CC BY
126
Общая биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 82-89
УДК 615.277.3
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ И ВЛИЯНИЯ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ АМИНОНИТРОКСИЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПЛАТИНЬЩ’У)
© 2011 г. Н.В. Комлева \ Г.В. Костюк И.И. Пархоменко И.В. Балалаева 2,
В.А. Голубев ^ В.Д. Сень А.А. Терентьев 1
1 Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка 2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
alexei@icp.ac.ru
Поступила в редакцию 24.01.2011
Исследована цитотоксичность и влияние на клеточный цикл ряда комплексов платины(1У), содержащих нитроксильные радикалы. Цитотоксические свойства комплексов усиливаются при удлинении алкильной цепи аксиальных лигандов. Платиновые комплексы вызывают гибель клеток HeLa, а в клетках H1299 - остановку клеточного цикла. Клетки обоих типов наиболее чувствительны к платиновым комплексам в период «S-фазы клеточного цикла.
Ключевые слова: комплексы платины, нитроксильные радикалы, цитотоксичность, клеточный цикл.
Введение
В течение последних 30 лет среди цитоста-тиков одно из лидирующих мест занимают комплексы платины. Согласно доминирующей точке зрения, ключевой стадией механизма противоопухолевого действия цисплатина и его аналогов является присоединение к ДНК. Это присоединение активирует репарацию, нарушение/остановку клеточного цикла и программируемую гибель клеток/апоптоз [1]. В то же время получено достаточно данных о способности комплексов платины как in vitro, так и in vivo генерировать активные формы кислорода (АФК). При этом данные одних авторов позволяют связать с генерацией АФК окислительный стресс и токсические эффекты комплексов платины, например, их ототоксичность [2]. Из данных других авторов [3] следует, что АФК необходимы для запуска апоптоза.
Успешное применение цисплатина в клинике, с одной стороны, и высокая токсичность соединений платиновой группы, с другой стороны, послужили основой для развития работ, посвященных разработке платиновых комплексов и исследованию их противоопухолевых свойств. К настоящему времени синтезированы тысячи платиновых комплексов различной структуры, из них только пять соединений внедрены в клиническую практику. Несколько соединений проходят клинические испытания, в том числе первый платиновый
комплекс перорального применения JM216 (сатраплатин) [4, 5].
Ранее был выполнен синтез и проведены исследования противоопухолевой активности комплексов платины, в структуру которых внесены нитроксильные радикалы [6-11]. Нитроксильные радикалы являются антиоксидантами и проявляют разнообразную биологическую активность [12]. В миллимолярных концентрациях нитроксильные радикалы обладают цитоток-сическим действием [13], а также способны улучшать химиотерапевтические свойства различных классов противоопухолевых соединений [14].
В литературе существуют противоречивые данные о влиянии антиоксидантов на химиотерапию опухолей. В зависимости от типа препарата, эффект может быть как положительный, а именно, может быть достигнуто снижение токсического действия при сохранении противоопухолевой активности, так и отрицательный, выражающийся в снижении противоопухолевой эффективности цитостатика [15]. В этой связи интересно изучить, каким образом нитроксиль-ные радикалы, как антиоксиданты в составе платина(ГУ)-нитроксильных комплексов, могут изменять механизм противоопухолевого действия. Платина(ГУ)-нитроксильные комплексы, полученные нами ранее, в экспериментах на животных показали сравнимую с цисплатином высокую противоопухолевую активность и меньшую токсичность [16].
Цель настоящей работы - синтез ряда новых комплексов платины(ГУ) 1а—г, 2, различающихся строением нитроксильного радикала и аксиальных лигандов, а также исследование их цитотоксичности и влияния на клеточный цикл опухолевых клеток HeLa и H1299.
