CC BY
9BIOLOGICAL SCIENCES | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ И ВОЗДЕЙСТВИЕ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ НА ЧИСЛЕННОСТЬ КОПИЙ C-MYC, N-MYC-ОНКОГЕНОВ В КЛЕТКАХ МЕДУЛЛОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА
Чернов А.Н.
научный сотрудник лаборатории нейрофизиологии ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси», соискатель ученой
степени кандидата наук
Конопля Н.Е.
доктор медицинских наук, доцент, заместитель директора по клинике РНПЦ детской онкологии, гематологии и
иммунологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь
PROGNOSTIC VALUE AND IMPACT OF NERVE GROWTH FACTOR ON THE NUMBER COPIES OF C-MYC, N-MYC-ONCOGENES IN HUMAN MEDULLOBLASTOMA CELLS
Alexander N.C. - researcher of the Laboratory of Neurophysiology «Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Belarus»
Konoplya N.E. - doctor of medical sciences, Associate Professor, Deputy Director of the Clinic Centre of Pediatric Oncology, Hematology and Immunology of the Ministry of Health of the Republic of Belarus
АННОТАЦИЯ
В статье выявляли амплификацию генов myc семейства (c-myc-, n-myc) в клетках медуллобластомы, которая была установлена у 22,2% пациентов. Выявлена отрицательная корреляция наличия амплификации онкогенов myc семейства с общей выживаемостью пациентов. Это позволяет провести более точную стратификацию пациентов по группам риска с целью определения интенсивности и продолжительности терапии. Также изучено влияние фактора роста нервов (ФРН) на численность копий c-myc-, n-myc-онкогенов в клетках мебуллобластомы. Констатировано, что применение ФРН снижало численность клеток медуллобластомы, обладающих шестью-, восьмью-копиями n-myc-онкогена, клеток, содержащих три-, восемь копий c-myc-онкогена, но увеличивало численность опухолевых клеток, содержащих двойной набор копий обоих онкогенов. Документирована статистически значимая (p<0,0001) отрицательная корреляция (r=-0,65, df=7) между средним числом копий с-myc-онкогена в клетках медуллобластомы и индексом цитотоксичности ФРН, воздействующего на них, что указывает на участие онкогена в снижении чувствительности опухолевых клеток к ростовому фактору.
ABSTRACT
In this &udy we revealed amplification of myc family oncogenes in medullobla^oma cells, which has been detected in 22.2% patients. A negative correlation between the presence of family myc oncogene amplification with overall survival of patients has been detected. This allows to carry out a more accurate Gratification of patients into risk groups to determine the intensity and duration of therapy. It was also Sudied the effect of NGF on c-myc-, n-myc-oncogenes' number copy in mebullobla^oma cells. It was found that the use of NGF reduced the number of medullobla^oma cells having 6-, 8-copies of n-myc-oncogene, the cells containing 3, 8 copies of the c-myc-oncogene, but increased the number of tumor cells that contain a double set of copies of both oncogenes. It was documented a Satirically significant (p<0,0001) negative correlation (r=-0,65, df=7) between the average number of copies of the c-myc-oncogene in medullobla^oma cells and the index of cytotoxicity of NGF, indicating the involvement of the oncogene to reduce the sensitivity of tumor cells to the growth factor.
Ключевые слова:медуллобластома, фактор роста нервов, с-myc, n-myc-онкогены, амплификация, флуоресцентная in situ гибридизация, индекс цитотоксичности, корреляция, прогностическое значение.
Keywords: medullobla^oma, nerve growth factor, c-myc, n-myc-oncogenes, amplification, fluorescent in situ hybridization, index of cytotoxicity, correlation, the progno^ic value.
