CC BY
783. Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий. Т.2. Ракообразные. - СПб. ЗИН, 1995. - 627 с.
4. Мануйлова Е.Ф. Ветвистоусые рачки (Cladocera) фауны СССР. - М.-Л.: Наука, 1964. -326 с.
5. Шитиков В.Г., Розенберг Г.С. оценка биоразнообразия - попытка формального обобщения // Количественная гидроэкология. Тольятти: Кассандра, 2009. С. 91-129.
6. ШибаеваМ.Н., МасюткинаЕ.А., Матвее-ваЕ.П., Охапкина А.А. Видовое разнообразие зоопланктона как показатель экологического состояния водоемов Калининградской области 11 с. http://www.klgtu.ru/science/magazine/2013_28/shibae va.pdf Дата обращения
7. Шурганова Г.В. Оценка степени
эвтрофирования водохранилищ средней Волги по показателям видовой структуры зоопланктона X Съезд Гидробиол. общ-ва при РАН. Тез.докл. / -Владивосток: Дальнаука, 2009. - 454 с.
8. Chow-Fraser P., Sprules W.G. Ingibition influence of Anabaena sp. Jn filtratin rate of Daphnia in situ // Can. J. Zool, 1986, 64, №9, 1831-1834.
9. Матвеев В.И., Гейхман Т.В., Соловьева В.В. Самарские пруды как объект ботанических экскурсий. - Самара, 1995. - 44 с.
10. Кириленко Е.В., Шемонаев Е.В.Данные о морфологии и биологии ротана-головешки Perccottus glenii Dybowski, 1877 из озера Круглое Мордовинской поймы Саратовского водохранилища //Изв.СНЦ РАН, 2011, Т.13, № 1(1). С. 207211.
УДК 574.577
CYTOTOXICITY AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF EXTRACTS OF RARE MEDICINAL PLANTS (DIOSCOREA CAUCASIA LYPSKY, ASTRAGALUS DASYANTHUS PALL, WITHANIA SOMNIFERA L.) UNDER IN VITRO CONDITIONS
Kalashnikova E.
Doctor in Biological Sciences, Professor, Department of biotechnology, Moscow state agricultural University MTAA named after K.A. Timiryazev
Zaytseva S.
Associate Professor, PhD in Biological Sciences, Moscow state Academy of veterinary medicine and biotechnology named after K.I. Skryabin, Associate Professor, PhD in Biological Sciences, Department of biotechnology, Moscow state agricultural University MTAA named after K.A. Timiryazev
Doan Thu Thuy Associate Professor, PhD in Biological Sciences Vietnam National University of Agriculture
Kirakosyan R.
Associate Professor, PhD in Biological Sciences, Department of biotechnology, Moscow state agricultural University MTAA named after K.A. Timiryazev
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ РЕДКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ (DIOSCOREA CAUCASIA LYPSKY, ASTRAGALUS DASYANTHUS PALL, WITHANIA SOMNIFERA L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO.
Калашникова Е.А.
д.б.н. профессор кафедры биотехнологии Государственного аграрного университета МСХА имени К.А. Тимирязева
Зайцева С.М.
к.б.н. доцент кафедры кормления и кормопроизводства Московской Государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии МВА имени К.И. Скрябина,
к.б.н., доцент кафедры биотехнологии Государственного аграрного университета МСХА имени К.А. Тимирязева
Доан Тху Тхуи к.б.н. доцент агрономического факультета, Вьетнамский национальный аграрный университет
Киракосян Р.Н. к.б.н., доцент кафедры биотехнологии Государственного аграрного университета МСХА имени К.А. Тимирязева
Abstract
When studying the formation of secondary metabolites in the microclones of medicinal plants, it was found that in vitro the peculiarities of polyphenols accumulation characteristic of intact plants are preserved. Plant extracts obtained from microclones of plants Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L. Have a high cyto-toxic effect on human cancer cells.
Аннотация
При изучении образования вторичных метаболитов в микроклонах лекарственных растений выяснили что в условиях in vitro сохраняются особенности накопления полифенолов, характерные для интактных растений. Растительные экстракты, полученные из микроклонов растений Astragalus Dasyanthus Pall, With-ania somnífera L. оказывают высокое цитотоксическое действие на раковые клетки человека.