Экспериментальная часть
Синтез и строение комплексов платины
Анализ на содержание платины осуществляли методом атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрометре AAS-3, точность определения ±3 относит.%. ИК-спектры регистрировали в диапазоне 400-4000 см-1 на спектрометре Specord 75-IR в вазелиновом масле. Электронные спектры записаны в диапазоне 200-800 нм на спектрофотометре Specord UV-VIS. ЭПР-спектры получены при комнатной температуре на приборе SE/X 2544 при СВЧ мощности
2 мВт и модуляции 0.032 мТл. Масс-спектры ЭРИ на положительных ионах измерены на приборе MicrOTOF ГГ (Bruker Daltonics, Germany), калибровка - внешняя (Electrospray Tune Mix, Fluka), напряжение на капилляре 4500 В, ускоряющее напряжение - 500 В, сухой газ -азот (180°С, 0.4 атм, 4 л/мин). Образцы комплексов растворяли в MeCN. Регистрация и обработка данных производилась при помощи программы Compass Data Analysis. Чистоту комплексов контролировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Милихром-4 (колонка 2x80 мм, Separon C18 (7 мкм), элюент - 60%-ный водный MeCN, детектирование при 240 нм).
Цисплатин (Aldrich) применяли без дополнительной очистки. Комплекс JM216 синтезировали как описано в [17]. Исходные соединения e-аммин-d-(4-амино-2,2,6,6-тетраметилпипери-дин-1 -оксил)-a,/-дигидроксо-b,c-дихлороплати-rn^V) и e-аммин-d-(3-амино-2,2,5,5-тетраме-тилпирролидин-1 -оксил)-a,/-дигидроксо-b,c-ди-хлороплатина(IV) получены как описано ранее [11].
е-Аммин-^-(4-амино-2,2,6,6-тетраметилпи-перидин-1 -оксил)-а,/-бис(бутаноато)-Ь, c-ди-хлороплатина(^) (1а). К 0.34 г (0.67 ммоля) тщательно растертого комплекса e-аммин-d-(4-амино-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1 -оксил)^,/-дигидроксо-b,c-дихлороплатина(ГV) при охлаждении льдом и перемешивании прибавили 1.1 мл (6.7 ммоля) свежеперегнанного масляного ангидрида. После растворения исходного комплекса охлаждающую баню убирали. Контроль реакции проводили методом ТСХ на пластинках Aldrich SiO2/Al, элюент - MeCN-MeOH
(2:1), значения Rf для исходного комплекса -0.20, для 1а - 0.75. Через ~0.5 ч исходный комплекс в реакционной смеси уже не обнаруживается. Перемешивание продолжали до достижения общего времени реакции 1 ч и продукт осаждали путем медленного прибавления 4 мл эфира. Суспензию выдержали 20 мин для завершения кристаллизации, продукт отфильтровали, промыли эфиром (2 мл х 3) и высушили в вакууме. Получили 0.34 г (0.54 ммоля, 80%) 1а в виде оранжевых кристаллов. Т. пл. 183-185°С (разложение вещества) (этилацетат-гексан). УФ-спектр (Н20), ^тах/нм (е, л^моль-1 хм-1): 442пл (19), 372пл (144), 216 (34400). ИК-спектр (вазелиновое масло), у/см-1: 1597, 1640, 1658, 3128, 3190, 3237 ^-Н, С=0). Масс-спектр, ш/х, эксперимент (расчет): 628.1541 (628.1672) [М + 1]+. Найдено (%): С 32.10; Н 5.82; С1 11.50; N 6.44; Р1 30.6. С17Н36С12М305Р1 (мол. масса 628.47). Вычислено (%): С 32.49; Н 5.77; С1 11.28; N 6.69; Р 31.04.
Аналогичным методом синтезированы комплексы 1б-г и 2.