Самой распространенной злокачественной интракрани-альной опухолью в детском возрасте является медуллоб-ластома (МБ), на долю которой приходится от 15-25% всех первичных неоплазий центральной нервной системы [1]. Успехи комплексного и комбиниованного лечения позволил существенно повысить 5-летнюю общую выживаемость [2]. Однако, около 30% пациентов остаются неизлечимыми, и агрессивная химиолучевая терапия часто приводит к тяжелым отдаленным побочным эффектам [3]. Стратегия лечения в настоящее время основана на системе стратификации пациентов по группам риска, установленной Packer с соавт.,
при которой выделяется две группы: стандартного и высокого риска. Группы определяются в соответствии наличием остаточной опухоли более чем 1,5 см3, метастазирования и возраста детей менее 3 лет [4]. Согласно классификации ВОЗ распознается, по крайней мере, пять различных гистологических типов МБ, и появляется все больше доказательств того, что прогноз и ответ на терапию во многом зависят от биологии опухолевых клеток. В настоящее время в качестве прогностических маркеров выявлены многие гены и хромосомные аберрации. Различают цитогенетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза. На-
пример, к маркерам неблагоприятного исхода относят повышенную экспрессию или амплификацию генов семейства туе, вставки Ц+, 17q+, делеции 10q-, 17р-, или траслока-цию ^17)^10) [5, 6, 7, 8]. Экспрессия туе-онкогенов в МБ сочетается с высокой злокачественностью новообразования и низким (13%) показателем пятилетней общей выживаемости онкологических пациентов [5, 9], которые умирают в течение одного месяца [10]. В результате наличия достоверной корреляции между высоким уровнем экспрессии и/или амплификации е-туе, п- туе-онкогенов и неблагоприятным течением заболевания данные маркеры принято считать одним из важных факторов стратификации по группам риска [11, 12, 13]. Однако в некоторых исследованиях отмечается, что амплификация генов туе не является независимым фактором стратификации [15,17]. Имеющихся данных пока недостаточно для адекватной риск-стратификации, поэтому постоянно ведется поиск новых биологических факторов или уточнение влияния старых на развитие опухоли, ответ на терапию или исход заболевания.
Пристальное внимание туе онкогенам уделяется не случайно, так как они стимулируют многие процессы: некроз [14], апоптоз [15], пролиферацию, репликацию ДНК и вхождение в S-фазу клеточного цикла [15, 16, 17], генетическую нестабильность, сочетающуюся с гетеро- [18], те-траплоидностью, анаплазией [19], активность теломеразы [17], а также адгезию [18] и ангиогенез опухолей [17, 19], при подавлении их дифференцировки [17]. Разнообразные механизмы обусловливают распространение регуляторных влияний онкогенов более чем на 15% генома человека [18].
Однако, все разнообразные эффекты в опухолевых клетках вызывают ростовые факторы, из которых фактор роста нервов (ФРН) является наиболее хорошо изученным. Последний способствует выживаемости и развитию клеток нервной системы в тоже время обладает цитотоксическим воздействием на культурах клеток нейроэпителиальных новообразований, в том числе МБ [20]. Действие ФРН на клетках обусловлено связыванием его с рецепторами: высокоаффинным тирозинкиназным - ТгкА и низкоаффинным, содержащим домен смерти - р75 [21, 22]. Экспрессия первого из этих рецепторов на нейробластомах является маркером благоприятного прогноза у пациентов, способствуя спонтанной регрессии опухоли в менее злокачественную ганглионеврому [21, 22].
Таким образом, можно предположить наличие внутриклеточного сигнального механизма, запускаемого воздействием ФРН через ТгкА, р75 рецепторы, и включающего регуляцию амплификации е-туе-, п-туе-онкогенов в клетках МБ. Активация данного каскада, возможно, позволит снизить злокачественный потенциал опухоли и повысить ее чувствительность к химиопрепаратам. На это обстоятельство указывают данные о синергическом противоопухолевом эффекте комбинаций ФРН с химиопрепаратами по сравнению с обособленным действием цитостатических средств на клетках интракраниальных неоплазий человека [20]. Использование новых молекулярно-генетических маркеров позволит повысить уровень диагностики, дополнительно дифференцировать и индивидуализировать подход к терапии данной патологии у детей.
Целью работы являлось изучение численности копий е-туе и п-туе-онкогенов в культурах клеток МБ при воздействии ФРН и определение прогностического значения
численности копий указанных онкогенов для пациентов с данной патологией.
