CC BY
3Чернов А.Н.
Институт физиологии НАН Беларуси, Минск, Республика Беларусь
Бурак В.Г.
Управление судебно-медицинских экспертиз Государственного комитета судебно-медицинских экспертиз Республики Беларусь по Минской области
ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ КОМБИНАЦИЙ ХИМИОПРЕПАРАТОВ С ФАКТОРОМ РОСТА НЕРВОВ НА КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕЙ МОЗГА И НЕЙРОГЛИАЛЬНОЙ ТКАНИ
THE CYTOSTATIC EFFICACY OF CHEMOTHERAPY DRUGS AND NERVE GROWTH FACTOR COMBINATIONS ON BRAIN TU-MORS AND NEUROGLIAL TISSUE CELLS
Chernov A.N., Institute of Physiology, the National Academy of Sciences of Belarus, Minsk, the Republic of Belarus
Burak V.G., Office forensic State committee offorensic examinations of Minsk region, the Republic of Belarus
АННОТАЦИЯ
Статья посвящена сравнительной оценке цитотоксического действия комбинаций фактора роста нервов (ФРН) с хи-миопрепаратами на культуры клеток, полученных из биопсийного материала пациентов (n=60) c пилоцитарной астроци-томой, анапластической астроцитомой, глиобластомой, медуллобластомой и на культуру клеток нейроглиальной ткани, полученной из аутопсийного мозга 10 скоропостижно умерших лиц. Показано, что цитотоксическое действие комбинаций статистически значимо не отличалось от действия фактора роста нервов на культурах клеток пилоцитарной астро-цитомы и анапластической астроцитомы и превышало цитотоксичность фактора роста нервов на клетках медуллоб-ластомы. При влиянии на культуры клеток нейроглиальной ткани 87,5% указанных комбинаций обладали значительно более низкой цитотоксической эффективностью по сравнению с фактором роста нервов. Это делает целесообразным проведение дальнейших испытаний ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами in vivo. ABSTRACT
The article is dedicated to a comparative evaluation of the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in combination with nerve growth factor (NGF) to cell cultures derived from biopsies ofpatients (n=60) with pilocytic astrocytoma, anaplastic astrocytoma, glioblastoma and medulloblastoma and neuroglial tissue cell culture obtained from autopsy brain of 10 persons died suddenly. It is shown that the cytotoxic effects of combinations did not differ significantly from the action of nerve growth factor on pilocytic astrocytoma and anaplastic astrocytoma cell cultures and exceeded the cytotoxicity of nerve growth factor on medulloblastoma cells. The effect of 87.5% these combinations had a much lower cytotoxic efficiency compared with nerve growth factor on neuroglial tissue culture cells. This makes it advisable to further trials of NGF and its combination with chemotherapy in vivo.
Ключевые слова: культура клеток, химиопрепараты, фактор роста нервов, комбинация фактора роста нервов с химиопрепаратами, индекс цитотоксичности, анапластическая астроцитома, пилоцитарная астроцитома, глиобласто-ма, медуллобластома, аутопсийная нейроглиальная ткань.
Keywords: cell culture, chemotherapy, nerve growth factor, combination of chemotherapy and nerve growth factor, index of cytotoxicity, anaplastic astrocytoma, pilocytic astrocytoma, glioblastoma, medulloblastoma, autopsy neuroglial tissue
Злокачественные интракраниальные опухоли являются наиболее трудноизлечимыми, при высокой смертности пациентов [14]. У детей и подростков опухоли мозга по распространенности занимают второе место, уступая лейкозам [4], представляют собой гетерогенную группу, включающую как высокозлокачественные, так и низкозлокачественные гистологические типы. К наиболее частым интракраниальным опухолям у детей относятся медуллобластома, нейробласто-ма ^г1У), эпендимома ^Ш) и пилоцитарная астроцитома ^г1) [16]. Например, частота распространения медуллобла-стомы в мире у пациентов младше 15-летнего возраста составляет 25% от всех опухолей ЦНС [8].