е-Аммин-^-(4-амино-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил)-я5/-бнс(пентаноато)-А,с-дихлороплатина(1У) (1б). Получен из 0.67 г (1.37 ммоля) е-аммин-^-(4-амино-2,2,6,6 -тетр аметилпиперидин- 1-оксил) -а,/-дигидроксо-й,с-дихлороплатины(ГУ) и 3 мл валерианового ангидрида. Выход 0.78 г (1.19 ммоля, 75%) в виде желтых кристаллов. Т. пл. 189-190°С (разложение вещества) (этилаце-тат-гексан). УФ-спектр (спирт), ^тах/нм (е, л моль-1см-1): 447пл (18), 375пл (150), 216 (34700). ИК-спектр (вазелиновое масло), у/см-1: 1550, 1595, 1638, 1655, 3110, 3180, 3230 ^-Н, С=о). Найдено (%): С 34.51; Н 6.03; С1 10.92; N 6.28; Р1 30.08. С19Н40С12М305Р1 (мол. масса 656.54). Вычислено (%): С 34.76; Н 6.14; С1 10.80; N 6.40; Р1 29.71.
е-Аммин-^-(4-амино-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-окшл)-я,/-бис(гексаноато)-А,с-дихлороплатина(1У) (1в). Получен из 0.60 г (1.18 ммоля) е-аммин-^-(4-амино-2,2,6,6-
тетраметилпиперидин-1 -оксил)-а,/-дигидроксо-¿,с-дихлороплатины(ГУ) и 1.6 мл (7.1 ммоля) капронового ангидрида. Выход 0.59 г (0.86 ммоля, 73%), т. пл. 179-180°С (разл.) (этилаце-тат-гексан). УФ-спектр (Н20), Хтах/нм (е, л-моль-1-см-1): 442пл (19), 372пл (149), 216 (36100). ИК-спектр (вазелиновое масло), у/см-1:
1596, 1640, 1665, 3135, 3190, 3228 ^-Н, С=0). Масс-спектр, ш/х, эксперимент (расчет): 684.2257 (684.2299) [М + 1]+. Найдено (%): С 36.50; Н 6.32; С1 10.53; N 6.02; 27.5.
C2iH44Cl2N3O5Pt (мол. масса 684.58). Вычислено (%): C 36.84; H 6.48; Cl 10.36; N 6.14; Pt 28.50.
е-Аммин-^-(4-амино-2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-окшл)-я,/-бис(октаноато)-й,с-дихлороплатина(ІУ) (1г). Получен из 0.56 г (1.10 ммоля) е-аммин-й^-(4-амино-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1 -оксил)-а/-дигидроксо-Ь,с-дихлороплатины(ГУ) и 2.5 мл (8.6 ммоля) каприлового ангидрида. Выход 0.64 г (0.86 ммоля, 78%), т. пл. 169-170°С (разл.) (этилаце-тат-гексан). УФ-спектр (H2O), ^тах/нм (s,
л^моль-1хм-1): 442пл (20), 372пл (144), 216 (37000). ИК-спектр (вазелиновое масло), v/см-1:
1597, 1640, 1660, 3145, 3188, 3227 (N-H, C=O). Масс-спектр, m/z, эксперимент (расчет): 740.2757 (740.2925) [M + 1]+. Найдено (%): C 40.26; H 6.92; Cl 9.53; N 5.51; Pt 25.9. C25H52Cl2N3O5Pt (мол. масса 740.68). Вычислено (%): C 40.54; H 7.08; Cl 9.57; N 5.67; Pt 26.34.
е-Аммин-^-(3-амино-2,2,5,5-тетраметил-пирролидин-1-окшл)-я,/-бис(бутаноато)-й,с-дихлороплатина(ІУ) (2). Получен из 0.55 г (1.16 ммоля) е-аммин-^-(3-амино-2,2,5,5-тетраметилпирролидин-1 -оксил)-а/-дигидрок-со-Ь,с-дихлороплатины(ГУ) и 1.5 мл (9.2 ммоля) масляного ангидрида. Выход 0.65 г (1.06 ммоля, 91%), т. пл. 178-181°С (разл.) (этилацетат-гек-сан). УФ-спектр (H2O), ^тах/нм (s, лмоль- см- ): 373пл (180), 216 (33100). ИК-спектр (вазелиновое масло), v/см-1: 1568, 1650, 1710, 3073, 3126, 3205, 3246 (N-H, C=O). Масс-спектр, m/z, эксперимент (расчет): 614.1515 (614.1516) [M + 1]+. Найдено (%): C 31.05; H 5.49; Cl 11.53; N 6.70; Pt 31.1. C16H34Cl2N3O5Pt (мол. масса 614.44). Вычислено (%): C 31.28; H 5.58; Cl 11.54; N 6.84; Pt 31.75.