Материал и методы
Клиническая и гистологическая характеристика. Исследование прогностического значения онкогенов было выполнено на клетках МБ, полученных из биопсийного материала 18 пациентов (12 мальчиков и 6 девочек) в возрасте 3 мес. -17 лет (медиана - 6,5 лет). Среди 18 пациентов у 14 (77,7%) был выявлен классический тип МБ, у 3 (16,7%) - десмо-пластический, у 1 (5,6%) - нодулярный десмопластический типы неоплазии. Определение количества копий онкогенов под воздействием ФРН выполнено на культурах клеток МБ, полученных от 9 пациентов (7 мальчиков и 2 девочки) в возрасте от 6 мес до 10 лет (медиана 4,5 лет).
У всех пациентов был выявлен классический тип опухоли.
Получение первичных культур клеток МБ. Поступавший из клиники в течение 1 ч, материал в стерильных условиях ламинарного бокса (Lobconco, США) отмывали от крови, освобождали от соединительнотканных элементов в растворе Хэнкса (Sigma-Aldrich, США), содержащим 4%-ный сульфат гентамицина (Белмедпрепараты, РБ) и механически измельчали до мелких частиц. Клетки подвергали 10 мин ферментативной обработке смесью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го ЭДТА в соотношении 1:3 (Sigma-Aldrich, США) при 37°С. Действие фермента нейтрализовали внесением в чашки Петри с посевами 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США). Обработанный материал подсчитывали в камере Горяева и переносили в количестве 500 тыс. клеток/мл в чашки Петри (d=35 мм, Nunc, Дания) с 1 мл среды Игла в модификации Дульбекко фМЕМ, Sigma-Aldrich, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки медуллоб-ластомы культивировали на протяжении 2 сут в стандартных условиях СО2-инкубатора (Heraccell, США) при 37°С, 95%-ной влажности и 5% парциальном давлении СО2 [23] до достижения стадии логарифмического роста культуры, которую оценивали визуально по резко возросшему количеству митозов и численности клеток с помощью цифровой фотокамеры Altra20, снабженной программным обеспечением Analysis getlT (Olympus, Япония) на инвертированном микроскопе НУ-2Е (Carl Zeiss, Германия) при увеличении х312.
Определение цитотоксического эффекта ФРН на культурах клеток МБ. На культурах клеток МБ (находящихся в стадии логарифмического роста) тестировали ФРН в течение 1 сут, используя одну дозу (0,1 мкг/мл), эквивалентную физиологической в крови пациентов [24]. Для этого из посевов удаляли среду, добавляли 1 мл 0,25%-го трипсина с этилендиаминтетрауксусной кислотой - ЭДТА и инкубировали в течение 5 мин при 37оС. Клетки пипетировали, вносили 1-2 капли 0,2%-го раствора трипанового синего (Alta Aesar, Германия) и переносили 20 мкл суспензии в камеру Горяева (Минимед, РФ). Подсчитывали количество мертвых (окрашенных) и жизнеспособных (прозрачных) клеток в 15 больших квадратах по диагонали и определяли их соотношение [23].
Полученный эффект - степень подавления роста опухолевых клеток ФРН - был выражен индексом цитотоксично-сти - ИЦ (формула 1):
N% = (1 - Опыт/Контроль) х 100 (1)
где N% - индекс цитотоксичности ФРН,
опыт - выживаемость клеток при действии ФРН,
контроль - выживаемость клеток в контроле [25].
Фиксация культуры клеток. Посевы обрабатывали ФРН в течение одних суток. Клетки снимали 0,25%-м трипсином с ЭДТА (Sigma-Aldrich, США) в соотношении 1:3 в течение 5 мин, переносили в пробирки и центрифугировали при 1500 g 10 мин. Клеточную суспензию переносили в пробирки, куда добавляли гипотонический раствор хлорида калия (0,55%) и выдерживали 10 мин на водяной бане при 37°С, затем центрифугировали при 1500g в течение 10 мин. Супернатант отбирали, а осадок ресуспензировали в 0,5-1 мл гипотонического (0,55%) раствора хлорида калия. В пробирки с клетками вносили трехкратно по каплям охлажденный до -20°С фиксатор Карнуа, состоящий из смеси 96%-го метанола и 99,5%-ной ледяной уксусной кислоты (Sigma-Aldrich, США) в пропорции 3:1.