Keywords: Dioscorea nipponica Makino, Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L. phenolic compounds (Polyphenols), flavanes, flavanols, Microclonal reproduction, cytotoxic effect
Ключевые слова: диоскорея, астрагал, ашваганда, культуры in vitro, микроклоны, вторичный метаболизм, полифенолы, биологическая активность, цитотоксичность
Фитотерапия является неотъемлемой частью современной медицинской практики, а фитофар-макогнозия - одной из основных фармацевтических наук, изучающей растительное сырье для научной медицины, в том числе и ветеринарной. Особенности метаболизма растительного организма, где помимо реакций первичного обмена, синтезируются разнообразные вещества вторичного происхождения, обладающие высокой биологической активностью, как раз и обуславливают обширное терапевтическое действие их экстрактивных веществ. Растения содержат чрезвычайно разнообразный спектр веществ вторичного происхождения, который насчитывает несколько десятков тысяч индивидуальных соединений, среди которых наиболее распространёнными являются фе-нольные соединения (биофлаваноиды). Широкое применение полифенолов в фармакологии в качестве биологически активных веществ основано на способности к окислению с образованием хинных форм, что определяет их гепатопротекторные, нейрорегуляторные, капиляроукрепляющие, желчегонные и противоопухолевые и другие свойства [1].
Одним из перспективных направлений биотехнологии является сохранение биоразнообразия редких, лекарственных, а также исчезающих форм растений и создание на их основе генетических банков in vitro. В строго контролируемых условиях in vitro при модификации питательных сред и внешних условий культивирования, возможно добиться целевой направленности в синтезе определенных продуктов вторичного метаболизма растительными культурами [2]. Кроме того, экспериментально установлено, что не только дедифференцирован-ные, но и дифференцированные клетки, например, микроклоны сохраняют способность к синтезу соединений, в том числе и фенольной природы, характерную для интактных растений. Данное физиологическое свойство является базовой основой для технологии получения клонированных растений -продуцентов ценных биологически активных веществ.
Перспективными для изучения вторичного метаболизма, в том числе и в строго контролируемых условиях in vitro, являются такие растения, как дио-скорея, астрагал и ашваганда. Особенности вторичного метаболизма и способность к образованию богатого спектра веществ, в том числе и фенольной природы, обуславливает широкое терапевтическое действие экстрактивных веществ указанных растений [3].
В медицинской практике препараты на основе диоскореи применяются для терапии и профилактики атеросклероза сосудов головного мозга и сердечно-сосудистой системы в сочетании с гипертонической болезнью, для улучшения функции и проведения импульсов к сердцу. Из астрагала получают настои для лечения начальных форм гипертонической болезни, недостаточности кровообращения и острых гламеруонефритов, которые обладают антифунгицидными свойствами. Растения ашваганды на протяжении нескольких тысячелетий применяют в народной медицине при лечении физиологических заболеваний, вызванных ок-сидативным стрессом. В аювердической медицине ашваганда считаются одной из самых ценных и основополагающих культур, обладающих имму-номодулирующими и омолаживающими свойствами. Это обусловлено тем, что во всех частях растения (листьях, коре, плодах, семенах, и в большей степени в корне) синтезируются разнообразные вещества вторичного метаболизма - полифенолы и их гликозиды, сапонины, стероидные лак-тоны, олигосахариды, витанолид, а также свободный витаферин А (агликон), обладающий цитотоксическим действием.
Следует отметить, что изучение вторичного метаболизма имеет важное значение не только для фитофармакогнозии, но и для исследований по сохранению биоразнообразия, так как полифенолы оказывают непосредственное влияние на успешность введения растений в культуру in vitro. Исследователями неоднократно отмечалось, что эти вещества могут оказывать как стимулирующий, так и ингибирующий эффект на процессы морфогенеза. Так, например, содержащихся в исходных эксплан-тах вещества фенольной природы, приводят к инги-бированию ростовых процессов на этапе введения эксплантов ценных лекарственных растений в культуру in vitro [4]. Такие культуры в дальнейшем могут быть использованы для воспроизводства растений-регенератов генетически идентичных исходному виду, а также служить источником уникальных биологически активных веществ для фармацевтической промышленности. Однако данных об образовании и локализации, фенольных соединений в растениях, обладающих лекарственными свойствами не многочисленно.
Несмотря на значительные отличия морфофи-зиологических характеристик этих ценных растений, их объединяет высокая биосинтетическая способность к образованию вторичных соедине-
ний, в том числе и фенольной природы - биофла-ваноидов. Как известно, биосинтез и накопление вторичных соединений, отличается пластичностью и зависит не только от видовой принадлежности растений, его органа и стадии онтогенеза, но и от условий произрастания растения [5].
В связи с тем, что в литературе практически отсутствуют данные об образовании вторичных веществ в микроклонах лекарственных растений Di-oscorea, Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L. то целью нашего исследования являлось изучение морфогенетического потенциала данных растений и установление биологической активности их экстрактов in vitro, в качестве потенциальных источников лекарственных препаратов, применяемых и для ветеринарной медицины.