Клеточная культура
Эксперименты проводили на клеточных культурах HeLa - аденокарциноме шейки матки человека - и H1299 - немелкоклеточной карциноме легкого человека. Клеточные культуры выращивали в атмосфере 5% CO2 в среде DMEM, содержащей 10%-ную телячью эмбриональную сыворотку (PAA Laboratories).
Изучение цитотоксичности комплексов
Для исследования цитотоксичности применяли МТТ-тест. Клетки рассеивались в 24-луночные планшеты (15000 клеток на лунку) в стандартной инкубационной среде. Перед нанесением комплексы платины растворяли в диме-тилсульфоксиде (DMSO). Через 24 ч после рассева в инкубационную среду вносили исследуемые соединения в разных концентрациях, при этом конечная концентрация DMSO составляла 0.1%. Через 24 ч после внесения соединений в
инкубационную среду добавляли 3-(4,5-диметилтиазол-2 -ил) -2,5 - дифенилтетразолий-бромид (МТТ) до конечной концентрации 0.5 мг/мл и клетки окрашивались в инкубаторе в течение 4 ч. После окрашивания инкубационную среду отбирали и кристаллы образованного МТТ-формазана растворяли кислым спиртом (50%-ный изопропиловый спирт, 0.05 Н HCl). Интенсивность окраски определяли при длине волны 570 нм. За 100% принимали интенсивность окраски клеток, обработанных 0.1% DMSO.
Проточная цитофлуориметрия
Клетки рассеивались в чашки Петри (1 млн. клеток на чашку) в стандартной инкубационной среде. Через 24 ч после рассева в инкубационную среду вносили исследуемые соединения в дозах IC50, при этом конечная концентрация DMSO составляла 0.1%. Через 24 ч среду, содержащую погибшие клетки, утратившие контакт с подложкой, отбирали, оставшиеся клетки снимали трипсином и объединяли их с собранными ранее погибшими клетками. Клетки трижды промывали фосфатным буфером (PBS), а затем фиксировали и пермеабилизировали добавлением по каплям охлажденного (-20°С) 70%-ного этилового спирта. Для фиксирования образцы выдерживали 12 ч при температуре +4°С. Этиловый спирт из фиксированных образцов удаляли путем трехкратной промывки раствором 1%-ного бычьего сывороточного альбумина (фракция V) на PBS. Промытые клетки ресуспендировали в растворе, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (фракция V), 0.1 мг/мл йодистого пропидия и 1 мг/мл РНКазы А. После инкубации в течение 1 ч при температуре +37°С образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCali-bur (Becton Dickinson, США) с возбуждающим лазером 488 нм и каналом регистрации 564-606 нм (канал FL2). Сбор данных осуществляли в программе BD CellQuest™ Pro, анализ - в программе WinMDI и ModFIT LT™ (Becton Dickinson, США).