Оперативное вмешательство не всегда возможно вследствие диффузного характера роста интракраниальных опухолей и существующей опасности повреждения жизненно важных центров, что делает актуальным совершенствование методов лучевой и химиотерапии. Перспективен поиск новых фармакологических веществ с противоопухолевой активностью [3, 5].
Для внедрения в клиническую практику нового лекарственного сред-ства необходимо проведение доклинических испытаний [3], начальный этап которых включает скрининг
лекарственных субстанций на противоопухолевую активность с применением моделей in vitro - культур клеток человека и животных [3]. Скрининг лекарственных средств in vitro позволяет выявить «кандидаты» - вещества, предназначенные для дальнейшего тестирования in vivo, сократить объем исследования и сроки экспериментов, снизить их стоимость [5].
В качестве таких потенциальных кандидатов в онкологии могут рас-сматриваться эндогенные регуляторные белки - ростовые факторы. Среди ростовых факторов фактор роста нервов (ФРН) является перспективным кандидатом в лекарства для заболеваний нервной системы [22]. Установлено, что ФРН участвует во всех процессах, связанных с жизнедеятельностью опухолевых и нормальных клеток (апоптоз, дифференцировка, пролиферация, миграция, регуляция клеточного цикла, опухолевая трансформация и т.д.) [7, 17, 22].
Цитотоксический эффект ФРН и химиопрепаратов на культурах клеток нейроэпителиальных опухолей был описан авторами ранее [6]. Остается не изученным цитотоксическое воздействие комбинаций ФРН с химиопрепаратами на культуры клеток нейроэпителиальных опухолей и нейро-
глиальной ткани человека.
Цель исследования - изучить цитотоксическое воздействие комбинаций ФРН с химиопрепаратами на культуры клеток интракраниальных опухолей (пилоцитарная, ана-пластическая астроцитомы, глиобластома, медуллобласто-ма) и аутопсийной нейроглиальной ткани мозга человека.
Материалы и методы.
Пациенты и группы исследования. Исследование выполнено на пер-вичных культурах клеток, полученных из фрагментов интракраниальных опухолей, взятых с информированного согласия родителей у 60 пациентов в возрасте от 3 мес до 17 лет (медиана возраста 8,3±0,6 года), находившихся на лечении в Городской клинической больнице скорой медицинской помощи г. Минска в 2008-2013 гг. В исследование также включены 10 скоропостижно умерших (по причине не связанной с травмами или заболеваниями головного мозга) человек в 2009 г., у которых во время вскрытия в морге Управления судебно-медицинских экспертиз Государственного комитета судебно-медицинских экспертиз Республики Беларусь по Минской области была взята нейроглиальная ткань.
Для формирования клинически относительно однородных групп пациентов из историй болезней брали сведения
0 гистологическом типе опухоли и степени ее злокачественности. Эта информация позволила сформировать пять групп исследования. В первую группу вошли 22 пациента с низкозлокачественной глиальной опухолью - пилоцитарной астроцитомой (GrI, 12 мальчиков и 10 девочек, медиана возраста - 7,9±0,7 года). Вторая и третья группы состояли из 8 пациентов каждая с высокозлокачественными глиальными опухолями - анапластической астроцитомой (GrIII, 5 мальчиков и 3 девочки, медиана возраста 8,6±1,6 года) и глиобла-стомой (GrIV, 8 мальчиков, медиана возраста 10,3±1,9 года) соответственно. Четвертая группа состояла из 22 детей с эмбриональной опухолью - медуллобластомой (GrIV, 16 мальчиков и 6 девочек, медиана возраста 5,7±0,6 года). В пятую группу вошли 10 скоропостижно умерших человек, у которых во время вскрытия были взяты фрагменты мозга (8 мужчин и 2 женщины, медиана возраста 57,1±4,0 лет).
