CC BY
22
Соотношение рецепторов ТгкА и р75 на клетках нейроэпителиальных опухолей - новая мишень воздействия комбинаций фактора роста нервов с цисплатином
или темозоломидом
А.Н. Чернов
ГНУ«Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси»; Республика Беларусь, 220072 Минск, ул. Академическая, 28
Контакты: Александр Николаевич Чернов al.chernov@mail.ru
Цель работы — изучить экспрессию, соотношение ТгЫ- и р75-рецепторов на клетках анапластической астроцитомы, глиоблас-томы и медуллобластомы и установить их взаимосвязь с чувствительностью клеток опухолей к фактору роста нервов (ФРН) и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом.
Материалы и методы. На первичных культурах клеток анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы изучены: 1) цитотоксический эффект ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом по определению индекса цитотоксич-ности; 2) изменение экспрессии и соотношения рецепторов ТгМ. и р75методом иммунофлуоресценции; 3) корреляции между экспрессией, соотношением рецепторов Т^Л, р75 и индексом цитотоксичности реагентов с помощью методов корреляционного анализа.
Результаты. Установлено, что экспрессия и соотношение рецепторов зависят от типа опухоли и механизма действия реагентов. Экспрессия и соотношение рецепторов Т^Л и р75 взаимосвязаны с чувствительностью клеток анапластической астроцитомы и глиобластомы к ФРН и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом.
Заключение. Соотносительная экспрессия рецепторов Т^Л, р75 и коэффициент ее корреляции с индексом цитотоксичности указывают на механизм (сигнальный путь), по которому идет гибель клеток.
Ключевые слова: фактор роста нервов, комбинация фактора роста нервов с цисплатином или темозоломидом, рецепторы Т^Л, р75, соотношение рецепторов, индекс цитотоксичности, корреляции
DOI: 10.17650/2222-1468-2016-6-4-53-61
The ratio of TrkA and p75 receptors on the cell neuroepithelial tumors — a new target effect of nerve growth factor
with cisplatin and temozolomide and the combinations
А.N. Chernov
Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Belarus; 28Akademicheskaya St., Minsk 220072, Republic of Belarus
Objective. To study the change of expression of TrkA, p75 receptors and their ratio on the human anaplastic astrocytoma, glioblastoma and medulloblastoma cells cultures exposed to nerve growth factor (NGF) and its combination with cisplatin or temozolomide, to establish participation of expression of the receptors in sensitivity tumor cells to NGF and its combinations with chemotherapeutical drugs.
Materials and methods. In primary cell cultures of anaplastic astrocytoma, glioblastoma and medulloblastoma were studied: 1) cytotoxicity effects of nerve growth factor and its combination with cisplatin or temozolomide; 2) the expression of TrkA, p75 receptors and the its ratio by immunofluorescence; 3) correlation between expression of TrkA, p75 receptors, the its ratio and index of cytotoxicity of reagents. Results. It is found that the expression of the receptors and the relationship depends on the tumor type and reagents' mechanism of action. Expression of TrkA and p75 receptors and their ratio correlated with sensitivity of anaplastic astrocytoma and glioblastoma cells to NGF and its combination with cisplatin or temozolomide.
Conclusion. Relative expression of TrkA/p75 receptor, and its coefficient of correlation with index of cytotoxicity point to a mechanism (signaling pathway), on which there is cell death.
Key words: nerve growth factor, combination of nerve growth factor with cisplatin or temozolomide, TrkA, p75 receptors, the ratio receptors, index of cytotoxicity, correlations
Введение
В настоящее время злокачественные новообразования по показателям распространенности, инвалиди-зации и смертности вышли на 2-е место вслед за патологией сердечно-сосудистой системы [1]. У детей и подростков интракраниальные неоплазии по степени распространенности занимают 2-е место после лейкозов, представляя собой гетерогенную по гистологическим типам группу. К наиболее злокачественным опухолям относятся медуллобластомы, нейробластомы, глиобластомы и анапластические астроцитомы [2, 3]. Прогноз для этих пациентов крайне неблагоприятный. Общая 5-летняя выживаемость составляет менее 50— 60 % после хирургического вмешательства, дополняемого химио- и лучевой терапией [4—6]. Общеизвестным фактом являются тяжелые токсические последствия химиотерапии на организм пациента. Это делает актуальным поиск новых подходов и стратегий лечения опухолей мозга: антиангиогенная, сонофото-динамическая и таргетная терапия [7, 8]. Последняя подразумевает исследование новых эффективных соединений, а также мишеней их воздействия на опухолевые клетки [7]. Среди таких соединений перспективным выглядит класс эндогенных биорегуляторов полифункциональной природы — ростовых факторов, которых к настоящему времени открыто более 80 [9]. Наиболее хорошо изучен фактор роста нервов (ФРН), способствующий выживаемости и развитию клеток центральной нервной системы, одновременно вызывающий ингибирование ангиогенеза, инвазии опухоли [10, 11]. Обнаружено, что ФРН обладает ци-тотоксическим противоопухолевым эффектом на культурах клеток интракраниальных неоплазий, который может усиливаться при комбинированном его применении с химиопрепаратами [9]. Поскольку химиотерапия опухолей мозга в клинике проводится с применением темозоломида и препаратов платиновой группы (цисплатина, карбоплатина и т. д.) [1, 4, 13, 14], то для сочетания с ФРН автором были выбраны указанные химиопрепараты. Доказано, что ФРН реализует свои эффекты на клетках через связывание с рецепторами — высокоаффинным тирозинкиназным ТгкА и низкоаффинным, содержащим домен смерти р75 [11, 15, 16]. Экспрессия первого из этих рецепторов на ней-робластомах является маркером благоприятного прогноза у пациентов с данной патологией, способствуя спонтанной регрессии опухоли в менее злокачественную ганглионеврому [11, 16—19].