Определение цитогенетических аберраций методом FISH. Культуру клеток выдерживали в фиксаторе при 4°С не меньше 2 ч. Отмывали в новом охлажденном до -20°С фиксаторе Карнуа и раскапывали на стекла. Качество нанесенного материала контролировали под световым микроскопом при увеличении *100). Стекла подсушивали при комнатной температуре в течение 2-х ч в вытяжном шкафу, и переносили в термостат на 2-3 ч (при 56°С) или выдерживали при комнатной температуре в течение 2-3-х сут. Обработку РНКазой или протеиназой К не проводили. После «состаривания» стекла опускали в солевой натрий-цитрат-ный буфер (0,6M хлорида и 0,06М цитрата натрия, рН=7,2 Sigma-Aldrich, США) на 30 мин при 37°С и дегидратировали 2 мин в спиртах возрастающей крепости (70°, 80°, 96°), с последующей сушкой при комнатной температуре в течение
15-20 мин.
На стекла с фиксированными клетками в выделенный участок наносили смесь ДНК-зонда (7 мкл Vysis LSI/WSP буфера, 2 мкл воды и 1 мкл ДНК-зонда), накрывали покровным стеклом (22^22 мм) и заклеивали резиновым клеем. Для определения примерной плоидности клеток использовали зонды VysisLSI c-myc (8q24.12-q24.13) и VysisLSI n-myc (2p24), меченные флуорохромом SpectrumOrange (Abbott Molecular, США). После нанесения 0,5 мкл смеси зондов, сразу проводили денатурацию ДНК при 73оС в течение 5 мин и ставили на гибридизацию в гибридизатор (Dako, США) во влажной атмосфере при 37оС в течение
16-18 ч. По окончании гибридизации, аккуратно снимали клей с покровных стекол. Их опускали на 2 мин в прогретый до 73оС солевой раствор 0,4* натрий-цитратного буфера с добавлением 0,3% детергента нонилфенокси-полиэтоксиэ-танола - NP40 (Thermo scientific, США) на 2 мин. Стекла переносили в солевой раствор натрий-цитратного буфера (0,6 M хлорида и 0,06 М цитрата натрия, рН=7,2 Sigma-Aldrich, США) с добавлением 0,1% NP40 на 10 мин. Образцы дегидратировали 2 мин в серии спиртов возрастающей крепости (70°, 80°, 96°) и сушили при комнатной температуре 15-20 мин в темноте. На высохшие стекла в отмеченную область наносили рабочий раствор 4,6-диамино-2-фенилиндолди-гидрохлорида (DAPI, 1,5 мкг/мл), приготовленный на фос-фатно-солевом буфере, и окрашивали 10-15 мин, покрывали покровным стеклом и анализировали.
Анализ результатов. Препараты просматривали на флуоресцентном микроскопе Leica DMLB (Германия) с соответствующими флуорохромам DAPI, TexasRed, FITC-фильтра-
ми при общем увеличении 1000 (объектив ><100 масляная иммерсия; окуляры х10). Подсчитывали общее количество, но не менее 100 клеток в поле зрения, а также их численность с каждым набором (n) онкогенов. Из опухолевой ткани каждого пациента готовили не менее трех посевов. Образцы были зарегистрированы в соответствии с рекомендациями международной номенклатуры цитогенетики человека ISCN 2013 [26]. Проанализировано 108 посевов.
Статистическая обработка данных. Результаты представляли как средняя арифметическая плюс/минус стандартная ошибка средней для выборки (M±m). Для сравнения двух групп применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA one-way) и F-критерий (Фишера). В случае отклонения нормальности в независимых выборках и наличия малого количества образцов (n<30) для их сравнения использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [27].
Установление корреляционных зависимостей между двумя неродственными показателями в выборке, подчиняющимися нормальному распределению, осуществляли с использованием коэффициента ранговой корреляции Пирсона r [27, 28]. Статистическая значимость коэффициентов корреляций в выборках, подчиняющихся нормальному распределению, оценивали по критерию Стьюдента t [27, 29]. Достоверными считали различие при уровне значимости p<0,05. Для проведения описательной статистики и оценки достоверности различий между двумя группами данных использовали программу StatPlus 2005 пакета Stati^ica 6.0.