Культура клеток. Поступавший из клиники в течение
1 ч материал в стерильных условиях ламинарного бокса (Lobconco, США) отмывали от крови, освобождали от соединительнотканных элементов в растворе Хэнкса (Sigma-Aldrich, США), содержащим 4%-ный сульфат гентамици-на (Белмедпрепараты, РБ), и механически измельчали до мелких частиц. Клетки подвергали 10 мин ферментативной обработке смесью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го ЭДТА в соотношении 1:3 (Sigma-Aldrich, США) при 37°С. Действие фермента останавливали внесением 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США). Обработанный материал подсчитывали в камере Горяева и переносили в количестве 500 тыс. клеток/мл в 35 мм чашки Петри (Nunc, Дания) с 1 мл среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки [1].
Клетки нейроглиальной ткани выделяли из мозжечка скоропостижно умерших людей в течение 24 ч с момента смерти [10]. Время, необходимое для транспортировки биологического материала в лабораторию, не превышало 1 ч. В стерильных условиях ламинара (Lobconco, США) фрагменты ткани трехкратно промывали в растворе Хэнкса (Sigma-Aldrich, США) с десятикратным содержанием 4%-го сульфата гентамицина (Белмедпрепараты, РБ), 100 мкг/ мл стрептомицина (Киевмедпрепарат, Украина) и 100 ед/мл
натриевой соли пенициллина G (Biochemie, Австрия) в течение 30 мин, механически очищали от видимых кровеносных сосудов и измельчали до мелких частиц. Кусочки ткани обрабатывали смесью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го ЭДТА в соотношении 1:3 (Sigma-Aldrich, США) и ДНКазой (20 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) на протяжении 20 мин при 37°С. Материал центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин и усиленно пипетировали. Перед внесением на чашки Петри определяли жизнеспособность клеток на нулевом пассаже, окрашивая их трипановым синим. В исследование брали только те посевы, где жизнеспособность клеток была не менее 75%. Далее клетки подсчитывали в камере Горяева и переносили в количестве 500 тыс. клеток/мл в чашки Петри с 1 мл среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Внесение реагентов проводили на стадии логарифмического роста культур, достижение которой оценивали визуально по резко возросшему
количеству митозов и численности клеток с помощью цифровой фотокамеры Altra20 (Olympus, Япония), снабженной программным обеспечением Analysis getlT (Olympus, Япония) на инвертированном микроскопе НУ-2Е (Carl Zeiss, Германия) при увеличении *312. Для достижения данной стадии опухолевым и нормальным клеткам требуется различный временной интервал вследствие отличий в скорости адгезии к субстрату, метаболизма веществ и пролиферации клеток [10]. Поэтому клетки опухолей культивирововали на протяжении 2 сут, а клетки нейроглиальной ткани культивировали на протяжении 28 сут [10] в стандартных условиях СО2-инкубатора (Heraccell, США) при 37°С, 95%-ной влажности и 5% парциальном давлении СО2 [1, 10].
Реагенты и их концентрации. Спустя указанный интервал в культуру клеток вносили: рекомбинантный ФРН (Sigma-Aldrich, США, 8,8*10-9М или 0,1 мкг/мл); химиопрепараты (в одной концентрации, уменьшенной в 100 000 раз по сравнению с разовой дозой: для винкристина (Veropharm, РФ, 2,42*10-7 М или 0,02 мкг/мл), карбоплатина (Veropharm, РФ, 1,08*10-5М или 4,0 мкг/мл), метотрексата (Ebewe Pharma, Австрия, 1,1*10-4М или 50,0 мкг/мл), темозоломида (Orion Pharma, Финляндия, 10,3х10-6М или 2 мкг/мл), циклофос-фамида (Белмедпрепараты, РБ, 3,83*10-5М или 8,0 мкг/мл), цисплатина (Veropharm, РФ, 3,33*10-6М или 1,0 мкг/мл), цитарабина (Белмедпрепараты, РБ, 4,1*10-6М или 1,0 мкг/ мл), этопозида (Ebewe Pharma, Австрия, 1,55*10-6 М или 1,0 мкг/мл); комбинацию ФРН (8,8*10-9М) с химиопрепаратами в концентрации 10-кратно уменьшенной по сравнению с дозировкой при обособленном тести-ровании (в 1000000 раз уменьшенной по сравнению с разовой дозой): для вин-кристина (Veropharm, РФ, 2,42*10-8 М или 0,002 мкг/мл), карбоплатина (Veropharm, РФ, 1,08*10-6М или 0,4 мкг/мл), метотрексата (Ebewe Pharma, Австрия, 1,1*10-5М или 5,0 мкг/мл), темозоломида (Orion Pharma, Финляндия, 10,3*10-7М или 0,2 мкг/мл), циклофосфамида (Белмедпрепараты, РБ, 3,83*10-6М или 0,8 мкг/мл), цисплатина (Veropharm, РФ, 3,33*10-7М или 0,1 мкг/мл), цитарабина (Белмедпрепараты, РБ, 4,1*10-7М или 0,1 мкг/мл), этопозида (Ebewe Pharma, Австрия, 1,55*10-7 М или 0,1 мкг/мл).