Остается неизученным вопрос, могут ли рецепторы ТгкА и р75 на клетках анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы являться мишенями воздействия комбинаций ФРН с цисплатином или те-мозоломидом.
Цель исследования — изучить экспрессию, соотношение рецепторов ТгкА и р75 на клетках анапласти-
ческой астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы и установить их взаимосвязь с чувствительностью клеток опухолей к ФРН и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом.
Материалы и методы
Пациенты. Исследование выполнено на 19 пациентах в возрасте от 1 до 16 лет (медиана 8 лет), страдающих анапластической астроцитомой (n = 5), глиобластомой (n = 7) и медуллобластомой (n = 7), находившихся на лечении в детском нейрохирургическом отделении Городской клинической больницы скорой медицинской помощи г. Минска в 2010—2012 гг.
Первичная культура клеток нейроэпителиальных опухолей. Поступавший из клиники в течение 1 ч материал в стерильных условиях ламинарного бокса (Lobconco, США) отмывали от крови, освобождали от соединительно-тканных элементов в растворе Хэнк-са (Sigma-Aldrich, США), содержащем 4 % сульфат гентамицина (Белмедпрепараты, РБ), и механически измельчали до мелких частиц. Клетки подвергали 10-минутной ферментативной обработке смесью 0,25 % раствора трипсина и 0,02 % этилендиамин-тетрауксусной кислоты (ЭДТА) в соотношении 1:3 (Sigma-Aldrich, США) при температуре 37 °С. Действие фермента нейтрализовали внесением в чашки Петри с посевами 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США). Обработанный материал подсчитывали в камере Горяева (Минимед, Россия) и переносили в количестве 500 тыс. клеток/мл в чашки Петри (d = 35 мм, Nunc, Дания) с 1 мл среды «Игла» в модификации Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, США), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки опухолей культивировали на протяжении 2 сут в стандартных условиях СО2-инкубатора (Heraccell, США) при температуре 37 °С, 95 % влажности и 5 % парциальном давлении СО2 [20, 21].
Индекс цитотоксичности реагентов. На культурах опухолей тестировали цисплатин (Veropharm, Россия) в дозе 3,3 х 10-6 M (1 мкг/мл), темозоломид (Orion Pharma, Финляндия) в дозе 10,3 х 10-6 M (2 мкг/мл), 7S-форму рекомбинантного ФРН человека (Sigma-Aldrich, США) в дозе 8,8 х 10-9 M (0,1 мкг/мл) и комбинации ФРН с 10-кратно сниженной концентрацией цисплатина или темозоломида (цисплатин — 3,3 х 10-7 (0,1 мкг/мл), темозоломид — 10,3 х 10-7 M (0,2 мкг/мл)). Внесение реагентов проводили на стадии логарифмического роста культур, достижение которой оценивали визуально по резко возросшему количеству митозов и численности клеток с помощью цифровой фотокамеры Altra20, снабженной программным обеспечением Analysis getlT (Olympus, Япония), на инвертированном микроскопе НУ-2Е (Carl Zeiss, Германия) при увеличении х 312 [12]. Оценку индекса цитотоксичности (ИЦ) тестируемых соединений проводили спустя 1 сут после
экспозиции опухолевых культур с реагентами. Для этого оценивали чувствительность образцов неоплазий к реагентам на основе изучения гибели клеток, визуализируемой по поглощению 0,2 % раствора трипано-вого синего (Alta Aesar, Германия) в камере Горяева. Из посевов удаляли среду, добавляли 1 мл 0,25 % трипсина с ЭДТА и инкубировали в течение 5 мин при температуре 37 °С. Клетки пипетировали, вносили 1—2 капли 0,2 % раствора трипанового синего и переносили 20 мкл суспензии в камеру Горяева.
Подсчитывали количество мертвых (окрашенных) и жизнеспособных (прозрачных) клеток в 15 больших квадратах по диагонали и определяли их соотношение [20]. Полученный эффект — степень подавления роста опухолевых клеток химиопрепаратом [22] — был выражен ИЦ:
N % = (1 - Опыт/Контроль) х 100, где N % — ИЦ препаратов; Опыт — выживаемость клеток при действии химиопрепаратов, ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами; Контроль — выживаемость клеток в контроле [22].
Иммунофлуоресценция. Выявление рецепторов TrkA, p75 выполнено на первичных культурах, полученных от пациентов с анапластической астроцито-мой, глиобластомой и медуллобластомой. В каждую чашку Петри по истечении 2 сут роста культур наносили ФРН либо его комбинацию с 10-кратно сниженными концентрациями цисплатина или темозоломи-да. Спустя 1 сут среду удаляли и посевы 5-кратно промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (145 мМ хлорида, 7,3 мМ гидрофосфата и 2,7 мМ ди-гидрофосфата натрия, рН = 7,2), содержащим 1 % бычьего сывороточного альбумина, 4 % козьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) и 0,2 % тритона Х-100. На образцы наносили первичные моноклональные антитела к рецепторам ФРН: Anti-TrkA (SAB4902032, Sigma-Aldrich, США) и Anti-р75 (Pan-NGFR, Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:100. Указанные антитела разводили ФСБ на 0,3 % тритоне Х-100. Клетки с антителами инкубировали в течение 24 ч при температуре 4 °С. После 3-кратной промывки ФСБ культуры подвергали воздействию вторичных кроличьих FITC-конъюгированных антител Anti-Rabit Ig-FITC (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:1000 и выдерживали в темноте на протяжении 2 ч при комнатной температуре [23]. После инкубации посевы 3 раза отмывали от избытка реагентов и просматривали под флуоресцентным микроскопом Leitz MPV-2 (Германия) с цифровой камерой Leica DC350F (Германия) с возбуждающим 330—390 нм и эмиссионным 455—700 нм фильтрами L2, экспозицией 690 мс, усилением G1 при увеличении объектива х 16. Делали калибровку для данного объектива и переводили пиксели в микрометры. С помощью компьютерной программы ImageJ (версия 1.45r) оценивали:
1) процентное соотношение флуоресцирующих клеток к их общему количеству в 5 полях зрения для каждого образца;
2) интенсивность флуоресценции (пиксель/мкм2) в расчете на 1 клетку;
3) на основании ранее вычисленных показателей рассчитывали соотношение ТгкА/р75-рецепторов.
