19, 22, 25, 36 и 39, значения их СС50 колебалась в пределах 3.2—6.3х10-4 М. Для 7 соединений СС50 равнялась 1.25 мМ, цитотоксические концентрации остальных нитроксильных радикалов находились в интервале от 2.5 до 10 мМ. Рекомендуемая цитотоксичная активность (СС50) для новых химио-
препаратов должна быть не менее 10-4 М [47]. Противоопухолевые препараты эмбихин и цисплатин обладали более выраженной цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток А431. Так, CC50 эмбихина была в 10 раз ниже, чем у наиболее активного нитроксильного радикала 22 (табл. 1).
Наиболее активные нитроксильные радикалы тестировали на культурах клеток А431, SW480 и Л68 (табл. 2.). Нитроксильные радикалы 10, 24, 25, 34 и 36 на культурах клеток ракового и нормального фенотипа показали одинаковый уровень цитотоксичности. Соединения 2, 12, 22 и 39 показали значимый уровень избирательности по отношению к опухолевым клеткам. Индекс селективности (ИС) in vitro для исследуемых соединений 2, 12, 22, 39 составлял 3,91—3,97, а препарат 22 имел ИСЛ68/SW480, равный 7,81. Данные значения сравнимы с ИСЛ68/А431 эмбихина, составляющим 8,00, и превосходят значение ИСЛ68/SW480 эмбихина, равное 2,00. Индекс селективности многих противоопухолевых химиопрепаратов обычно составляет 6—8 [48, 49]. Полученные данные удовлетворительно совпадают с описанной ранее цитотоксической активностью нитроксильного радикала TEMPOL в отношении опухолевых клеток человека MCF-7/ADR и клеток нормального фенотипа HBL-100, составляющей 0,41 мМ и 0,94 мМ соответственно (ИС — 2,29) [50].
Было отмечено, что нитроксильные радикалы 10, 24, 25, 34 и 36 в концентрациях 5—10 мМ вызывают лизис клеток А431, SW480 и Л68 непосредственно после добавления, а через 3 ч визуальные цитотоксические проявления отмечаются и при более низких концентрациях. Соединения 2, 12, 22, 39 и эмбихин не вызывают лизиса клеток ни сразу после добавления, ни через 3 ч инкубации даже при концентрации 10 мМ. Литические проявления регистрируются только через 24 ч инкубации; например лизис клеток А431 наблюдается в присутствии радикала 2 в концентрациях 1,25—10 мМ, а через двое суток инкубации и при 0,63 мМ.
Таким образом, среди исследуемых соединений выявлены нитроксильные радикалы, обладающие избирательной цитоксической активностью в отношении опухолевых клеток. Для проведения дальнейших исследований противоопухолевой активности нитроксильных радикалов in vivo наиболее перспективными являются 2, 12, 22 и 39.
Противовирусная активность нитроксильных радикалов. Противовирусная активность описанных выше 39 нитроксильных радикалов в отношении ВЗН и ВПГ-2 представлена в табл. 1. Показано, что 16 и 22 нитроксильный радикал ингибируют репликацию ВЗН и ВПГ-2 соответственно. EC50 для этих препаратов варьировали в очень широких пределах от 0,09 до 3,45 мМ. Препараты 2, 6, 8, 15, 16, 20, 21 и 38 обладали антивирусной активностью в отношении двух вирусов. Для 12 соединений не было выявлено достоверной антивирусной активности. Некоторые нитроксильные радикалы обладали антивирусной и цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток. В ряде случаев противовирусная активность проявлялась в концентрациях, близких к цитотоксичным. Значения противовирусной активности вполне сравнимы с активностью рибавирина (табл. 1) и хорошо согласуется с опубликованными данными для рибавирина по отношению к ВЗН [51]. Однако, например, при их использовании для наружной терапии герпетических поражений можно существенно увеличить концентрацию антивирусного средства в составе препарата и избежать его возможной токсичности при парентеральном введении. Так, ацикловир для наружного применения имеет концентрацию активного компонента до 50 мг/мл.