Результаты и их обсуждение
Синтез и строение комплексов
Синтез комплексов проводили по методике, описанной ранее [16]. Строение новых комплексов установлено на основании данных элементного анализа, ИК-, УФ-, ЭПР- и масс-спектров электрораспылительной ионизации (ЭРИ). ЭПР-спектры платина-нитроксильных комплексов состоят из трех линий примерно равной интенсивности, причем константы
Рис. 1. Структуры исследуемых комплексов платины
Рис. 2. Изменение МТТ-окрашивания клеток НеЬа (а) и Н1299 (б) при действии комплексов платины
сверхтонкого расщепления ^ и §-факторы имеют значения, характерные для пиперидин-(1а-г) (§-фактор 2.0056±0.0001, аN = 1.697± ±0.005 мТл) и пирролидин- (2) (§-фактор 2.0053±0.0001, аN = 1.581±0.003 мТл) нитрокси-лов. Полосы электронных спектров комплексов обусловлены наложением поглощений нитрок-сильного и Р^-хромофоров, что удается четко проследить при сравнении спектров платина-нитроксильных комплексов и содержащего только Р^-хромофор комплекса JM216. В ИК-
спектрах присутствуют ожидаемые полосы валентных и деформационных колебаний К-Н-связей при 3100-3250 и 1570-1600 см1 соответственно. Полосы 1630-1670 см-1 в спектрах комплексов принадлежат валентным колебаниям карбонильных групп транс-карбоксилатных лигандов. Для масс-спектров ЭРИ комплексов характерен изотопный кластер полос ионов [М+1] , обу-
г194п,
словленный изотопным составом платины [ Р1 (32.9), 195Р1 (33.8) и 196Р1 (25.3%)] и хлора [35С1 (75.8) и 37С1 (24.2%)]. Во всех случаях экспери-
Рис. 3. Гистограммы окрашивания ДНК йодистым пропидием в клетках НеЬа. а - контроль, б - актиномицин Б (45.6 нМ), в - цисплатин, г - ХМ216, д - комплекс 1а, е - комплекс 1б, ж - комплекс 1в, з - комплекс 1г, и - комплекс 2. Все комплексы платины использованы в дозе ІС50. М1, М2, М3 и М4 - участки гистограммы, соответствующие фракции 8иЪ01 и фазам клеточного цикла 01(00), Б и 02(М) соответственно
ментальный и рассчитанный по программе набор пиков изотопных ионов [М+1]+ (в пределах точности определения масс ± 0.015 а.е.) совпадает. Совокупность приведенных данных однозначно подтверждает строение комплексов. Структуры исследуемых комплексов представлены на рис. 1.
На рис. 2 приведены кривые «доза-эффект» для платина-нитроксильных комплексов в сравнении с цисплатином и ІМ216. Из полученных данных видно, что новые комплексы сравнимы (2) и превосходят по цитотоксичности как цисплатин, так и комплекс ІМ216. Цитотоксичность усиливается в ряду 1а - 1г, что коррелирует с удлинением аксиальных лигандов (см. рис. 1) и усилением липофильности комплексов. Сравнение кривых «доза-эффект» для комплексов, различающихся только строением нит-роксильного радикала (1а и 2), показывает большую цитотоксичность для производных шестичленного радикала - пиперидин-1-оксила.
Строение этих комплексов различается незначительно, и поэтому наблюдаемые существенные различия в цитотоксичности, наиболее вероятно, объясняются отличиями в их антиокси-дантных свойствах.
Из данных по цитотоксичности также видно, что две клеточные линии отличаются по чувствительности к комплексам платины. Снижение МТТ-окрашивания на 50% для клеток НеЬа происходит при концентрациях, в несколько раз ниже по сравнению с клетками Н1299. Различная чувствительность клеток разного происхождения к химическим соединениям хорошо известна, к тому же клетки Н1299 получены из немелкоклеточной карциномы легкого - одного из видов опухолей, плохо поддающихся химиотерапии [18]. В то же время полученные результаты демонстрируют возможность значительного усиления цитотоксичности комплексов пла-тины(ГУ) путем изменения структуры аксиальных лигандов.