Определяли корреляции между соотношением ТгкА/р75-рецепторов и ИЦ ФРН, его комбинаций с химиопрепаратами на клетки опухолей. Проанализировано 800 посевов.
Статистическая обработка данных. Каждый эксперимент проводили не менее чем в 3 (3—5) независимых повторах. Результаты представляли как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего для выборки объема n (M ± m). Для сравнения 2 групп с относительно большим объемом выборки (n > 50) по выраженности количественных признаков применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA one-way) и /-критерий (Фишера) [24]. Предварительно каждую выборку проверяли на нормальность (распределение Гаусса) по критерию Колмогорова—Смирнова/Лиллифора и на однородность дисперсий по /-критерию. Вариабельность признаков оценивали по величине стандартного квадратического отклонения (с).
С помощью двухфакторного дисперсионного анализа без повторений (ANOVA two-way) рассчитывали уровни значимости для зависимости экспрессии рецепторов TrkA, р75, их соотношения от типа опухоли, механизма действия ФРН и его комбинаций с химио-препаратами. Установление корреляционных зависимостей между 2 неродственными показателями в выборке, подчиняющейся нормальному распределению, осуществляли с использованием коэффициента ранговой корреляции Пирсона r [24, 25]. Статистическую значимость коэффициентов корреляции в выборках, подчиняющихся нормальному распределению, оценивали по критерию Стьюдента t [25, 24]. Статистическую значимыми считали различия при уровне значимости p < 0,05. Для проведения описательной статистики и оценки статистической значимости различий между 2 группами использовали программу StatPlus 2005 пакета Statistica 6.0.
Результаты и обсуждение
На 1-м этапе оценивали ИЦ реагентов и их комбинаций при воздействии на культуры опухолевых клеток. Для этого ИЦ ФРН и его комбинаций с химиопрепара-тами сравнивали с обособленным действием химиопре-паратов (табл. 1).
Данные табл. 1 показывают, что цитотоксическое действие комбинации ФРН + цисплатин было выше (p < 0,05) индивидуального эффекта ФРН на культурах клеток анапластической астроцитомы и медуллоблас-
Таблица 1. Индекс цитотоксичности (%) химиопрепаратов, фактора роста нервов и его комбинаций с химиопрепаратами при воздействии на клетки интракраниальных опухолей
Реагент Индекс цитотоксичности, %
Анапластическая астроцитома Глиобластома Медуллобластома
Цисплатин 53,3 ± 6,4 46,9 ± 4,8 47,5 ± 5,1
Темозоломид 46,0 ± 5,4 40,0 ± 5,6 36,5 ± 3,3
Фактор роста нервов 55,8 ± 5,4 48,2 ± 4,7 37,4 ± 3,2
Фактор роста нервов + цисплатин 84,7 ± 3,6* 43,2 ± 4,2 47,3 ± 2,6*
Фактор роста нервов + темозоломид 52,4 ± 9,0 41,2 ± 6,4 52,2 ± 5,9*
*Статистически значимые (p < 0,05) отличия индекса цитотоксичности комбинаций реагентов от обособленного действия фактора роста нервов.
томы. Противоопухолевый эффект комбинации ФРН + темозоломид был выше (р < 0,05) действия ФРН на клетках медуллобластомы. Эффективность ФРН была сопоставима с цитотоксическим действием хи-миопрепаратов на клетках всех тестируемых опухолей.
Аддитивный эффект комбинации реагентов на культурах неопластических клеток поставил вопросы: могут ли рецепторы ФРН — ТгкА и р75 — являться мишенями комбинаций ростового фактора с химио-препаратами? Как изменяется экспрессия рецепторов на опухолевых клетках при воздействии комбинаций ФРН с цисплатином или темозоломидом?
Определяли количество неопластических клеток, экспрессирующих рецепторы ТгкА и р75 под воздействием ФРН и его комбинаций с цисплатином или те-мозоломидом.
В целях изучения экспрессии ТгкА- и р75-рецепторов и их соотношения на опухолевые клетки наносили антитела к рецепторам и реагенты, определяя интенсивность FITC-флуоресценции рецепторов в пересчете на 1 клетку
(рис. 1, 2).
12000
je
10000
г
г 8000
и
6000
4000
2000
г
0
9271,2
I
141,1
2214,9
1408,5
126,3*
267,
1090 1373,9 ■
392,2457,5
= ФРН, МБ ФРН+ ФРН, ГБ ФРН+ ФРН+
темозоломид, цисплатин, темозоломид,
МБ ГБ АА
ТгкА .р75
Рис. 1. Серии экспериментов, где в опухолевых клетках преобладала интенсивность FITC-флуоресценции антител кp75-рецепторам (группа «р75»). *Статистически значимые (p < 0,05) отличия интенсивности флуоресценции Т^Л-рецептора отр75в пределах 1 серии
Анализ результатов позволил распределить серии экспериментов при воздействии ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом по 2 группам, в каждой из которых статистически значимо (р < 0,05) преобладала экспрессия рецепторов ТгкА или р75 (см. рис. 1, 2).