Результаты и обсуждение
Амплификация c-myc-, n-myc-онкогенов обнаружена у 4 из 18 пациентов (22,2%), страдающих МБ (два пациента с n-myc- и два с c-myc- амплификацией). Например, у пациента К. 85% клеток опухоли содержали 50-70 копий n-myc-он-когена (рис. 1А), а 70% клеток опухоли пациента Л. имели 70-80 копий c-myc-онкогена (рис. 1Б).
а б
Каждая красная точка - копия n-myc или c-myc-онкогена Рис. 1. Флуоресцентная микрофотография амплификации n-myc- у пациента К. (А) и c-myc- онкогенов у пациента Л. (Б) в клетках медуллобластомы
Не достаточно высокий (22,2%) процент амплификации онкогенов объясняется небольшой выборкой пациентов (п=18) и не анапластическим типом МБ, где встречаемость данных онкогенов достигает 50% и выше [10]. Однако, сопоставление результатов по общей выживаемости (pOS, %)
пациентов, страдающих МБ, в клетках которой наблюдали увеличение (по сравнению с диплоидным набором) или отсутствие изменений численности копий (клетки содержали 2п копий онкогенов) выявило статистически значимые (р=0,0004) отличия по данному показателю (рис. 2).
Рис. 2. Общая выживаемость (pOS) пациентов с медуллобластомой в группах с или без увеличения (амплификации) численности копий с-тус-, п-тус-онкогенов
Наличие амплификации и данные по общей выживаемости
у пациентов с МБ (рис. 2) свидетельствуют о высокой корреляции между указанными изменениями и эффективностью терапии данного контингента детей, поскольку общая выживаемость у пациентов с наличием амплификации составляет - 0%, а у пациентов без амплификации - 68%.
Это позволяет рекомендовать оценку амплификации с-тус-, п-тус-онкогенов у пациентов с МБ, выполненную ^^Н анализом, в качестве молекулярно-генетического критерия (маркера) прогнозирования терапии.
На следующем этапе оценивали индекс цитотоксичности ФРН на культурах клеток МБ (табл. 1).
Таблица 1.
Индекс цитотоксичности ФРН на клетках медуллобластомы
Пациент, номер истории Индекс цитотоксичности, %
15348 53,4±3,6
3396 51,3±4,5
1731 49,6±3,4
2289 36,2±5,6
15923 27,0±3,3
20595 50,7±13,6
29346 60,3±3,5
53 46,3±3,7
30192 32,4±5,6
Средний ИЦ 44,9±2,6
Затем изучали изменение численности копий с-тус- и п-тус-онкогенов в клетках МБ при воздействии ФРН (рис. 3, 4).
Рис. 3. Изменение численности клеток медуллобластомы, содержащих двух-восьми-кратное количество копий n-myc-он-когена при воздействии ФРН
Здесь и на рис. 4: V обозначены статистически значимые (p<0,05) отличия численности копий онкогена при воздействии ФРН от контроля для каждого набора копий
80
S 70
Ï 60
о
О) so
Т
3£
П 40
m
1- и 30
(1)
S 70
и 10
0
fiS. SV
*
m 35.9
2 ' >¿,4 1 16,4V 16,4V
É Зг'Г 1
й it1 l1iv i i ■ i i i
2п
Зп
4п
5п
6п
7п
8п
Число копий онкогена с-тус
■ контроль -ФРН
Рис. 4. Изменение численности клеток медуллобластомы, содержащих двух-восьми-кратное количество копий c-myc-он-когена при воздействии ФРН
Изменения численности копий онкогенов в культурах клетках МБ под влиянием ФРН были представлены тремя вариантами ответов:
1) снижение (р<0,05) на 72,7±17,4% численности клеток опухоли,
содержащих 6-, 8 п-копий п-тус-онкогена и на 63,4±26,6% численности клеток, содержащих 3-, 8п-копий с-тус-онко-
гена, причем воздействие ФРН нивелировало до нуля их количество с восьмью копиями обеих онкогенов;
2) возрастание (р<0,05) на 78,8±12,7% количества опухолевых клеток,
содержащих 2п набор копий обоих онкогенов и 4-,5п копий с-тус-онкогена;
3) отсутствие статистически значимых изменений численности опухолевых клеток, содержащих 3-, 4-, 5-, 7п-копий п-туе-онкогена.