Индекс цитотоксичности. Оценку чувствительности клеток к химио-препаратам, ФРН и их комбинациям проводили через 1 сут на основе изучения гибели клеток, визуализируемой по поглощению ими 0,2%-го раствора трипанового синего (Alta Aesar, Германия) в камере Горяева (Минимед, РФ) [1]. Определяли индекс цитотоксичности химиопрепаратов, ФРН и их комбинаций по формуле:
N% = (1 — Опыт/Контроль) x 100 (1)
где N % - цитотоксический эффект препаратов, опыт - жизнеспособность клеток при действии хи-миопрепаратов, ФРН или комбинации;
контроль - жизнеспособность клеток в контрольной серии [3].
Каждая серия экспериментов с каждым реагентов содержала от трех до пяти посевов. Общее количество посевов составило n=2837.
Статистическая обработка данных. Результаты представляли как арифметическая средняя плюс/минус стандартная ошибка средней для вы-борки (M±m). Для сравнения
двух групп по выраженности количественных признаков применяли стандартный t-тест Стьюдента, рассчитанный с помощью программы StatPlus2005 пакета Statistica 6.0 [23]. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Изучали воздействие комбинаций ФРН с химиопрепара-тами на клетки интракраниальных опухолей и сопоставляли его с обособленным действием ФРН. Для этого рассчитывали среднее значение ИЦ комбинаций для каждого типа опухоли (рисунки 1, 2, 3, 4).
42 7 2Г2-2Д
37,5t
Ж Ж
I
30f5 ' 28,1t 27^9t_
А
^ .¡¡Г У Л
V* ■ ^
^ О? <у S4 (9я
^ Ж ^ Л?
¿Р* Л^
* «F*
<fO
Здесь и на рисунках 2, 3, 4: знаком * обозначены реагенты, ИЦ которых были статистически значимо выше (p<0,05) среднего значения ИЦ комбинаций; знаком Л - реагенты, ИЦ которых статистически значимо не отличалось от среднего значения ИЦ комбинаций; знаком f - реагенты, ИЦ которых были статистически значимо ниже (p<0,05) среднего значения ИЦ комбинаций
Рисунок 1. Индекс цитотоксичности (%) ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на культуру клеток пилоцитарной астроцитомы
Обозначения такие, как на рисунке 1.
Рисунок 2. Индекс цитотоксичности (%) ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на культуру клеток анапластиче-ской астроцитомы
Обозначения такие, как на рисунке 1.
Рисунок 3. Индекс цитотоксичности (%) ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на культуру клеток глиобластомы
Обозначения такие, как на рисунке 1.
Рисунок 4. Индекс цитотоксичности (%) ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на культуру клеток медуллобла-стомы
Данные рисунков 1-4 показывают, что применение комбинаций ФРН с химиопрепаратами в десятикратно сниженной концентрации на культурах клеток опухолей оказывает по сравнению с обособленным воздействием ФРН разнонаправленные эффекты:
1) цитотоксическое действие комбинаций ФРН с хи-миопрепаратами в десятикратно сниженной концентрации на первичные культуры клеток пилоцитарной астроцитомы (средний ИЦ 42,7±1,1%,) и анапластической астроцитомы (средний ИЦ 46,8±1,7%) статистически значимо не отличалось от действия ФРН (ИЦ 45,0±1,6%, р=0,73 и 45,9±3,9%, р=0,1 соответственно);
2) на клетках медуллобластомы действие комбинаций (среднй ИЦ 53,2±0,9%) статистически значимо (р=0,02) превышало действие ФРН
(ИЦ 46,0±1,7%);
3) на культурах клеток глиобластомы эффективность комбинаций ФРН с химиопрепаратами (средний ИЦ 44,6±1,6%) была статистически значимо (р=0,005) ниже действия ФРН (ИЦ 50,6±2,8%).
