Цитотоксические производные хлорина е6 с одним и двумя 4,5-дихлор-1,2-тиазольными фрагментами Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Porphyrins Порфирины

Макрогэтэроцмклы

http://macroheterocycles.isuct.ru

Communication Сообщение

DOI: 10.6060/mhc170726b

Цитотоксические производные хлорина е6 с одним и двумя 4г5-дихлор-1г2-тиазольными фрагментами

Д. В. Белых,а@ М. В. Мальшакова,а А. В. Клецков,ь Е. С. Иванова,с Ю. В. Дутикова,с В. И. Поткин,ь А. А. Штильс

Институт химии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук, 167982 Сыктывкар, Российская Федерация

ьИнститут физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси, 220072 Минск, Беларусь сНациональный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина, 115478 Москва, Российская Федерация

@Е-таг1: [email protected], [email protected]

Синтезированы производные хлорина е6 с одним и двумя фрагментами 4,5-дихлор-1,2-тиазола. Хлориновый и дихлоризотиазольный циклы конъюгированы в реакции ацилирования аминогрупп периферических заместителей хлоринового макроцикла хлорангидридом 3-карбокси-4,5-дихлор-1,2-тиазола. Новые производные вызывали темновую гибель клеток линии рака толстой кишки в микромолярных концентрациях.

Ключевые слова: Хлорин е дихлор-1,2-тиазол, темновая цитотоксичность, ацилирование, аминогруппа.

Cytotoxic Chlorin e6 Derivatives with One or Two 4r5-Dichloro-1,2-thiazole Fragments

D. V. Belykh,a@ M. V. Malshakova,a A. V. Kletskov,b E. S. Ivanova,c Y. V. Dutikova,c V. I. Potkin,b and A. A. Shtilc

institute of Chemistry, Komi Scientific Center, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences, 167982 Syktyvkar, Russian Federation

hInstitute of Physical Organic Chemistry of the National Academy of Sciences of Belarus, 220072 Minsk, Republic of Belarus cBlokhin National Medical Research Center of Oncology, 115478 Moscow, Russian Federation @Corresponding author E-mail: [email protected], [email protected]

We report the synthesis of chlorin e6 derivatives with one or two 4,5-dichloro-1,2-thiazole fragments. The chlorin and dichloroisothiazole cycles were conjugated by acylation of amino groups in peripheral substituents of the chlorin macrocycle with chloroanhydride of 3-carboxy-4,5-dichloro-1,2-thiazole. At micromolar concentrations the new compounds evoked dark cytotoxicity for the human colon carcinoma cell line.

Keywords: Chlorin e, dichlorothiazole, cytotoxicity, acylation, amino group.

Макрогетероциклы /Macroheterocycles 2018 11 (3) 269-272 © ISUCT Publishing 269

Введение

Производные изотиазола проявляют противоопухолевые свойства благодаря ингибированию ряда ферментов.[1,2] Повышение эффективности противоопухолевого действия препарата возможно за счет его адресной доставки в опухоль. Порфириновые соединения накапливаются в злокачественных новообразованиях, что может быть использовано для направленного транспорта противоопухолевых агентов. У производных хлорофилла а низкая токсичность, что представляет интерес для синтеза противоопухолевых препаратов. В настоящей работе на основе метилфе-офорбида а 1 синтезированы производные одного из хлоринов а-ряда - хлорина е6 - с одним и двумя фрагментами хлоризотиазола, и исследована их цито-токсичность для выявления влияния хлортиазольного фрагмента на способность вызывать гибель клеток.

Экспериментальная часть

C^^bi ЯМР 1H записывали в CDCl3 и ДМШ-D. на спектрометре «Bruker Avance III» (рабочая частота 300 МГц). Масс-спектры были получены на хромато-масс-спектрометре (ВЭЖХ-М^ Thermo Finnigan LSQ Fleet (ESI, прямой ввод пробы). Электронные спектры были записаны на спектрометре UV - 1700 (PharmaSpec) фирмы SHIMADZU с диапазоном длин волн 200-1100 нм. ^емку образцов проводили в кварцевых кюветах толщиной 10 мм в хлороформе. Ход реакций контролировали с помощью TCX на пластинах Sorbfil, элюент CC^-ацетон 1:4 v/v. Выделение полученных продуктов реакции проводили колоночной хроматографией на силикагеле Alfa Aesar 70-230 mesh. Тетрагидрофуран марки хч («Компонент-Реактив») для проведения реакций предварительно кипятили с 0.5 % Cu2Cl2, а затем высушивали над гранулами KOH и перегоняли над гидридом кальция.[)] Растворители для обработки реакционных смесей и колоночной хроматографии: хлороформ («Экос-1»), ацетон («Протон») и тетрахлорметан («Экос-1») марки хч - использовали без предварительной очистки. Триэтиламин 99 % («Sigma») использовали при проведении реакций без предварительной очистки. Для высушивания реакционных смесей использовали безводный сульфат натрия марки чда («Михайловский завод химических реактивов»). 4,5-Дихлор-1,2-изотиазол-3-карбонилхлорид получен по методике.[4] Моно- и диамино-хлорины 2, 3 получены согласно.[5] Ацильные производные хлорина е6 б и 7 получены согласно методике.[5]