К группе «р75» (см. рис. 1) были отнесены 5 серий опытов (в каждой из которых на клетки одного типа опухоли воздействовали одним из реагентов): при воздействии ФРН и комбинации ФРН + темозоло-мид — на клетки медуллобластомы; ФРН, комбинации ФРН + цисплатин — на клетки глиобластомы; ФРН + темозоломид — на клетки анапластической астроцитомы.
К группе «ТгкА» (см. рис. 2) — 4 серии: при воздействии комбинации ФРН + цисплатин — на клетки медуллобластомы; комбинации ФРН + темозоломид — на клетки глиобластомы; ФРН, комбинации ФРН + цисплатин — на клетки анапластической астроцитомы.
Из рис. 1 и 2 видно, что экспрессия ТгкА-рецептора в пределах каждой серии статистически значимо
2 4500
I 4000
5 3500 £
1 3000
1 2500
| 2000
| 1500
Л 1000
| 500 1 0
| ФРН, АА ФРН + ФРН + ФРН +
цисплатин, АА темозоломид, цисплатин, МБ ГБ
■ Ш ■ p75
Рис. 2. Серии экспериментов, где в опухолевых клетках преобладала интенсивность FITC-флуоресценции антител к Т^Л-рецепторам (группа «Т^Л»). *Статистическизначимые (р < 0,05) отличия интенсивности флуоресценции Т^Л-рецептора отр75в пределах 1 серии
Таблица 2. Зависимость экспрессии Т^Л-, р75-рецепторов и их соотношения от механизма действия реагентов
Зависимость экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов и их соотношения Реагент
все реагенты фактор роста нервов фактор роста нервов + цисплатин фактор роста нервов + темозоломид
От типа опухоли, р 2,0 х 10-" (90) 0,0028 (18) 0,011 (18) 0,52 (18)
Примечание. Здесь и в табл. 3: курсивом выделены статистически значимые различия (р < 0,05). В скобках — число степеней свободы для образцов опухолей пациентов, подвергнутых воздействию фактора роста нервов и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом.
Таблица 3. Зависимость экспрессии Т^Л-, р75-рецепторов и их соотношения от типа опухоли
Зависимость экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов и их соотношения Тип опухоли
все типы анапластическая астро-цитома глиобластома медуллобластома
От механизма действия реагента, р 1,1 х 10-23 (90) 0,00074 (25) 1,0 х 10-18 (30) 5,8 х 10-9 (30)
■
■
(р < 0,05) отличалась от таковой для рецептора р75. Исключение составили серии при применении комбинации ФРН + цисплатин на клетки глиобластомы и ФРН + темозоломид на клетки анапластической астроцитомы.
Следует обратить внимание на то, что в пределах 1 серии все пациенты с одним типом опухоли относились к одной группе («ТгкА» или «р75»), т. е. для всех пациентов было характерно преобладание экспрессии одного типа рецепторов. Тогда как клетки тех же пациентов (с указанным типом опухоли) под действием другого реагента (в другой серии) проявляли доминирование другого типа рецепторов во всех случаях. Например, все исследуемые пациенты (п = 7), страдающие медуллобластомой, при воздействии ФРН и комбинации ФРН + темозоломид были отнесены к группе «р75», а при воздействии ФРН + цисплатин — к группе «ТгкА». Такое доминирование того или иного типа рецепторов в каждой серии опытов связано с механизмом действия реагентов и зависит от типа опухоли. Необходимо отметить, что экспрессия р75-рецепторов статистически значимо (р < 0,05) отличалась от ТгкА-рецепторов как внутри каждой из указанных групп («ТгкА», «р75»), так и между ними (табл. 2, 3).
В группе «р75» преобладала экспрессия рецептора р75, которая была статистически значимо (р = 0,001) выше экспрессии в группе «ТгкА», и наоборот.
Методом двухфакторного дисперсионного анализа установлена зависимость экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов и их соотношения от типа опухоли и механизма воздействия реагентов (см. табл. 2). Экспрессия рецепторов ТгкА, р75 и их соотношение статистически значимо зависят от типа опухоли (р = 2,0 х 10-11) и механизма действия реагентов (р = 1,1 х 10-23). Зависимость от типа опухоли была установле-
на при действии ФРН и комбинации ФРН + циспла-тин. Зависимость от механизма действия реагента была констатирована для всех рассматриваемых типов опухолей. Таким образом, зарегистрирована более сильная зависимость экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов от механизма действия реагента, чем от типа опухоли.
Изучали соотношение рецепторов ТгкА/ р75 на клетках опухолей (табл. 4).
Данные табл. 4 показывают, что в группах «ТгкА» и «р75» значения интенсивности флуоресценции антител к ТгкА- и р75-рецепторам, а также соотношение ТгкА/р75 статистически значимо отличались как в своей группе, так и между группами (р = 0,04; р = 0,0002 и р = 0,0004 соответственно). Между группами были выявлены статистически значимые (р = 0,03) различия для величин, выражающих в процентном отношении разницу интенсивностей флуоресценции преобладающего над меньшим типами экспрессирующихся рецепторов (разница %), данный показатель был статистически значимо выше в группе «р75». При одинаковом уровне ИЦ в группах «ТгкА» и «р75» этот факт свидетельствует о большей аффинности ТгкА-рецептора и различиях в механизмах взаимного функционирования рецепторов. Он подтверждается показателями соотношения ТгкА/р75-рецепторов, отличающимися между группами в 12,8 раза (р = 0,0004).