На следующем этапе изучали обособленное и комбинированное воз-действие химиопрепаратов и ФРН на культуру клеток нейроглиальной ткани. Сравнивали цитотоксичес-кую эффективность ФРН и химиопрепаратов. Для этого рассчитывали среднее значение ИЦ химиопрепаратов (рисунок 5).
Знаком * обозначены реагенты, ИЦ которых был статистически значимо (р<0,05) выше среднего значения ИЦ химиопре-паратов; знаком Л - реагенты, ИЦ которых стати-стически значимо не отличался от среднего значения ИЦ химиопрепаратов; знаком | - реагенты, ИЦ которых был статистически значимо (р<0,05) ниже среднего значения ИЦ химиопрепаратов
Рисунок 5. Индекс цитотоксичности (%) химиопрепаратов и ФРН при обособленном воздействии на культуру клеток нейроглиальной ткани головного мозга человека
На основании данных, представленных на рисунке 5, можно заключить, что действие на культуру клеток ней-роглиальной ткани цитарабина, цисплатина, темозоломи-да, этопозида, метотрексата (62,5% посевов) не отличалось (р>0,05) от среднего значения ИЦ химиопрепаратов (41,1±1,7%). ИЦ циклофосфамида и винкристина (25% посевов) был статистически значимо выше (р<0,05), а ИЦ карбоплатина (12,5% посевов) - ниже (р<0,05) среднего значения ИЦ химиопрепаратов.
Индекс цитотоксичности ФРН (31,5±1,9%) при действии на культуру клеток нейроглиальной ткани (п=10 трупов) был статистически значимо (р=8,7*10-18) ниже индекса цитотоксичности химиопрепаратов (41,1±1,7%), что документирует менее токсичное его действие на нейроглиальную ткань.
На культуре клеток нейроглиальной ткани мозга человека изучали цитотоксическую эффективность комбинаций ФРН с химиопрепаратами в 10-кратно сниженной концентрации, сравнивали ее с обособленным воздействием ФРН (рисунок 6).
Обозначения такие, как на рисунке 1.
Рисунок 6. Индекс цитотоксичности (%) ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на культуру клеток нейроглиальной ткани головного мозга человека
На основании данных, представленных на рисунке 6 можно заключить, что при влиянии на культуру клеток ней-роглиальной ткани 87,5% (7 из 8) указанных комбинаций обладали значительно (р<0,001) более низкой цитотоксиче-ской эффективностью (средний ИЦ 21,1±0,9%) по сравнению с ФРН (ИЦ 31,5±1,9%).
Влияние комбинаций ФРН с химиопрепаратами в 10-кратно сниженной концентрации на клетки опухолей сопоставимо с обособленным воздействием ФРН, тогда как в отношении культуры клеток нейроглиальной ткани их ци-тотоксичность значительно (р<0,0001) ниже по сравнению с химиопрепаратами и ФРН (таблица 1).
Таблица 1.
Индекс цитотоксичности (%) химиопрепаратов, ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на культуры клеток мозговых неоплазий и нейроглиальной ткани человека
Тип ткани Средний индекс цитотоксичности, %
химиопрепарата знак ФРН знак комбинаций ФРН + химиопрепа-раты в 10-кратно сниженной дозе
Пилоцитарная астроцитома 45,4±0,03 = 45,0 ± 1,6 = 42,7±1,1
Анапластиче ская астроцитома 41,8 ±0,1 = 45,9 ± 3,9 = 46,8±1,7
Глиобластома 40,7± 0,3 < 50,6 ± 2,8 (*) > 44,6±1,6 (л)
Медуллобластома 38,4±0,08 < 46,0 ± 1,7 (*) < 53,2±0,9 (л)
Нейроглиальная ткань 41,1±1,7% > 31,5±1,9% (*) > 21,1±0,9% (л)
Примечание. Символом * обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия ИЦ ФРН от химиопрепаратов. Символом л обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия ИЦ комбинаций ФРН с химиопрепаратами от обособленного воздействия ФРН.