Хлорин е6 13^-(2-(Ы'-4,5-дихлоризотиазол-3-ил)-аминоэтил)амид 15,17-диметиловый эфир 4. 100 мг (0.15 ммоль) аминохлорина 2 растворили в 20 мл тетрагидро-фурана, к полученному раствору добавили 35 мг (0.15 ммоль) 4,5-дихлор-1,2-тиазол-3-карбонилхлорида и 0.1 мл триэти-ламина. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 100 мл хлороформа и полученный раствор промывали водой для удаления триэтиламина, сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении. Остаток после упаривания хроматографировали на силикагеле (элюент: тетрахлорметан-ацетон, 5:1). Элюат, содержащий основной продукт, упаривали. Остаток после упаривания переосаждали из смеси хлороформ/пентан. Выход: 57 мг (45 %) 4 в виде темного сине-зеленого порошка. m/z (ESI) (I % в кластере): 846.3 (100) [(МСРа35)^, 847.3 (45) [Ма)5а)7]+, 848.3 (85) [(МСРа37)^, 849.3 (35) [Ма)7а)7]+, 850.1 (25) [(МСРа37)^. ЭСТ (CHCl3) Xmax нм: 664 (31 %), 608 (3 %),

530 (3 %), 501 (9 %), 403 (100 %). Щ ЯМР (CDCl3, 300 МГц) 5Н м.д.: 9.66 (1Н, с, Н10), 9.58 (1Н, с, Н5), 8.81 (1Н, с, Н20), 8.17 (1Н, м, 13-СОКНСН2СН2ЛетСО-тиазол), 8.04 (1Н, дд J=16.6 и 12.7 Гц, 3-(СЯ=СН2)), 6.78 (1Н, м, 13-СОЛетСН2СН2КНСО-тиазол), 6.30 (1Н, д J=16.8 Гц, 3-(СИ=СИЯ )), 6.10 (1Н, д J=11.8 Гц, 3-(СИ=СИЯцис)), 5.47 (1Н, д J^T'U, 15-СННАСО2СН3), 5.22 (1Н, д J=18.7"T^ 15-СНЯВСО2СН3), 4.49 (1Н, Н18, к J=6.2 Гц), 4.40 (1Н, Н17, уш.д J=8.8 Гц), 3.84-3.66 (6Н, м, 8-СН2СН3, 13-СОЖСН2СН2КНСО-тиазол), 3.73 (3Н, с, 15-СН2СО2СН3), 3.62 (3Н, с, 17-СН2СН2СООСН3), 3.47 (3Н, с, 12-СНД 3.42 (3Н, с, 2-СН 3), 3.21 (3Н, с, 7-СН3), 2.67-2.50 (1Н, м) и 2.35-2.12 (3Н, м, 17-СН2СН2СООСН3), 1.77-1.67 (6Н, м, 18-СН3, 8-СН2СН3), -1.56 (1Н, с, III-NNH), -1.77 (1Н, с, I-NH). 1Н ЯМР (ДМСО-Э6, 300 МГц) 5Н м.д.: 9.81 (1Н, с, Н10), 9.76 (1Н, с, Н5), 9.28 (1Н, уш.т J=5.0 Гц, 13-СОNНСН 2СН2АНСО-тиазол), 9.14 (1Н, с, Н20), 9.07 (1Н, уш.т J=5.1 Гц, 13-С ОЛетСН2СН^НСО-тиазол), 8.32 (1Н, д.д J=18.0 и 11.7 Гц, 3-(СЯ=СН2)); 6.46 (1Н, д J=18.0 Гц, 3-(СИ=СИЯтранс)), 6.18 (1Н, д J=11.7 Гц, 3-(СИ=СИЯцис)), 5.54 (1Н, д J=19.1 Гц, 15-СННАСО2СН3), 5.35 (1Н, д J=19.1r^ 15-СННВСО2СН3), 4.64 (1Н, к J=6.9 Гц, Н18), 4.44 (1Н, уш.д J=9.5 Гц, Н17), 3.90-3.84 (6Н, м, 8-СН2СН3, 13-СОЖСЯ2СН^НСО-тиазол), 3.71 (3Н, с, 15-СН2СО2СН3), 3.59 (3Н, с, 17-СН2СН2СООСН3), 3.53 (6Н, с, 12-СН3, 2-СН3), 3.32 (3Н, с, 7-СН2), 2,80-2.65 (м, 1Н) и 2.46-2.09 (м, 3Н, 17-СН2СН2СООСН3), 1.68 (3Н, т J=7.9 Гц, 8-СН2СН3), 1.66 (3Н, д J=7.0 Гц, 18-СН3), -1.80 (1Н, с, III-NH), -2.06 (1Н, с, I-NH).