На основании анализа полученных результатов возник вопрос: существует ли взаимосвязь экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов и их соотношения (ТгкА/р75) с чувствительностью клеток опухолей к ФРН и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом? С этой целью автор рассчитывал коэффициент корреляции между ИЦ неопластических клеток пациентов, обработанных ФРН и его комбинациями с цисплатином или
Таблица 4. Интенсивность флуоресценции антител к ТгШ- ир75-рецепторам, их соотношение и индекс цитотоксичности в группах пациентов с преобладанием Т^Л- ир75-рецепторов*
Показатель Группа «ТгкА» Группа «р75» Уровень значимости между группами
Интенсивность флуоресценции к ТгкА, пиксель/мкм2 1379,9 ± 316,7 р внутри группы 616,2 ± 137,1 р внутри группы р = 0,04
Интенсивность флуоресценции к р75, пиксель/мкм2 0,01 459,2 ± 153,4 0,0005 3095,9 ± 652,7 р = 0,0002
Разница, % 842,4 ± 455,3 1587,9 ± 206,5 р = 0,03
Соотношение ТгкА/р75 7,7 ± 0,2 0,6 ± 0,2 р = 0,0004
Индекс цитотоксичности, % 48,8 ± 3,5 45,4 ± 4,8 О 1 1
Примечание. Жирным шрифтом выделены статистически значимые показатели (р < 0,05). Разница, % — это различие между преобладающим и меньшим значениями интенсивности флуоресценции в % в серии эксперимента, рассчитывали по формуле: ((экспрессия Т^Л/экспрес-сия р75) х 100) — ((экспрессия р75/экспрессия Т^Л) х 100) в серии, где преобладала экспрессия Т^Л-рецептора, и ((экспрессия р75/экспрес-сия Т^Л) х 100) — ((экспрессия Т^Л/экспрессияр75) х 100) в серии, где преобладала экспрессияр75 рецептора. *Приведены средние значения ± ошибка среднего, вычисляемые по данным всех пациентов (во всех сериях) в пределах 1 группы.
темозоломидом, и экспрессией ТгкА-, р75-рецепторов, их соотношением.
В целях выявления механизмов действия ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами в опухолевых клетках определяли изменение экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов относительно их экспрессии на клетках контрольных серий.
Статистически значимые корреляции экспрессии рецепторов ТгкА и р75 с ИЦ реагентов выявлены для клеток анапластической астроцитомы и глиобла-стомы. В сериях опытов документировано наличие различных вариантов корреляций ИЦ с экспрессией рецепторов и их соотношением. Это свидетельствует о наличии различных механизмов действия реагентов, некоторые из которых можно установить путем сопоставления коэффициентов корреляций со значениями, отражающими в процентах экспрессию рецепторов ТгкА и р75 по отношению к экспрессии рецепторов в контрольных сериях. Противоположные знаки коэффициентов корреляций ТгкА- и р75-рецепторов с ИЦ документируют антагонизм действия указанных рецепторов по отношению к гибели клеток (табл. 5).
Например, на клетках анапластической астроци-томы при воздействии ФРН преобладала экспрессии ТгкА-рецептора, при этом, как и в контрольной серии, была отмечена положительная корреляция (р < 0,05) ИЦ с соотношением ТгкА/р75-рецепторов. Следовательно, цитотоксический эффект ФРН реализуется преимущественно через ТгкА-рецепторы (см. табл. 4). Воздействие комбинации ФРН + цисплатин на клетки анапластической астроцитомы приводило к снижению экспрессии преобладающего в серии ТгкА-рецептора по отношению к экспрессии рецептора р75 в сравнении с контрольной серией. Положительная (р < 0,0001) корреляция ИЦ с экспрессией р75-рецептора свидетельствует о наличии сигнального пути, запускаемого
через него (см. табл. 4). Механизм действия данной комбинации, проявляющийся значительным увеличением экспрессии р75-рецептора (при менее интенсивном росте ТгкА), совпадает с механизмом гибели клеток опухоли через р75-рецепторы, что свидетельствует о потенциальной эффективности данной комбинации реагентов. На клетках анапластической астроцитомы при воздействии комбинации ФРН + темозоломид установлены положительные (р < 0,05) корреляции ИЦ с экспрессией ТгкА-рецептора, соотношением ТгкА/р75-рецепторов и отрицательная (р < 0,01) корреляция с экспрессией р75-рецептора, что свидетельствует о запуске гибели неопластических клеток в основном через ТгкА-путь. Тогда как механизм действия комбинации ФРН + темозоломид, выраженный отсутствием преобладающего типа рецептора в соотношении (в отличие от контроля, где преобладает ТгкА) и значительным ростом экспрессии р75-рецептора, препятствует ее эффективному цитотоксическому действию.
При воздействии ФРН на клетки глиобластомы установлена положительная корреляция (р < 0,02) ИЦ реагента с соотношением ТгкА/р75-рецепторов и отрицательная (р < 0,0001) ИЦ реагента с экспрессией р75-рецептора, что указывает на запуск гибели клеток через ТгкА-путь. Противоположные знаки корреляционных зависимостей указывают на антагонизм ТгкА-и р75-рецепторов в гибели опухолевых клеток. Механизм действия ФРН в клетках глиобластомы характеризовался преобладанием экспрессии р75-рецептора (так же, как в контроле), уменьшением соотношения ТгкА/р75 (по сравнению с контролем).