Из данных таблицы 1 можно заключить, что комбинированное применение ФРН с химиопрепаратами позволяет снизить дозу химиопрепарата, при сохранении цитотокси-ческого эффекта в отношении культур опухолевых клеток и менее токсичном воздействии на нейроглиальную ткань.
Выше приведенные авторами эффекты комбинаций ФРН с химиопре-паратами на культурах клеток нейроэпителиаль-ных опухолей ставят вопрос о механизмах их действия. В
литературе изучен механизм действия комбинации циспла-тина с ФРН на первичных культурах клеток высокозлокачественной глиомы, эпендимобластомы и нейробластомы [7].
Исследователи показали, что ФРН блокировал пролиферацию и стимулировал дифференцировку нейробластов за счет активации гена раннего реагирования гомолога-К онкогена v-Maf мускулоапоневротической фибросаркомы (та!к). Цисплатин запускал апоптоз через активацию ге-
нов-супрессоров опухолей р63, р73.
Следовательно, выявление механизмов применения ФРН и химиопрепаратов в комбинации (проявляющих наибольшую эффективность in vitro) послужит основой для разработки и создания протоколов замещающей цито-редуктивной химиотерапии у онкологических пациентов. Данное утверждение подтверждается и ссылкой на исследование, посвященное изучению химиочувствительности in vitro лейкозных клеток, где констатируется, что уменьшение дозы химиопрепаратов в ряде случаев не снижает эффективность терапии, но уменьшает количество сопутствующих инфекционных осложнений [2].
Поскольку при изучении воздействия ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами на нейроглиальную ткань объектом служили нейроглиальные клетки аутопсийной ткани мозга, необходимо упомянуть об использовании ау-топсийного материала в биомедицинских целях. Выделение и получение культур клеток микроглии, астроцитов, олиго-дендроцитов и нейронов из мозга внезапно умерших лиц широко применяется в нейробиологии [10] при выяснении механизмов старения, нейродегенеративных заболеваний Альцгеймера [10, 20], Паркинсона [11], множественного рассеянного склероза [9], психических состояний, таких как шизофрения [15]; экспрессии и секреции цитокинов и ростовых факторов [12]. Материалом служат различные области и структуры головного мозга - изъятые непосредственно после смерти пациентов в клинике [13, 15, 21], либо предоставленные специализированными банками аутопсийной мозговой ткани Нидерландов (Netherlands Brain Bank) [19, 20], Европы (BrainNet Europe) [11] и США (Sun Health Research Institute Brain Bank) [18].
На жизнеспособность клеток аутопсийной ткани указывают данные литературы [18, 21]. Например, жизнеспособность клеток (по MTT и окрашиванию на кальцеин зеленым флуоресцентным красителем нуклеиновых кислот - SYT0-10) составляет 77% и 82,1% соответственно [18]. Наличие и численность жизнеспособных клеток в ау-топсийном материале подтверждается выходом их из экс-плантов в количествах от 1,17 млн. до 37 млн на 1 г ткани [24]. К 28-м суткам культивирования в посевах, полученных из фрагментов нейроглиальной ткани мозга идентифицируются следующие типы клеток: астроциты, олигодендро-циты, микроглиоциты, нейроциты [10] и плюропотентные стволовые клетки [13].