Хлорин е 613,17-Ы,Ы'-бис(2-(Ы'-4,5-дихлоризотиазол-3-ил)-аминоэтил)диамид 15-метиловый эфир 5. 70 мг (0.1 ммоль) диаминохлорина 3 растворили в 10 мл ТГФ, к полученному раствору добавили 44 мг (0.2 ммоль) 4,5-дихлоро-1,2-тиазол-3-карбонилхлорида и 0.2 мл триэтиламина. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 100 мл хлороформа и полученный раствор промывали водой для удаления триэтила-мина, сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали при пониженном давлении. Остаток после упаривания хроматографировали на силикагеле (элюент: тетрахлор-метан-ацетон, 5:1). Элюат, содержащий основной продукт, упарили. Остаток после упаривания переосадили из смеси хлороформ/пентан. Получили 25 мг (23 %) 5 в виде темного сине-зеленого порошка. m/z (ESI) (I % в кластере): 1053.3 (60) [(МС135С135С135С135)Н]+, 1054.0 (40) [МС135С135С135С137]+, 1055.2 (100) [(МС135С135С135С137)Н]+, 1056.1 (50) [МС135С135С137С137]+, 1057.1 (65) [(МС135С135С137С137)Н]+, 1058.0 (30) [МСР5С137С137С137]+, 1059.1(25) [(МС135С137С137С137)Н]+, 1060.0 (10) [МС137С137С137С137]+, 1061.1 (5) [(МС137С137С137С137)Н]+. ЭСП (CHCl3) Xmax нм: 664 (30 %), 608 (2 %), 529 (2 %), 501 (8 %), 403 (100"%о). 1Н ЯМР (CDCl3, 300 МГц) 5Н м.д.: 9.62 (1Н, с, Н10), 9.59 (1Н, с, Н5), 8.79 (1Н, с, Н20), 8.09 (1Н, м, 13-СОNНСН2СН2NНСО-тиазол), 8.04 (1Н, дд J=18.0 и 11.7 Гц, 3-(СЯ=СН2)), 6.97 (1Н, м, 13-СОАетСН2СН^НСО-тиазол), 6.33 (1Н, д J=18.0 Гц, 3-(СН=СНЯ )), 6.13 (1Н, д J=12.0 Гц 3-(СИ=СИЯцис)), 5.475.30 (2Н, м, 17-СН2СН2СОАетСН2СН^НСО-тиазол, Ц1"5-СННА СО2СН3), 5.26 (1Н, д J=19.1 Гц, 15-СННВСО2СН3), 4.55-4.30 (3Н, м, 17-СН2СН2тЖСН2СН2АетСО-тиазол, Н17, Н18), 3.94-3.60 (10Н, м, 8-СН2СН3, 13-СОЖСН2СН^НСО-тиазол, 17-СН2СН2СОЖСН2СН^НСО-тиазол), 3.(53 (3Н, с, 15-СН2СО2СН3), 3.47 (3Н, с, 12-СН3), 3.49 (3Н, с, 2-СН3), 3.26 (3Н, с, 7-0 Н3), 2.78-2.00 (4Н, м, 17- СН2СН2ТОКНСН2СН^ НСО-тиазол), 1,77'-1.65 (6Н, м, 18-СН 3, 8-СН2СН3), -1.61 (1Н, с, III-NH), -1.87 (1Н, с, I-NH). 1Н ЯМР (ДМСО-Э6, 300 МГц) 5Н м.д.: 9.80 (1Н, с, Н10), 9.77 (1Н, с, Н5), 9.26 (1Н, м, 13-СОNНСН2СHН2NНСО-тиазол), 9.13 (1Н, с, Н20), 9.07 (1Н, м, 13-СОАетСН2СН^НСО-тиазол), 8.76 (1Н, м, 17-СН2СН2СОЛетСН2СН2КНСО-тиазол), 8.36 (1Н, дд J=17.6 и 12.2 Гц, 3-(СЯ=СН2)), 8.03 (1Н, м, 17-СН2СН2CONНСН2СН2NНСО-тиазол), 6.48 (1Н, д J=18.0 Гц, 3-(СН=СНЯ1ршс)), 6.21 (1Н, д J=12.1 Гц, 3-(СИ=СИЯцис)), 5.54 (1Н, д J=19.T]4 15-СННАСО2СН3), 5.30 (1Н, д J=19.5 Гц,