Таким образом, данные на рис. 3 и 4 показывают, что воздействие ФРН на культуры клеток МБ статистически значимо (р<0,05) снижало численность клеток, содержащих 6-,
Средняя численность копий п-туе-, е-туе-онкоге
8п копий п-туе-онкогена и 3-, 8п копий е-туе-онкогена, но вместе с тем увеличивало (р<0,05) численность клеток, содержащих диплоидный набор обоих онкогенов.
Далее рассчитывали среднее количество копий е-туе-, п-туе-онкогенов в клетках МБ при воздействии ФРН (табл. 2).
Таблица 2.
в в клетках медуллобластомы при воздействии ФРН
Серия Количество клеток, содержащих 2-8 копий онкогенов, % Среднее
опыта 2n 3n 4n 5n 6n 7n 8n число копий
Контроль 39,9±15,1 13,7±4,3 12,3±4,2 11,0±1,5 12,8±2,5 1,8±0,3 6,7±1,3 2,7±0,3
п-туе
Контроль 32,6±4,8 22,4±3,8 8,0±3,9 1,0±0,2 - - 35,9±15,2 2,9±0,4
е-туе
ФРН, 61,4±5,0* 8,9±2,6 11,2±4,8 10,7±3,8 7,0±2,2* 0,8±0,1 2,5±0,2
п-туе
ФРН, е-туе 65,5±3,2* 16,4±2,8* 16,4±4,3* 1,6±0,3* - - 2,3±0,07*
Примечание. Среднее количество копий онкогенов определяли для каждого пациента как отношение суммы произведений численности клеток, содержащих конкретный набор онкогена на число копий онкогена к 100% клеток в каждой серии. Знаком * обозначены статистически значимые (р<0,05) отличия количества копий онкогенов при воздействии ФРН от числа копий онкогенов в контроле
Таблица 3.
Коэффициент корреляции (г) между средним количеством копий е-туе-, п-туе-онкогенов в клетках медуллобластомы и индексом цитотоксичности ФРН, гибелью клеток в контроле
Результаты исследования поставили вопрос: как чувствительность клеток МБ зависит от среднего количества копий онкогенов? Для этого рассчитывали коэффициенты корреляции между средним количеством копий онкогенов и ИЦ фактора роста нервов (табл. 3).
Серия опыта df Онкоген Индекс цито-ток-сичности, гибель, %
n-myc c-myc
среднее количество копий корреляция,г среднее количество копий корреляция,г
Контроль 7 2,7±0,3 0,27 2,9±0,4 0,03 22,1±2,0
Фактор роста нервов 7 2,5±0,2 -0,33 2,3±0,07^ -0,65 p<0,0001 44,9±2,6V
Примечание. Жирным шрифтом обозначены статистически значимые (р<0,05) значения коэффициента корреляции г при степенях свободы df=n-2. Символом V обозначены статистически значимые отличия от контроля при р<0,05.
Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о наличии статистически значимой (р<0,0001) отрицательной корреляции (г=-0,65) между средним числом копий с-туе-онкогена и ИЦ фактора роста нервов. Этот факт доказывает участие е-туе-онкогена в изменении чувствительности клеток опухоли к ФРН.
Таким образом, воздействие ФРН на культуры клеток МБ статистически значимо снижало (р<0,05) численность клеток, содержащих 6-, 8п копий п-туе-онкогена и 3-, 8п копий е-туе-онкогена, но вместе с тем увеличивало численность клеток, содержащих диплоидный набор обоих онкогенов. Установлена статистически значимая отрицательная корреляция между средним количеством копий е-туе-онкогена в клетках опухоли и ИЦ фактора роста нервов, показывает, что наличие онкогена в клетках опухоли повышает их резистентность к ростовому фактору.