Об антивирусной активности нитроксильных радикалов известно весьма мало. Так, ранее было установлено, что нитроксильный радикал 4-maleimido-TEMPO способен ингибировать ин-фекционность вируса простого герпеса первого типа [52]. Исследование противовирусной активности нитроксильно-радикальных производных азидотимидина (АЗТ) показало, что по сравне-
ЛИТЕРАТУРА
1. McConnell H. M. Spin labeling: theory and applications / Berliner L., ed. New York: Academic Press; 1976.
2. Soule B. P., Hyodo F, Matsumoto K.-I. et al. The chemistry and biology of nitroxide compounds. Free Radic Biol Med 2007; 42: 1632—1650.
3. Kuppusamy P., Afeworki M., Shankar R., et al. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of tumor heterogeneity oxygenation in a murine model. Cancer Res 1998; 58: 1562—1568.
4. Matsumoto K, Hyodo F., Matsumoto A. et al. High-resolusion mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents. Clin Cancer Res 2006; 12: 2455—2462.
5. Wang Y, Larrick J. W. Antioxidant nitroxides and nitrones as therapeutic agents. U. S. Patent 2004; No: US 6,717,012.
6. Beckman K, Ames B. Oxidative decay of DNA. J Biol Chem 1997; 272: 19633—19636.
7. Zhao Q., Fujiwara, Kondo T. Mechanism of cell death induction by nitroxide and hyperthermia. Free Rad. Med. 2006; 40: 1131—1143.
нию с АЗТ нитроксильные производные обладают меньшей активностью по отношению к вирусу иммунодефицита человека первого типа, но в отличие от АЗТ, который имеет низкую активность против цитомегаловируса и вируса везикулярного стоматита, его нитроксильные производные достаточно эффективно ингибируют репродукцию этих вирусов [53].
Имеющиеся данные не позволяют высказать значимую гипотезу о механизме антивирусного действия нитроксильных радикалов. Недавно было показано, что ариловые производные рода-нина обладают выраженной активностью против широкого спектра оболочечных вирусов, как РНК-содержащих (включая ВЗН), так и ДНК-со-держащих. Эти соединения связываются с вирусными липидными мембранами, тем самым препятствуя их слиянию с клеточными мембранами и проникновению генетического материала оболочечных вирусов внутрь клетки [54]. Возможно, противовирусная активность исследуемых нитроксильных радикалов обусловлена похожим механизмом. Другая возможность связана с их цитотоксической активностью. Вполне возможно, что репликация вирусов в этих условиях также ингибируется.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований противоопухолевой и антивирусной активности нитроксильных радикалов in vivo. Некоторые исследованные нитроксильные радикалы обладают выраженной опухолево-специфичной цитотоксичностью и противовирусной активностью одновременно. Данные свойства делают их весьма перспективными для дальнейших исследований их активности в отношении вирусинду-цированных опухолей и онкологических заболеваний, осложнённых вирусными инфекциями.
Данное исследование было поддержано грантом Х.Д. № 16/09-РД-М, грантами Президента Российской Федерации НШ-387.2008.4 и НШ-65387.2010.4 и грантом Минобрнауки № 11.G34.31.0034.
8. Sui S., Mitchel J., Samuni A. et al. Nitroxide Tempo, a small molecule, induces apoptosis in prostate carcinoma cells and suppresses tumor growth in athymic mice. Cancer 2005; 103: 1302—1313.
9. Krishna M., Samuni A., DeGraff W. et al. Potential use of nitroxides in radiation oncology. Cancer Res 1992; 52: 1750—1753.
10. Selvendiran K., Ahmed S., Dayton A. et al. Safe and targeted anticancer efficacy of a novel class of antioxidant-conjugated difluorodiarylidenyl piperidones: Differential cytotoxicity in healthy and cancer cells. Free Rad Biol Med 2010; 48: 1228—1235.
11. Zhang J., Zhang Z., Hui L. et al. Novel semisynthetic spin-labeled derivatives of podophyllotoxin with cytotoxic and antioxidative activity. Bioorg Med Chem Let 2010; 20: 983—986.
12. Jin Y., Chen S., Tian X. Synthesis and biological evaluation of new spin-labeled derivatives of podophyllotoxin. Bioorg Med Chem 2006; 14: 3062—3068.
13. Gadjeva V. G. Two spin labeled triazenes: relationship between biochemical and biological activities. Int J Pharm 2002; 247: 39—45.
14. Zheleva A. M., Gadjeva V. G. Spin labelled nitrosoureas and triazenes and their non-labelled clinically used analogues — a comparative study
on their physicochemical properties and antimelanomic effects. Int J Pharm 2001; 212: 257—266.