Интенсивность флуоресценции
^1/ єиЬС1 | 00 Б 02/М І І I
І І I БиЬвІ - 5.5% С1/60 * 43.7% Э - 35.7% Є2/М * 15.1 %
Интенсивность флуоресценции
ж
БиЬ01 131/00 Э 02/М її її
эиЬС1 -6.7%
вМвО - 53.6%
| Э - 33.0%
1 02/М - 6.7%
виЬ01 01/00 Э 02/М і « і і і
эиЬ01 - 5.5%
01/00-39.7%
\ Б - 36.1 %
\ 02/М-18.7%
■— —
Интенсивность флуоресценции
єиЬОІ 01/00 э 02/М її її
БиЬ01-16.1%
I 01/00 - 39.1%
Б - 36.5%
1 02/М - 8.3%
Интенсивность флуоресценции
зиЬ01 01/00 Э 02/М I л I I I
эиЬ01 - 6.2%
01/00-50.4%
Э - 34.5%
\ 02/М - 9.0%
1- )
эиЬ01 01/00 Э 02/М і . і і і
, эиЬ01 - 7.3%
I 01/00-49.3%
Э - 34.3%
\ 02/М -9.1%
1 J
Интенсивность флуоресценции єиЬЄІ 01/00 э 02/М 1 М 1 1
V. ...Л БиЬ01 - 4.8% 01/00-45.6% Б - 39.9% [ 02/М - 9.7%
Интенсивное . 01/ эиЬ01 I ть флуоресценции 00 Б 02/М I І I
БіМЗІ - 4.8% 01/00-47.8% Э - 32.9% 02/М - 14.5%
Интенсивность флуоресценции
Интенсивность флуоресценции
Интенсивность флуоресценции
Рис. 4. Гистограммы окрашивания ДНК йодистым пропидием в клетках Н1299. Обозначения те же, что и для рис. 3
На рис. 3 и 4 показаны гистограммы окрашивания ДНК в клетках НеЬа и Н1299 до и после обработки клеток платиновыми комплексами в эквитоксических концентрациях (снижающих МТТ-окрашивание на 50%). Действие платиновых комплексов сопоставлялось с влиянием на клетки препарата неплатиновой группы, противоопухолевого антибиотика актино-мицина Б. При действии актиномицина Б на клетки НеЬа заметно расширение основного пика, которое связано, с одной стороны, с гибелью клеток и накоплением их в области 8иЬ01 и, с другой стороны, с увеличением доли клеток в ранней Б-фазе клеточного цикла. Действие препаратов платиновой группы на клетки ЫеЬа имеет другой характер: на гистограммах ДНК заметен сдвиг основного пика в область ранней Б-фазы клеточного цикла. Видно также, что в действии разных платиновых комплексов на клеточный цикл клеток ЫеЬа нет принципиальных отличий.
В то же время сравнение гистограмм на рис. 3 и 4 показывает, что характер действия
всех исследованных соединений на клетки НеЬа и Н1299 различен. Видно, что, в отличие от клеток НеЬа, для клеток Н1299 накопление клеток в области 8иЬ01 при действии цито-токсических соединений выражено в гораздо меньшей степени. Это говорит о том, что в использованных дозах все исследуемые соединения оказывают на клетки Н1299 преимущественно цитостатическое действие. Это наблюдение согласуется с данными о меньшей чувствительности клеток Н1299 к платиновым комплексам (рис. 2). При этом платиновые комплексы, в отличие от актиномицина Б, вызывают заметное снижение относительного содержания клеток в фазах 02 и М клеточного цикла (область гистограммы 02/М). Интересно, что некоторые комплексы платины (1а и 1б), как и актиномицин Б, вызывают повышение количества клеток в ранней Б-фазе, тогда как остальные платиновые комплексы подобного действия не оказывают.
Приведенные данные демонстрируют несколько характерных особенностей действия
платиновых комплексов на клетки. Все исследованные комплексы вызывают снижение количества клеток НеЬа в фазах 02 и М клеточного цикла. С другой стороны, в действии разных комплексов на клетки НеЬа в разной степени проявляются цитотоксические и цитостатиче-ские свойства. Все исследованные соединения вызывают обогащение популяции 8иЬ01, однако для разных комплексов это явление выражено в разной степени. Так, наиболее существенное накопление клеток НеЬа в области 8иЬ01 наблюдается при действии актиномицина Б, комплексов 1а и 1г и, в меньшей степени, комплексов ІМ216 и 2. В действии других комплексов более выражено накопление клеток в фазе Б клеточного цикла. Из данных, приведенных на рис. 3, можно сделать вывод о том, что в цито-токсическом действии исследованных соединений на клетки НеЬа реализуются два основных механизма. Актиномицин Б вызывает клеточную гибель, в основном, на переходе 01-Б, тогда как комплексы платины вызывают гибель клеток преимущественно после их вхождения в Б-фазу клеточного цикла.