Выводы
1. Цитотоксическое действие комбинаций фактора роста нервов с хи-миопрепаратами в десятикратно сниженной концентрации на первичные культуры клеток пилоцитарной астроцитомы (ИЦ 42,7±1,1%,) и анапластической астроци-томы (ИЦ 46,8±1,7%) статистически значимо не отличалось от действия фактора роста нервов (ИЦ 45,0±1,6%, p=0,73 и 45,9±3,9%, p=0,1 соответственно). На культурах клеток глиобластомы эффективность комбинаций фактора роста нервов с химиопрепаратами (ИЦ 44,6±1,6%) была статистически значимо (p=0,005) ниже действия фактора роста нервов (ИЦ 50,6±2,8%), на клетках медуллобластомы (ИЦ комбинаций 53,2±0,9%) - статистически значимо (p=0,02) выше действия фактора роста нервов (ИЦ 46,0±1,7%).
2. Индекс цитотоксичности фактора роста нервов (31,5±1,9%) был статистически значимо (p=8,7*10-18) ниже индекса цитотоксичности химиопрепаратов (41,1±1,7%) при действии на культуры клеток нейроглиальной ткани (n=10 трупов).
3. При влиянии на культуры клеток нейроглиальной ткани (n=10 трупов) 87,5% (7 из 8) комбинаций ФРН с химиопрепаратами в 10-кратно сниженной концентрации (кар-боплатином, метотрексатом, темозоломидом, циклофосфа-мидом, цисплатином, цитарабином, этопозидом) обладали значительно (p<0,001) более низкой цитотоксической эффективностью (ИЦ 21,1±0,9%) по сравнению с фактором роста нервов (ИЦ 31,5±1,9%), индекс цитотоксичности которого, в свою очередь, был ниже (p<0,05) ИЦ химио-препа-ратов (41,1±1,7%).
Таким образом, наиболее предпочтительно в качестве кандидата для дальнейших испытаний in vivo выглядят комбинации ФРН с химиопрепаратами, поскольку их цито-токсичность в отношении культуры клеток нейроглиальной ткани значительно ниже (p<0,05) по сравнению с химиопрепаратами и ФРН.
Список литературы
1. Божкова В.П., Брежетовский Л.А., Буравлев В.М. и др. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы; под ред.: Б.П. Вепринцева, И.В. Викторова, Б.Я. Вильнера. - М. : Наука, 1988. - 318 с.
2. Кузмич Е. А. Змачинский В. А., Миланович Н. Ф., Новоселова Н. Применение комбинации гемопоэтических факторов роста после высокодозовой химиотерапии с трансплантацией аутологичных гемопоэтических клеток // Медицина. - 2010. - № 4. - С. 64-68.
3. Миронов А. Н., Бунатян Н. Д., Васильева Н. А. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая; под ред.: А.Г. Муляр, О.Н. Чиченков. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
4. Савва Н. Н., Зборовская А. А., Алейникова О. В. Злокачественные новообразования у детей Беларуси: заболеваемость, выживаемость, смерт-ность, подходы к паллиативной помощи. - Минск: Респ. науч. мед. б-ка, 2008. - 180 с.
5. Селезнева А. И., Калатанова А. В., Афонькина О. В. Комплексный подход к изучению фармакологических веществ in vitro, ex vivo, in vivo / / Междунар. науч.-исслед. журн. - 2015. - № 6-2. -С. 125-127.
6. Чернов А. Н., Калюнов В. Н., Талабаев М. В., Григорьев Д. Г., Де-мидчик Ю. Е., Черствой Е. Д., Кульчицкий В. А. Изучение in vitro чувстви-тельности клеток опухолей центральной нервной системы к химиопрепара-там и фактору роста нервов // Новости медико-биологических наук. - 2010. -Т. 2,№ 4. - С. 176-188.
7. Antonelli A., Lenzi L., Nakagawara A., Osaki T., Chiaretti A., Aloe L. Tumor suppressor proteins are differentially affected in human ependymoblastoma and medulloblastoma cells exposed to nerve growth factor // Cancer Investigation. -2007. - Vol. 25, № 2. - P. 94-101.
8. Crawford J. R., Santi M. R., Vezina G., Myseros J. S., Keating R. F., LaFond D. A., Rood B. R., MacDonald T. J., Packer R. J. CNS germ cell tumor (CNSGCT) of childhood : presentation and delayed diagnosis // Neurology. - 2007. - Vol. 68, № 20. - P. 1668-1673.