Экспрессия ТгкА-рецептора статистически значимо не изменялась. Такой механизм действия ФРН препятствует гибели опухолевых клеток через ТгкА-рецепторы. При воздействии комбинации ФРН +
Таблица 5. Коэффициент корреляции между экспрессией Т^Л-, р75-рецепторов, их соотношением и индексом цитотоксичностиреагентов при воздействии на клетки опухолей
Серия эксперимента Число степеней свободы Преобладающий тип рецептора Интенсивность флуоресценции антител к рецепторам по отношению к контрольной серии, % Коэффициент корреляции с индексом цитотоксичности, г, уровень значимости, р
в серии TrkA p75 TrkA p75 соотношение TrkA/p75
АА — контроль 54 ТгкА (6,7) 100,0 100,0 - - -
АА - ФРН 54 ТгкА (7,2) 112,9 106,4 0,13 -0,32 0,43 р < 0,05
АА - ФРН + ЦП 54 ТгкА (2,7)* 176,4** 434** -0,19 0,68 р < 0,0001 -0,20
АА - ФРН + ТД 54 Нет преобладания 100,7 792,9** 0,42 р < 0,05 -0,51 р < 0,01 0,46 р < 0,05
ГБ — контроль 68 р75 (20,8) 100,0 100,0 - - -
ГБ - ФРН 68 р75 (34,6)* 94,6 157,9** 0,27 -0,71 р < 0,0001 0,44 р < 0,02
ГБ - ФРН + ЦП 68 Нет преобладания 385,4** 23,4** -0,65 р < 0,0001 -0,06 -0,47 р < 0,02
ГБ - ФРН + ТД 68 ТгкА (3,1) 1221** 18,8** 0,50 р < 0,001 -0,53 р < 0,001 0,63 р < 0,0001
МБ - контроль 66 р75 (2,1) 100,0 100,0 - - -
МБ - ФРН 66 р75 (1,9) 117,4 110,3 0,12 -0,28 0,26
МБ - ФРН + ЦП 66 ТгкА (1,9) 48,7** 12,4** -0,04 -0,3 0,25
МБ - ФРН + ТД 66 р75 (11,2)* 13** 70,1 0,27 0,34 -0,01
Примечание. В скобках указаны значения экспрессии преобладающего типа рецептора по отношению к меньшему в каждой серии (количество преобладающего в соотношении типа рецепторов/количество рецепторов противоположного типа). Жирным шрифтом, символом * обозначены статистически значимые (р < 0,05; р < 0,01) отличия значений экспрессии преобладающего рецептора по отношению к меньшему в каждой серии по сравнению с контролем. Интенсивность флуоресценции антител к рецепторам по отношению к контрольной серии, %, вычислялась по формуле: (экспрессия ТгШ (или р75) под воздействием реагента/экспрессия Т^Л (или р75) в контроле) х 100. Условно интенсивность флуоресценции антител к Т^Л- илир75-рецепторам в контрольных сериях для каждого типа опухоли принята за 100 %. Жирным шрифтом, символом ** обозначены статистически значимые (р < 0,05) отличия интенсивности флуоресценции антител к рецепторам по отношению к контрольной серии. Жирным шрифтом обозначены статистически значимые (р < 0,05) коэффициенты корреляции индекса цитотоксичности с экспрессией Т^Л- и р75-рецепторов и их соотношением. Знак прочерка в графах для корреляций в контрольных сериях указывает на то, что данные корреляции не рассчитаны, поскольку индекс цитотоксичности в контрольных посевах равен нулю. АА — анапластическая астроцитома; ФРН — фактор роста нервов; ЦП — цисплатин; ТД — темозоломид; ГБ — глиобластома; МБ — медуллобластома.
темозоломид на клетки глиобластомы выявлены положительные корреляции между ИЦ комбинации и экспрессией ТгкА-рецептора (р < 0,001), соотношением ТгкА/р75-рецепторов (р < 0,001) и отрицательная (р < 0,0001) корреляция между ИЦ комбинации и экспрессией р75-рецептора. Такие показатели констатируют активацию гибели клеток опухоли через ТгкА-сигнальный путь. При этом механизм действия комбинации ФРН + темозоломид по своим показателям соответствовал установленным корреляционным зависимостям. Например, при положительной корре-
ляции между ИЦ и экспрессией ТгкА-рецептора, соотношением ТгкА/р75 в механизме действия наблюдали доминирование ТгкА-рецептора над р75 (в отличие от контроля, где доминировал р75-рецептор), увеличение численности ТгкА-рецептора (в 12 раз) по сравнению с контролем. При отрицательной корреляции между ИЦ и р75-рецептором его экспрессия была статистически значимо ингибирована (в 5 раз по отношению к контролю). Таким образом, комбинация ФРН + темозоломид обладает потенциальной противоопухолевой эффективностью.
При воздействии ФРН и его комбинаций с циспла-тином или темозоломидом на клетки медуллобластомы не было установлено статистически значимых корреляций экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов и их соотношения с ИЦ реагентов.
В сериях при воздействии ФРН и комбинации ФРН + темозоломид на клетки медуллобластомы преобладал рецептор р75. Применение ФРН стимулировало на неопластических клетках экспрессию р75 в большей степени, чем ТгкА-рецептора, по отношению к контролю, при этом их численность становилась примерно одинаковой. Воздействие комбинации ФРН + темозоломид на клетки медуллобластомы приводило к статистически значимому (р < 0,001) ингибированию на них экспрессии ТгкА-рецептора (в 7,5 раза) при незначительном подавлении экспрессии р75, что явилось причиной статистически значимого преобладания р75-рецептора на клетках опухоли по сравнению с контролем. При воздействии комбинации ФРН + циспла-тин на клетки медуллобластомы преобладала (р < 0,05) экспрессия ТгкА-рецепторов, явившаяся результатом стимулирования (р < 0,01) комбинацией синтеза молекул ТгкА-рецептора и сильного ингибирования р75-рецептора на клетках опухоли. Вследствие наличия функционального антагонизма у данных рецепторов и более выраженного подавления экспрессии р75-рецептора, чем ТгкА-рецептора (образующих структурные гетерокомплексы на мембранах клеток), р75-рецептор препятствует значительному увеличению численности ТгкА и гибели клеток медуллобластомы через ТгкА-сигнальный путь. Приведенные механизмы действия ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом на клетки медуллобластомы, отсутствие статистически значимых корреляций с ИЦ свидетельствуют о том, что гибель клеток осуществляется через альтернативные сигнальные пути.