Клетки Н1299 более устойчивы к действию цитотоксических соединений, и накопление клеток в области 8иЬ01 под влиянием как актиномицина Б, так и платиновых комплексов выражено слабо. В основном, действие платиновых комплексов на клетки Н1299 проявляется в накоплении клеток в фазе Б и снижении их количества в фазах 02 и М клеточного цикла. Наибольший эффект обогащения популяции 8иЬ01 вызывает комплекс 1а, при этом для него характерно также и самое выраженное влияние на фазу 01/00. В случае комплексов ІМ216 и 2 влияние на фазы 02 и М выражены слабо, основное перераспределение клеток происходит между фазами 01/00 и Б. Из данных, представленных на рис. 4, видно, что клетки Н1299 наиболее чувствительны к исследуемым соединениям в ходе Б-фазы.
Таким образом, основное влияние амино-нитроксильные комплексы платины(1У) оказывают на клетки, проходящие фазу синтеза ДНК, что, очевидно, связано с их способностью к связыванию с ДНК и образованию аддуктов. В клетках НеЬа реализуется преимущественно цитотоксическая активность аминонитроксиль-ных комплексов платины(1У), тогда как на клетки Н1299 они оказывают, в основном, ци-тостатическое действие. Известно, что в клетках Н1299 отсутствует белок р53, один из центральных факторов запуска апоптоза в ответ на повреждения ДНК [19]. Возможно, различия в чувствительности двух линий клеток к ДНК-
повреждающим агентам связано с различиями в функционировании р53-зависимой системы контроля целостности ДНК. В продолжение этой работы планируется провести сравнительное исследование генерации АФК в опухолевых клетках в присутствии цисплатина, комплекса JM216 и платина(1У)-нитроксильных комплексов.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект № 09-03-01187а).
Измерения масс-спектров высокого разрешения ЭРИ выполнены в Отделе структурных исследований ИОХ РАН, Москва.
Список литературы
1. Kelland R. The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy // Nature reviews. Cancer. 2007. У. 7. P. 573-584.
2. Ravi R., Somani S.M., Rybak L.P. Mechanism of cisplatin ototoxicity: antioxidant system // Pharmacology & toxicology. 1995. V. 76. № 6. P. 386-394.
3. Bragado P., Armesilla A., Silva A., Porras A. Apoptosis by cisplatin requires p53 mediated p38a MAPK activation through ROS generation // Apoptosis. 2007. V. 12. № 9. P. 1733-1742.
4. Heffeter P., Jungwirth U., Jakupec M., Hartinger C. et al. Resistance against novel anticancer metal compounds: Differences and similarities // Drug resistance updates. 2008. У. 11. № 1-2. P. 1-16.
5. Wheate N.J., Walker S., Craig G.E., Oun R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials // Dalton Transactions. 2010. V. 39. № 35. P. 8113-8127.
6. Sen’ V.D., Golubev V.A., Volkova L.M., Konovalova N.P. Synthesis and antitumor activity of platinum(II) complexes with trans-3,4-diamino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl // Journal of Inorganic Biochemistry. 1996. У. 64. P. 69-77.
7. Shugalii A.V., Kulikov A.V., Golubev V.A., Li-china M.V., Sen’ V.D. Binding of platinum-diamino-nitroxyl complexes to animal DNA // Journal of Inorganic Biochemistry. 1998. У. 69. P. 67-77.