15. Sosnovsky G., Bell P. In the search for new anticancer drugs. 29. A study on the correlation of lipophilicities, ionization constants and anticancer activities of aminoxyl labeled tepa congeners. Life Sciences 1998; 62: 639—648.
16. Sosnovsky G., Li S. W. In the search for new anticancer drugs XII. Synthesis and biological evaluation of spin labeled nitrosoureas. Life Sciences 1985; 36: 1479—1483.
17. Kaledin V. I., Popova N. A., Nikolin V. P. et al. Tempol reduces the therapeutic effect of cyclophosphamide on an experimantal tumour model. Free Rad Res 2009; 43: 685—690.
18. Розанцев Э. Г. Свободные иминоксильные радикалы, Химия. М.: 1970.
19. Мишарин A. Ю., Поляновский О. Л. Синтез и применение спин-меток 2,2,6,6-тетраметил-1-оксилпиперидин-4-малеинимида и 2,2,6,6-тетраметил-1-оксилпиперидин-4-изомалеинимида. Изв. АН СССР. Сер хим 1974; 11: 2526—2529.
20. Rassat A., Rey P. Nitroxides 23. Preparation of amino acid free radicals and their complex salts. Bull Soc Chim Fr 1967; 815—817.
21. Nakatsuji S., Takai A., Nishikawa K. et al. Magnetic properties of charge-transfer complexes based on TEMPO radicals. Chem Commun 1997; 3: 275—276.
22.
23
Hankowsky H. O., Hideg K., Lex L. Nitroxyls. 8. Synthesis of nitrox-ylphosphinimines — a convenient route to amine, isothiocyanate. aminocarbonylaziridine, and carbodiimide nitroxyls. Synthesis 1981; 2: 147—149.
Hideg K., Hankovszky H. O., Lex L., Kucsar G. Nitroxyls. 6. Synthesis and reactions of 3-hydroxymethyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dihydropy-rrole-1-oxyl and 3-formyl derivatives. Synthesis 1980; 11: 911—914.
24. Sosnovsky G., Cai Z. W. A study of the favorskii rearrangement with 3-bromo-4-oxo-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl. J Org Chem 1995; 60: 3414—3418.
25. Miyake M., Shen J., Liu Sh. et al. Acetoxymethoxycarbonyl nitroxides as electron paramagnetic resonance proimaging agents to measure O-2 levels in mouse brain: A pharmacokinetic and pharmacodynamic study. J Pharmacol Exp Ther 2006; 318: 1187—1193.
26. Воинов М. В., Володарский Л. Б. Изв АН Сер хим 1997; 1: 131—136.
27. Woldman Ya. Yu., Khramtsov V. V., Grigor'ev I. A. et al. Spin-trapping of nitric-oxide by nitronylnitroxides - measurement of the activity of no synthase from rat cerebellum. Biochem Biophys Res Com 1994; 202: 195—203.
28. Григорьев И. A., Кирилюк И. A., Стариченко В. Ф., Володарский Л. Б. Получение стабильных нитроксильных радикалов с аминогруппой у a-углеродного атома радикального центра при окислительном аминировании ^^диоксидов и N-оксидов 4Н-имидазола. Известия АН СССР Сер хим 1989; 3: 661—667.
29. Berezina T. A., Reznikov V. A., Volodarsky L. B. Synthesis and some properties of heterocyclic amidine derivatives of 3-imidazoline nitrox-ides. Tetrahedron 1993; 49: 46: 10693—10704.
30. Володарский Л. Б., Резников В. Д., Кобрин B. C. Получение и свойства имидазолиниевых солей, содержащих нитроксильный радикальный центр. Ж орган химии 1979; 15: 2: 415—422.
31. Щукин Г. И., Володарский Л. Б. Взаимодействие амидов производных 3-имидазолина и 3-имидазолин-З-оксида с гипобромитом натрия. Изв АН СССР Сер хим 1979; 28: 228—231.
32. Kirilyuk I., Polovyanenko D., Semenov S. et al. Inclusion complexes of nitroxides of pyrrolidine and imidazoline series with cucurbit[7]uril. J Phys Chem. 2010; 114: 1719—1728.