Таким образом, установлены статистически значимые положительные и отрицательные корреляции между ИЦ реагентов и экспрессией ТгкА-, р75-рецепторов, их соотношением (ТгкА/р75) на клетках анапластической астроцитомы и глиобластомы. Различные варианты корреляционных зависимостей указывают на доминирование разных сигнальных каскадов, запускающих гибель опухолевых клеток. Среди них для исследованных типов опухолей преобладал ТгкА-путь: при воздействии ФРН, комбинации ФРН + темозоломид на клетки анапластической астроцито-мы и глиобластомы. Гибель клеток анапластической астроцитомы и глиобластомы через р75-рецепторы установлена при воздействии комбинации ФРН + цисплатин. На клетках медуллобластомы статистически значимых корреляций экспрессии указанных рецепторов с ИЦ не выявлено.
Во всех сериях экспериментов и на всех типах опухолей зарегистрирован функциональный антагонизм
экспрессии ТгкА-, р75-рецепторов по отношению к гибели клеток (только в случае применения ФРН + цисплатин на клетках глиобластомы он маскируется экспрессией аберрантных ТгкАШ-рецепторов). Соотношение ТгкА/р75-рецепторов и коэффициент его корреляции с ИЦ документируют механизм (сигнальный каскад), по которому идет гибель клеток опухоли при воздействии ФРН и его комбинаций с цисплати-ном или темозоломидом. На гибель опухолевых клеток также влияют тип доминирующего рецептора, его статус, описываемый соотношением ТгкА/р75 (сверхэкспрессия, ингибирование или одинаковое количество), возможно формирование структурных гетерокомплексов рецепторов ТгкА—р75 [26]. На наличие последнего факта указывают коэффициенты корреляций между ИЦ реагентов и экспрессией ТгкА-, р75-рецепторов одного знака и соответствующие им функциональные изменения экспрессии рецепторов [27—31].
Выводы
Установлено присутствие ТгкА- и р75-рецепторов на клетках анапластической астроцитомы, глиоблас-томы и медуллобластомы при воздействии на них ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоло-мидом.
При воздействии любого из указанных реагентов на клетки опухоли наблюдали различия в экспрессии ТгкА- и р75-рецепторов и их соотношения (в пересчете на 1 клетку) в пределах одного и различных типов опухолей.
В каждой серии эксперимента статистически значимо (р = 0,001) преобладала экспрессия ТгкА- либо р75-рецептора, на основании чего сформированы группы «ТгкА» и «р75». Экспрессия рецепторов ТгкА и р75 также статистически значимо (р = 0,03) различалась между указанными группами.
Верифицирована зависимость экспрессии рецепторов ТгкА, р75 от механизма действия реагента (р = 1,1 х 10-23) и от типа опухоли (р = 2,0 х 10-11).
Установлены статистически значимые (р < 0,05; р < 0,0001) положительные (г = 0,42—0,68; число степеней свободы 54—68) и отрицательные (г = —0,42-(—0,71); число степеней свободы 54—68) корреляции между ИЦ ФРН, его комбинаций с циспла-тином, темозоломидом и показателями экспрессии рецепторов ТгкА, р75, их соотношением на клетках анапластической астроцитомы и глиобластомы. Различные варианты корреляционных зависимостей указывают на доминирование разных сигнальных каскадов (ТгкА-, р75-пути), запускающих гибель опухолевых клеток при воздействии реагентов. Соотносительная экспрессия ТгкА /р75-рецепторов и коэффициент ее корреляции с ИЦ указывают на механизм (сигнальный путь), по которому идет гибель клеток.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Grauer O., Pascher Ch., Hartmann Ch. et al. Temozolomide and 13-cis retinoic acid in patients with anaplastic gliomas: a prospective single-arm monocentric phase-II study (RNOP-05). J Neurooncol 2011;104(3):801—9.
2. Савва Н.Н., Зборовская А.А., Алейникова О.В. Злокачественные новообразования у детей Беларуси: заболеваемость, выживаемость, смертность, подходы к паллиативной помощи. Минск, 2008. 180 с.
[Savva N.N., Zborovskaya A.A., Aleynikova O.V. Malignant tumors in children of Belarus: incidence, survival, mortality approaches to palliative care. Minsk, 2008. 180 p. (In Russ.)].
3. Lafai-Cousin L., Strother D. Current treatment approaches for infants with malignant central nervous system tumors. Oncologist 2009;14:433-44.
4. Конопля Н.Е. Лечение медуллобластомы у детей младше 4 лет. Meдицинск:ий журнал 2009;(1):112-4. [tom^ya N.E. Treatment
of medulloblastoma in children younger than 4 years. Meditsinskiy zhurnal = Medical Journal 2009;(1):112-4. (In Russ.)].
5. Bobustuc G.C., Baker C.H., Limaye A. et al. Levetiracetam enhances p53-mediated MGMT inhibition and sensitizes glioblastoma cells to temozolomide. Neurooncology 2010; 12(9):917-27.
6. Kokunai T., Iguchi H., Tamaki N. Differentiation and growth inhibition
of glioma cells induced by transfer of trk A proto-oncogene. J Neurooncol 1999;42(1): 23-34.
7. Борисов К.Е., Сакаева Д.Д. Таргетная терапия злокачественных глиом: состояние проблемы. Российский онкологический журнал 2011;(3):47-53. [Bоrisоv К.Е., Sаkаеvа D.D. Targeted therapy of malignant gliomas: state of the problem. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal = Russian Oncological Journal 2011;(3):47-53. (In Russ.)].