Методы и материалы
Материалом для работы служили растения диоскореи кавказской (Dioscorea caucasia Lypsky), астрагала (Astragalus Dasyanthus Pall) и ашваганды (Withania somnifera L.). В качестве эксплантов использовали семена, побеги, почки, листовые пластинки и многолетние клубни, которые культивировали на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей вещества с цитокининовой (БАП, 21р, кинетин (0,5 -1,0 мг/л)) и ауксиновой (НУК 0,5-1,0 мг/л, ИМК и ИУК 1-7 мг/л) активностью. Растительный материал выращивали в условиях световой комнаты, где поддерживалась температура 25±2°С, 16-ти часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами OSRAM L36/25 с интенсивностью освещения 3,5 тыс. лк. Для укоренения микропобегов использовали модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга, содержащую 'У нормы макросолей, а также сахарозу 20 г/л и ИУК 1 мг/л.
Для извлечения фенольных соединений измельченный растительный материал экстрагировали горячим 96%-ным этанолом. В экстрактах спектрофотометрическим методом определяли содержание суммы растворимых фенольных соединений, флаванов (катехины и проантоцианидины) и флавонолов. Калибровочные кривые строили по рутину и (-) -эпикатехину [6]. На графиках представлены средние арифметические значения и их стандартные отклонения.
Для определения цитотоксического эффекта растительных экстрактов использовали МТТ-тест. Работу проводили в 96-луночном плейте. В каждую лунку вносили раковые клетки в количестве 2*104 кл/лунку и добавляли 100 мкл питательной среды и инкубировали в течение 1 часа. Лиофильно высушенные спиртовые экстракты растений-регенеран-тов (ашваганды и астрагала) растворяли в DMSO до концентрации 5000 мкг/мл, после чего проводили разбавление раствора до 50 мкг/мл и полученные концентрации в дальнейшем наносили на раковые клетки человека. К содержимому каждой лунки добавляли по 25 мкл МТТ (4 мг/мл в PBS), который первоначально был профильтрован, после чего проводили инкубацию в СО2-инкубаторе в течение 4 часов. После этого в каждую лунку добавляли по 50 мкл SDS (20% SDS на воде с 0,02 N HCl или H2SO4) и инкубировали в течении ночи. Затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 570 и 650 нм. В качестве объекта исследования была взята линия клеток M-НеЬа (эпи-телиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния НеЬа, клон М НеЬа, коллекция Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). В контрольном варианте экстракты не вносили.
Результаты и обсуждения Поскольку растения (Dioscorea caucasia Lypsky. Astragalus Dasyanthus Pall, Withania somnifera L.) относятся к ценным исчезающим видам и имеют ограниченный ареал распространения в природе, то большое практическое значение приобретает получение культур in vitro, как возможных источников биологически активных веществ и лекарственных препаратов. Модифицировав гормональный состав питательной среды, мы добились изменения морфофизиологических процессов, которые проявлялись в формировании каллусной ткани в основании первичного экспланта с одновременной регенерацией растений. Микроклоны во всех случаях характеризовались интенсивным ростом, формированием мощной надземной биомассы и высоким коэффициентом размножения (Рис.1).
А
Рис. 1. А - микроклон диоскореи, В - образование микроклубней на микроклоне диокореи, С - формирование микроклонов ашваганды - D и астрагала
Одной из основных задач наших исследований было выяснение особенностей накопления в микроклонах диоскореи соединений фенольной природы, обладающих высокой биологической активностью. Ранее нами было показано, что максимальное содержание полифенолов в растениях диоскореии было в клубнях, (особенно в листьях) [7].
При изучении фенольных соединений в растениях было показано, что при введении в культуру in vitro, у микроклонов диоскореи, также, как и у интактного растения, содержание биофлаваноидов было выше в подземных органах - микроклубнях. Они характеризовались достаточно высоким содержанием растворимых фенольных соединений до
100,00 -
80,00 60,00 40,00 20,00 0,00
I.
побег
многолетние корневища
53,4 мг/г свежей массы, где доля флаванов и флава-нолов составляла 18% и 43%, соответственно. Однако способность к синтезу вторичных соединений в микроклонах была ниже, чем у исходных тканей. Это согласуется с многочисленными данными, свидетельствующими, что в условиях in vitro сохраняется идентичная тенденция к синтезу вторичных соединений, характерных для интактных тканей, но в менее выраженной степени (Рис. 2) [8].
Как следует из анализа литературных источников, растения ашваганды (Withania somnifera) и астрагала (Astragalus) в комплексе вторичных метаболитов превалируют такие вещества, как полифенолы, обладающие противораковой активностью
[9].
I.. .