33. Яньшоле В. В., Кирилюк И. A., Григорьев И. A. и др. Изучение анти-оксидантных свойств нитроксильных радикалов и гидроксилами-нов при взаимодействии с триплетным и дезаминированным ки-нуренином. Изв АН Сер хим 2010; 1: 67—75.
34. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay. J Immunol Meth 1990; 130: 1: 149—151.
35. Леннет Э., Шмидт H. Лабораторная диагностика вирусных и рик-кетсиозных заболеваний. М.: 1974; 44—95.
36. Razumov I. A., Kazachinskaia E. I., Ternovoi V. A. et al. Neutralizing monoclonal antibodies against Russian strain of the West Nile virus. Viral Immunol 2005; 18: 558—568.
37. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: 2000; 1—398.
38. Kirilyuk I. A., Shevelev T. G., Morozov D. A. et al. Grignard reagent addition to 5-alkylamino-4H-imidazole 3-oxides: Synthesis of new pH-sen-sitive spin probes. Synthesis 2003; 6: 871—878.
39. Couet W. R., Brasch R. C., Sosnovsky G. et al. Influence of chemical-structure of nitroxyl spin labels on their reduction by ascorbic-acid. Tetrahedron 1985; 41: 1165—1172.
40. Кирилюк И. A., Каледин В. И.,. Попова Н. A. и др. Нитроксильный антиоксидант TPPA-TEMPO повышает эффективность противоопухолевой терапии на модели перевиваемой лимфосаркомы мышей. Бюлл Эксп Биол Мед 2010; 148: 7: 85—89.
41. Щукин Г. И., Григорьев И. A., Володарский Л. Б. /3-дикарбоновые производные стабильных нитроксильных радикалов 3-имидазо-ла. Изв СО АН СССР Сер хим 1977; 9: 4: 135—140.
42. Володарский Л. Б., Григорьев И. A., Диканов С. A. и др. Имидазоли-новые нитроксильные радикалы, Глава 5. Окислительно-восстановительные реакции нитроксильных радикалов. Новосибирск: Наука Сиб. Отд-е, 1988; 171—216.
43. Khramtsov V., Woldman Ya., Grigor'ev I. et al. Trapping of nitric oxide and nitric oxide synthase activity measurement by nitronylnitroxyl radicals. Magnetic Res Med 1995; 6: 285—287.
44. Murphy M. P., Smith R. A. J. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. Ann Rev Pharmacol Toxicol 2007; 47: 629—656.
45. Benedetto M. Di., Starzec A., Vassy R. et al. Inhibition of epidermoid carcinoma A431 cell growth and angiogenesis in nude mice by early and late treatment with a novel dextran derivative. Br J Cancer 2003; 88: 1987—1994.
46. Heise C., Sampson-Johannes A., Williams A. et al. ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitu-moral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents. Nature Medicine 1997; 3: 6: 639—644.
47. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р. У. Хабриев, ред. М.: 2000.
48. Maher B. A. Researchers are building a viral arsenal to fight cancer. The Scientist 2001; 15: 16: 24.
49. Ring C. J. Cytolytic viruses as potential anti-cancer agents. J Gen Virol 2002; 83: 491—502.
50. Gariboldi M. B., Lucchi S., Caserini C. et al. Antiproliferative effect of the piperidine nitroxide TEMPOL on neoplastic and nonneoplastic mammalian cell lines. Free Rad Biol Med 1998; 24: 913—923.
51. Daya C. W., Smeea D. F., Julandera J. G. et al. Error-prone replication of West Nile virus caused by ribavirin. Antiviral Res 2005; 67: 1: 38—45.
52. Горбунов H. В., Насыров Р. В., Ерин A. H. и др. Эффект нитроксильных радикалов на патогенные свойства герпесвирусов (спиновая метка в исследовании взаимодействия вируса и макрофагов) Бюлл Эксп Биол Мед 1992; 113: 6: 604—606.
53. Сень В. Д., Голубев В. A., Рукина Н. A. и др. Нитроксильные производные 3'-азидо-2'3'-дидеокситимидина, обладающие антивирусной активностью. Патент РФ 2004. № 2103274. БИ: 32/2004
54. Wolf M. C., Freiberg A. N., Zhang T. et al. A broad-spectrum antiviral targeting entry of enveloped viruses. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107: 7: 3157—3162.