8. Церковский Д.А. Соно-фотодинамиче-ская терапия - новый метод лечения злокачественных опухолей мозга. Онкологический журнал 2015;9(1):94—106. [Tserkovskiy DA. Sono-photodymanic therapy — a new method in the treatment of maligant brain tumors. Onkologicheskiy zhurnal = Oncological Journal 2015;9(1):94—106.
(In Russ.)].
9. Pimentel E. Handbook of growth factors.
In 3 vol. London, Tokyo: CRC Press Inc, 1994.
Vol. 2, Ch. 5: Neurotrophic growth factors. Рр. 217—40.
10. Калюнов В.Н. Биология фактора роста нервной ткани. Минск: Наука и техника, 1986. 206 с. [K^yum^ V.N. Bfofogy of the growth factor of nervous tissue. Minsk: Nauka i tekhnika, 1986. 206 p. (In Russ.)].
11. Tacconelli A., Farina A.R., Cappabianca L. et al. TrkA alternative splicing: a regulated tumor-promoting switch in human neuroblastoma. Cancer Cell 2004;6(4):347—60.
12. Чернов А.Н., Талабаев М.В., Конопля Н.Е. и др. Влияние химиопрепаратов и фактора роста нервов на выживаемость клеток первичной культуры нейроэпителиальных опухолей. Вестник Национальной академии наук Беларуси. Серия медицинских наук 2013;(1):46—51. [Chernov A.N., Такает M.V., Kоnоplya N.E. et al. Action of the nerve growth factor and chemotherapeutical drugs upon
the viability of the cells of the neuroepithelial tumor primary culture. Vestnik Natsional'noy akademii nauk Belarusi. Seriya meditsinskikh nauk = Proceedings of the National Academy of Sciences of Bеlarus. Series of Medical Sciences 2013;(1):46—51. (In Russ.)].
13. Чу Э., де Вита В. мл. Химиотерапия злокачественных опухолей. М.: Практика, 2008. 447 с. [Chu E., dе Vto V. Jr. Chemotherapy of malignant tumors. Moscow: Praktika, 2008. 447 p. (In Russ.)].
14. Wolff J.E., Kortmann R.-D., Wolff B. et al. High-dose methotrexate for pediatric high grade glioma — results of the HIT-GBM-D pilot study. J Neurooncol 2011;102(3):433—42.
15. Korade M.Z., Yan C., Portugal C. et al. Expression and p75 neurotrophin receptor dependence of cholesterol synthetic enzymes in adult mouse brain. Neurobiol Aging 2007;28(10):1522—31.
16. Nakagawara A. Trk receptor tyrosine kinases: a bridge between cancer and neural development. Cancer Let 2001;169(2):107—14.
17. Brodeur G.M. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat Rev 2003;3(3):203—15.
18. Brodeur G.M., NakagawaraA., Yamashiro DJ. et al. Expression of TrkA, TrkB and TrkC
in human neuroblastomas. J Neuronal 1997;31(1):249—56.
19. Harel L., Costa B., Fainzilber M. On the death Trk. Dev Neurobiol 2010;70(5):298—303.
20. Божкова В.П., Вепринцев Б.П., Викторов И.В. и др. Руководство по культивиро-
ванию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы. М.: Наука, 1988. 318 c. [Bоzhkоvа V.P., Vеprintsеv B.P., Viktоrоv I.V. et al. Guidance for cultivation of nervous tissue. Mеthоds. Technics. Problems. Moscow: Nauka, 1988. 318 p. (In Russ.)].
21. Freshney R.I. Animal Cell Culture:
a Practical Approach. Eds. by: W. Masters 3rd. London: Oxford University Press, 2000. 315 p.
22. Миронов А.Н., Бабаян НД., ВасильеваАН. и др. Руководство по проведению доклинических испытаний лекарственных средств. Ч. 1. М.: Гриф и К, 2012. 944 с. [Мшэпэт- AN., Babayan N.D., Vasil'eva A.N. et al. Guidance for the testing of pre-clinical investigation
of medicinal drugs. P. 1. Moscow: Grif i К, 2012. 944 p. (In Russ.)].
23. Ghinelli E., Johansson J., Rios J.D. et al. Presence and localization of neurotrophins and neurotrophin receptors in rat lacrimal gland. Inv Ophthalmol Visual Sci 2003;44(8):3352—7.
24. van Belle G., Fisher L.D., Heagerty P.J.
et al. Biostatistics: a methodology for the health sciences. Canada: Jonh Wiley and Sons Inc, 2004. 889 p.
25. Гланц С. Медицинская и биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 356 с. [Gknts S. Medical and biological statistics. Moscow: Praktika, 1999. 356 p. (In Russ.)].
26. Kruttgen A., Schneider I., Weis J. The dark side of the NGF family: neurotrophins
in neoplasias. Brain Pathol 2006;16(4):304—10.
27. Chen J., Zhe X. Cotransfection of TrkA and p75NTR in neuroblastoma cell line IMR-32 promotes differentiation and apoptosis of tumor cells. Chinease Med J 2003;116(6):906—12.
28. Evangelopoulos M.E., Weis J., Kruttgen A. Neurotrophin effects on neuroblastoma cells: correlation with Trk and p75NTR expression and influence of TrkA receptor bodies.
J Neurooncol 2004;66(1—2):101—10.
29. Heymach J.V., Schooter E.M. The biosyntesis of neurotrophin heterodimeres by transfected mammalian cells. J Biol Chem 1995;270(20):12297—304.
30. Pflug B.R., Colangelo A.M., Tornatore C. et al. TrkA induces differentiation but not apoptosis in C6—2B glioma cells. J Neurosci Res 2001;64(6):636—45.
31. Wadhwa S., Nag T.C., Jindal A. et al. Expression of the neurotrophin receptors TrkA and TrkB in adult human astrocytoma
and glioblastoma. J Biosci 2003;28(2): 181—8.