микроклубни
корни микроклонов
■ суммарное содержание растворимых фенольных соединений мг/г свежей массы
■ содержание флаванов мг/г свежей массы
■ содержание флаванолов мг/г свежей массы
Рис. 2 Суммарное содержание растворимых фенольных соединений, флаванов и флаванолов в интакт-ных растениях диоскореи и инициированных из них микроклонах
Поэтому изучение действия экстрактов данных растений на раковые клетки человека, является актуальным направлением и может служить косвенным признаком биосинтетической способности растений к образованию вторичных веществ обладающих не только биологической активностью, но и цитотоксическим действием.
В работе была изучена цитотоксичность экстрактов, полученных из растений-регенерантов ашваганды и астрагала. Результаты исследований представлены на рисунке 3.
120
so - 100 а>
I 80
а
I 60
л а
g 40
I 20 0
■ микроклоны ашваганды — микроклоны астрагала
Рис. 3 Влияние различных концентраций растительных экстрактов ашваганды и астрагала на
жизнеспособность раковых клеток человека
В результате проведенных исследований было установлено, что растительные экстракты, полученные из растений-регенерантов ашваганды и астрагала, при разных концентрациях обладают различной цитотоксичностью. Как следует из полученных результатов, малые концентрации экстрактов (50 мкг/мл) были не токсичны для исследуемых раковых клеток, о чем свидетельствует 100%-ное их выживание при использовании двух изучаемых экстрактов. Однако, по мере повышения концентрации цитотоксический эффект экстрактов начинал проявляться. Для экстрактов ашваганды, уже при концентрации 250 мкг/мл наблюдали гибель более 40% раковых клеток, а при концентрации 500 мкг/л и выше гибель раковых клеток была в пределах 90-95%.
Что касается экстрактов астрагала, то наибольшей цитотоксичностью обладали экстракты при концентрации 1000 мкг/л, когда выживаемость исследуемых раковых клеток составляла менее 10%, при этом концентрации экстракта 500 мкг/л также характеризовалась высоким цитотоксическим эффектом.
На основе изложенного выше, можно заключить что микроклоны исследованных растений обладают высокой способностью к биосинтезу большего числа разнообразных фенольных соединений, что, несомненно, имеет важное практическое значение как потенциальный источник ценных биологически активных веществ для фарминдустрии. Причем в условиях in vitro при образовании био-флавоноидов сохраняется органоспецифичность, характерная для интактных растений, но в менее выраженной степени. Биохимические данные находят подтверждение и в цитотоксических исследованиях. Наши исследования показали, что вторичные метаболиты могут оказывать не только ингибирую-щий эффект на рост раковых клеток человека, но и могут быть стимуляторами различных морфофи-зиологических процессов, о чем свидетельствует ряд литературных источников [10,11].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Куркин, В.А. Фенилпропаноиды- перспективные природные биологически активные соединения / В.А. Куркин // Самара: Изд. Гос. Мед. Ун-т. - 1996. - С. 31-37.
2. Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений/ А.М.Носов// Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. Под редакцией Р.Г. Бутенко. М. Наука. - 1991.
3. Алексеева, Г.М.//Фармакогнозия. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Санкт-Петербург. СпецЛит. - 2013 г.
4. Дубравина, Г.А. Изменения в образовании и локализации фенольных соединений при дедиф-ференциации тканей тисса ягодного и тисса канадского в условиях in vitro / Г.А.Дубравина, С.М.Зайцева, Н.В. Загоскина // Физиология растений. -2005. - Т. 52. - С. 755-762
5. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растения. LVI Тимирязевские чтения. М.: Наука. 1996. 45с.
6. Запрометов, М. Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. Наука, - 1971. - С. 185-197.
7. Доан Тху Тхуи, Калашникова Е.А., Зайцева С.М., Киракосян Р.Н. Фенольные соединения растений Диоскореи кавказской (Dioscorea caucasica Lipsky), особенности их образования и локализации. // Естественные и технические науки. 2018 №2
8. Доан Тху Тхуи, Зайцева С.М., Калашникова Е.А., Киракосян Р.Н. О влиянии регуляторов роста на способность микроклонов лекарственных растений Dioscorea caucasia Lypsky к образованию и локализации полифенолов // Актуальные вопросы ветеринарной биологии, №2 (38) 2018 С. 39-45
9. Jeong, H. Molecular Discrimination of Medicinal Astragali Radix by RAPD Analysis. Immunophar-macology and Immunotoxicology / H. Jeong, J. Um, S. Kim, K. Koh, W. Hwang, K. Lee, C. Kim, H. Kim // Pakistan Journal of Biological Sciences, - 2015. - 310 р.
10. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС. 1999. 160 с.
11. Zengqi li, Tiexin Tang, Shejian Liang, Xiping Ning, Mei Bai, Hong Wu // The sinthasis and storage of phenolic compounds in the root and rhizome of Echinacea purpurea // American journal of Plant Sciences, 2012, 3,551-558