D. V Belykh et al.

15-СННВСО2СН3), 4.60 (1Н, к J=7.3 Гц, Н18), 4.38 (1Н, уш.д J=9.5 Гц, Н17), 3.94-3.60 (10Н, м, 8-СН2СН3, 13-СОЖСН2СН2ЖСО-тиазол, 17-СН 2СН2CONНСН2СН2N НСО-тиазол), 3.(58 (3Н, с, 15-СН2СО2СН3), 3.55 (3Н, с, 12-ССН3), 3.51 (3Н, с, 2-СН3), 3.34 (3Н, с, 7-С Н3),2.78-2.00 (4Н, м, 17- СН2СН2СОЖСН2СН^ НСО-тиазол), 1.69 (3Н, т J=7.4 Гц, 8-СН2СН3), 1.65 (3Н, д J=7.4 Гц, 18-СН3), -1.79 (1Н, с, Ш-NH), -2.08 (1Н, с, 1-Ш).

Биологические исследования. Цитотоксичность соединений для линии клеток рака кишки человека НСТ116 определяли по восстановлению 1-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-3,5-дифенилтетразолия бромида в формазан (МТТ-тест).[6]

Результаты и обсуждение

Для введения дихлоризотиазольного фрагмента на периферию хлоринового макроцикла использована реакция ацилирования аминогрупп амидных производных хлорина е6 2 и 3, полученных при действии этилендиамина на метилфеофорбид а согласно разработанной нами методике[5] (моноаминохлорин 2 получен при размыкании экзоцикла метилфеофор-бида а 1 этилендиамином в хлороформе в течение 4 ч при комнатной температуре, диаминохлорин 3 получен при действии этилендиамина на хлорин 2 в течение 24 ч при комнатной температуре). В качестве ацилирующего агента использовался 4,5-дихлор-1,2-тиазол-3-карбонилхлорид (эквимолярное количество при ацилировании аминохлорина 2 и двухкратный мольный избыток по отношению к диаминохлорину 3). Структура хлоризотиазольных производных подтверждена данными спектроскопии ЯМР 'Н и масс-спектрометрии. В спектре ЯМР 'Н производных 4 и 5, по сравнению со спектром исходных аминохлоринов, появляются дополнительные уширенные триплеты протонов амидных групп (дополнительный триплет в спектре соединения 4 по сравнению со спектром ами-нохлорина 2 и два триплета в спектре 5 по сравнению со спектром диаминохлорина 3). В масс-спектрах (ESI)

полученных соединений наблюдаются кластеры пиков молекулярных ионов 4 и 5, в которых соотношение интенсивностей изотопных составляющих подтверждает наличие соответственно двух и четырех атомов

хлора.[7,8]

Соединения 4 и 5 вызывали гибель клеток рака тол -стой кишки. Оказалось, что токсичность производного 4 с одним фрагментом дихлортиазола на периферии макроцикла несколько выше токсичности 5, в молекуле которого содержатся два фрагмента дихлортиазола (1С50=1.3 мкМ для 4 против 4.7 мкМ для 5; инкубация 72 ч). Полученные данные позволяют предположить, что в клетке гидролиз амидной связи не происходит, и токсичен сам конъюгат.