9. de Groot C. J., Hulshof S., Hoozemans J. J., Veerhuis R. Establishment of microglial cell cultures derived from postmortem human adult brain tissue: immunophenotypical and functional characterization // Microscopical Research Technology. - 2001. - Vol. 54, № 1. - P. 34-39.
10. Gibbons H. M, Dragunow M. Adult human brain cell culture for neuroscience research // Intern. J. Biochem. Cell Biology. - 2010. - Vol. 42. - P. 844-856.
11. Hannula M .J., Myohanen T. T., Tenorio-Laranga J., Mannisto P. T., Garcia-Horsman J. A. Prolyl olygopeptidase colocalizes with a- synuclein, p-amyloid, tau protein and astroglia in the post-mortem brain samples with Parkinson's and Alzheimer's diseases // Neuroscience. - 2013. - Vol. 242. - P. 140-150.
12. Haggarty S. J., Silva M.C., Cross A., Brandon N.J., Perlis R.H. Advancing drug discovery for neuropsychiatry disorders using patient-specific stem cell models // Molecular and Cellular Neuroscience. - 2016. - Vol. 73. -
P. 104-115.
13. Hjelm B. E., Rosenberg J. B., Szelinger S., Sue L. I., Beach T. G., Huentelman M. J., Craig D. W. Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells // Neuroscience Letters. - 2011. - Vol. 502. - P. 219-224.
14. International agency for research of cancer (Globocan) [Electronic re-source]: the World of Health Organization, 2012. - Mode of access: http: www.globocan.iarc.fr. - Data of access: 23.03.2016.
15. Kunii Y., Zhang W., Xu Q., Hyde T.M., McFadden W., Shin J.H., Deep-Soboslay A., Ye T., Li C., Kleinman J.E., Wang K.H., Lipska B.K. CHRNA7 and CHRFAM7A mRNAs: co-localized and their expression levels altered in the postmortem dorsolateral prefrontal cortex in major psychiatric disorders // Amer. J. of Psychiatry. - 2015. - Vol. 172, № 11. - P. 1122-1130.
16. Lafay-Cousin L., Strother D. Current treatment approaches for infants with malignant central nervous system tumors // The Oncologist. - 2009. - Vol. 14, № 4. - P. 433-444.
17. Levi-Montalcini R. The nerve growth factor: thirty-five years later // The EMBO J. - 1987. - Vol. 6, № 5. - P. 11461154. (178)
18. McCormack A., Chegeni N., Chegini F., Colella A., Power J., Keating D., Chataway T. Purification of a-synuclein containing inclusions from human post mortem brain tissue // J. of Neuroscience Methods. - 2016. - Vol. 266. -
P. 141-150.
19. Michel T. M., Frangou S., Camara S., Thiemeyer D., Jecel J., Tatschner T., Zoechling R., Grunblatt E. Altered glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF) concentrations in the brain of patients with depressive disorder: a comparative post-mortem study // Europ. Psychiatry. - 2008. - Vol. 23. - P. 413-420.
20. Orre M., Kamphuis W., Dooves S., Kooijman L., Chan E.T., Kirk C. J., Dimayuga Smith V., Koot S., Mamber C., Jansen A.H., Ovaa H., Hol E. M. Reactive glia show increased immunoproteasome activity in Alzheimer's disease // Brain. -2013. - Vol. 136, Pt. 5. - P. 1415-1431.
21. Park D. C., Murman D. L., Perry K. D., Bruch L. A. An autopsy case of limbic encephalitis with voltage-gated potassium channel antibodies // Europ. J. of Neurology. - 2007. - Vol. 14, № 10. - P. e5-e6.
22. Pimentel, E. Handbook of growth factors : [in 3 vol.]; CRC Press Inc. - London ; Tokyo, 1994. - Vol. 2. Ch. 5 : Neurotrophic growth factors. - P. 217-240.
23. van Belle G., Fisher L.D., Heagerty P.J., Lumley Th. Biostatistics : a methodology for the helth sciences; eds: L. D. Fisher, G. van Belle. - Canada: Jonh Wiley and Sons Inc., 2004. -889 p.