8. Сень В.Д., Куликов А.В., Шугалий А.В., Коновалова Н.П. Синтез динитроксильных цис-диаминокомплексов платины(П) и их взаимодействие с ДНК // Известия РАН. Сер. хим. 1998. Т. 47. № 8. С. 1640-1644.
9. Сень В.Д., Рукина Н.А., Ткачев В.В., Пись-менский А.В. и др. Синтез, строение и биологическая активность комплексов платины(П) с аминонитрок-сильными радикалами // Известия РАН. Сер. хим. 2000. Т. 49. № 9. С. 1624-1630.
10. Сень В.Д., Шугалий А.В., Куликов А.В. Модификация ДНК цис-диаминокомплексами пла-тины(П) c аминонитроксильными лигандами // Известия РАН. Сер. хим. 2002. Т. 51. № 6. С. 972978.
11. Сень В.Д., Ткачев В.В., Волкова Л.М., Гончарова С.А. и др. Синтез, строение и противоопухолевые свойства комплексов платины(ГУ) с амино-нитроксильными радикалами // Известия РАН. Сер. хим. 2003. Т. 52. № 2. C. 403-408.
12. Soule B.P., Hyodo F., Matsumoto K., Simone N.L. et al. The chemistry and biology of nitroxide compounds // Free Radical Biology and Medicine. 2007. V. 42. № 11. P. 1632-1650.
13. Gariboldi M.B., Lucchi S., Caserini C., Supino R. et al. Antiproliferative effect of the piperidine nitroxide TEMPOL on neoplastic and nonneoplastic mammalian cell lines // Free Radical Biology and Medicine. 1998. V. 24. № 6. P. 913-923.
14. Emanuel N.M., Konovalova N.P. Nitroxyl radicals for cancer chemotherapy // In: Bioactive Spin Labels / Ed. R.I. Zhdanov. N.Y.: Springer-Verlag, 1992. P. 439-460.
15. Biesalski H.K. Frank J. Antioxidants in cancer therapy: Is there a rationale to recommend antioxidants
during cancer therapy? // BioFactors. 2003. У. 17. № 1-
4. P. 229-240.
16. Сень В.Д., Голубев В.А., Луговская Н.Ю., Са-шенкова Т.Е., Коновалова Н.П. Синтез и противоопухолевые свойства новых комплексов платины(1У) с аминонитроксильными радикалами // Известия РАН. Сер. хим. 2006. Т. 55. № 1. С. 60-65.
17. Giandomenico C.M., Abrams M.J., Murrer B.A., Vollano J.F. et al. Carboxylation of kinetically inert platinum(IV) hydroxy complexes. An entrée into orally active platinum(IV) antitumor agents // Inorganic chemistry. 1995. V. 34. № 5. P. 1015-1021.
18. Sanders H.R., Albitar M. Somatic mutations of signaling genes in non-small-cell lung cancer // Cancer genetics and cytogenetics. 2010. V. 203. № 1. P. 7-15.
19. Lee Y.S., Yoon S., Park M.S., Kim J.H. et al. Influence of p53 expression on sensitivity of cancer cells to bleomycin // Journal of biochemical and molecular toxicology. 2010. V. 24. № 4. P. 260-269.
COMPARATIVE ANALYSIS OF CYTOTOXICITY AND THE EFFECT OF PLATINUM(IV) COMPLEXES WITH AMINONITROXYL RADICALS ON THE CELL CYCLE
N.V. Komleva, G.V. Kostyuk, I.I. Parkhomenko, I.V. Balalaeva, V.A. Golubev,
V.D. Sen’, A.A. Terent’ev
Cytotoxicity and the effect of several platinum(IV) complexes with aminonitroxyl radicals on the cell cycle have been studied. Cytotoxic properties of the complexes increase with the lengthening of the alkyl chain of axial ligands. Platinum complexes kill HeLa cells, but they stop the cell cycle in H1299 cells. Cells of both types are most sensitive to the platinum complexes during S-phase of the cell cycle.
Keywords: platinum complexes, nitroxyl radicals, cytotoxicity, cell cycle.