Для выяснения влияния хлоризотиазольного фрагмента на токсичность молекулы в целом была исследована цитотоксичность соединений 6 и 7 (синте -зированы согласно[5] при действии уксусного ангидрида на аминопроизводные 2 и 3 в присутствии пиридина в течение 2-х часов при комнатной температуре), полно -стью аналогичных соединениям 4 и 5 по строению хлориновой части, но не содержащих хлоризотиазоль-ных заместителей. Оказалось, что 1С50 этих соединений примерно в 4 раза меньше, чем для соответствующих хлоризотиазольных производных 4 и 5 (1С50=0.3 мкМ для 6 и 1.2 мкМ для 7), причем, как и в случае производных с хлоризотиазольным фрагментом, более токсичным оказывается соединение с одним фрагментом ацилированного этилендиамина. Сопоставление величин 1С50 соединений 4-7 свидетельствует о том, что токсичность обусловлена в основном хлориновым макроциклом, и введение хлоризотиазольного фрагмента не усиливает цитотоксический эффект. Полученные данные позволяет заключить, что, во-первых, внедрение хлоризотиазольного фрагмента снижает цитотоксичность соединения. Способность вызывать гибель клеток обусловлена, главным образом, хлорино -вым макроциклом.

(

(1)

(2)

OCH3 OCH3

r -Cl

H Cl

H2NCH2CH2NH2 CH3OH

(4)

V o^O

NH NH

О

N H Cl H Cl

NS (5)

O Cl

Cl

V

NH N

^ И

N HN

O

' 1 yNH VCH3

OCH3 OCH3 (6)

O

O N H O CH3

OCH3

0

NH

-CH3 (7)

г: хлороформ, комн. темп., 2 ч; гг: без растворителя, комн. темп., 24 ч; ггг: ТГФ, Е^, комн. темп., 30 мин. Схема 1. Синтез производных хлорина е6 с одним и двумя фрагментами хлоризотиазола. Макрогетероциклы /Macroheterocycles 2018 11 (3) 269-272

O

3

O

O

2

3

2

O

Заключение

Синтезированы производные хлорина е6 с одним и двумя 4,5-дихлор-1,2-тиазольными фрагментами на периферии хлоринового макроцикла. Новые соединения проявляют высокую темновую цитотоксичность для линии рака кишки НСТ116, однако сопоставление величин IC50 для хлоризотиазольных производных 4 и 5 и аналогичных соединений без хлоризотиазольного фрагмента 6 и 7 свидетельствует о том, что эффект обусловлен, главным образом, хлориновым макроциклом, и присоединение хлоризотиазольного фрагмента не повышает цитотоксичность соединения.

Благодарность. Спектральные исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Химия» Института химии Коми НЦ УрО РАН.

References Литература

1. Beebe J.S., Jani J.P., Knauth E., Goodwin P., Higdon C., Rossi A.M., Emerson E., Finkelstein M., Floyd E., Harriman S.,

Atherton J., Hillerman S., Soderstrom C., Kou K., Gant T., Noe M.C., Foster B., Rastinejad F., Marx M.A., Schaeffer T., Whalen P.M., Roberts W.G. Cancer Res. 2003, 63, 7301-7309.

2. Barawkar D., El Abdellaoui H., Chakravarty S., Allan M., Chen H., Zhang W., Wu J.Z., Tam R., Hamatake R., Lang S., Hong Z. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3975-3980.

3. Gordon A., Ford R. The Chemist's Companion: A Handbook of Practical Data, Techniques, and References (Russ. transl.). Moscow: Mir, 1976. 443 p. (in Russ.) [Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Москва: Мир, 1976. 443 с.].

4. Potkin V.I., Petkevich S.K., Kleckov A.V., Dikusar E.A., Zubenko Yu.S., Zhukovskaya N.A., Kazbanov V.V., Pashkev-ich S.G. Zh. Org. Khim. 2013, 49, 1543-1553 (in Russ.).

5. Belyh D.V., Mal'shakova M.V. Butlerov Commun. 2014, 39(10), 35-42 (in Russ.).

6. Shchekotikhin A.E., Dezhenkova L.G., Tsvetkov V.B. Luzikov Y.N., Volodina Y.L., Tatarskiy Jr. V.V., Kalinina A.A., Treshalin M.I., Treshalina H.M., Romanenko V.I., Kaluzhny D.N., Kubbutat M., Schols D., Pommier Y., Shtil A.A., Preobrazhenskaya M.N. Eur. J. Med. Chem. 2016, 112, 114-129.

7. Takhistov V.V. Practical Mass Spectrometry of Organic Compounds. Leningrad: Izd LGU, 1977. 268 p. (in Russ.) [Тахи-стов В.В. Практическаямасс-спектрометрия органических соединений. Ленинград: Изд-во ЛГУ, 1977. 268 с.].

8. Takhistov V.V., Rodin A.A., Maksimova B .N. Uspekhi Khimii 1991, 60, 2143-2166 (in Russ.).

Received 18.07.2017 Accepted 30.05.2018