Результаты автора подтверждаются данными других исследователей, показывающих взаимосвязь между изменением экспрессии ТгкА, р75 рецепторов и е-туе-, п-туе-онкогенов в клетках нейробластомы и их химио-
чувствительности. Обнаружено подавление экспрессии ТгкА-рецептора на клетках нейробластомы клонов LA1-15^ SMS-KCNR с п-туе-амплификацией [30, 31]. Экспозиция указанных клеточных линий с ФРН в течение 1 ч и 1 сут ингибирует на 50-60% и 80% экспрессию п-туе-он-когена через ТгкА рецептор, протеинкиназа Б/Ras сигнальный путь (AKT/PKB/Ras), киназу локальной адгезии (pp125FAK), активируемую митогеном протеинкиназу (МАРК), циклин-Е2-киназу, ингибитор циклин-зависимой киназы (р27Ыр1) и транскрипционный фактор E2F [31, 32]. Данный факт подтверждается тем, что экспрессия ТгкА рецептора у четырех пациентов с нейробластомой, содержащих п-туе-амплификацию, коррелировала с благоприятным клиническим прогнозом и безрецидивной продолжительностью жизни до 31-го месяца [30, 33]. Однако, сверхэкспрессия ТгкА рецептора на нейробластомах подавляет агрессивный рост опухолей даже с п-туе-амплификацией [30].
Предполагается воздействие ФРН на туе-онкогены и по другому механизму. ФРН через рецептор и МАР-2 активирует транскрипционный фактор КтрреЬподобный
фактор-7 (KLF-7), запускающий аутофагию и дифференци-ровку клеток крысиной феохромоцитомы PC12 [34]. Аналогичный тип гибели констатирован для клеток МБ [35]. Вместе с тем экспрессия KLF-7 усиливает синтез белков cip/kip семейства ингибиторов циклин-зависимых киназ р2^а£/ cip и p27/cip1 [34] в коре мозга и гиппокампе. Именно эти ингибиторы подавляются влиянием c-myc-онкогена [17]. Таким образом, можно предположить, что ФРН через TrkA рецептор, ингибиторы p21waf/cip и KLF-7 будет снижать активность c-myc-онкогена, стимулируя дифференцировку или аутофагию клеток МБ.
Вместе с тем констатируется отсутствие зависимости между активацией c-myc-онкогена в МБ и его амплификацией (копийностью), которые реализуются через различные, пока не изученные механизмы [36].
Выводы.
1. Полученные результаты свидетельствуют о достаточно высокой выявляемости амплификации семейства myc (22,2%) и высоком прогностическом значении у пациентов с медуллобластомой. Наличие амплификации и данные по общей выживаемости у пациентов с медуллобластомой свидетельствуют о высокой корреляции между данными изменениями в опухолевых клетках и эффективностью терапии данного контингента детей. Так, общая выживаемость у пациентов с наличием амплификации составляет 0%, а у пациентов без амплификации - 68% (р<0,0004). Это позволяет рекомендовать оценку амплификации с-тус, n-тус-онконе-нов у пациентов с медуллобластомой, выполненную i-FISH анализом, в качестве молекулярно-генетического критерия (маркера) прогнозирования терапии.
2. Применение ФРН снижало (p<0,05) на 72,7±17,4% численность клеток МБ, содержащих шесть-, восьмь-копий n-myc-онкогена и на 63,4±26,6% количества клеток, содержащих три-, восемь копий c-myc-онкогена, но вместе с тем увеличивало (p<0,05) на 78,8±12,7% численность опухолевых клеток, содержащих двойной набор копий обоих онкогенов. Этот факт указывает на то, что ФРН снижает количество клеток с аномальным числом копий онкогенов и увеличивает их численность с нормальным (двойным) набором онкогенов, модулируя тем самым численность копий онкогенов в культурах клеток опухоли.
3. Установлена статистически значимая (p<0,0001) отрицательная корреляция (r=-0,65, df=7) между средним числом копий с-myc-онкогена в клетках МБ и ИЦ фактора роста нервов, воздействующего на них, что документирует участие с-myc-онкогена в снижении чувствительности опухолевых клеток к ростовому фактору.
Автор выражает благодарность Надежде Александровне Соколовой - биологу, научному сотруднику лаборатории цитогенетики РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь за помощь в проведении экспериментов.
Литература
1. Crawford J.R., MacDonald T.J., Packer R.J. Medulloblafloma in childhood: new biological advances // Lancet Neurol. 2007, Vol. 6, № 12, P. 1073-85.
2. Carlotti C.G. Jr., Smith C., Rutka J.T. The molecular genetics of medulloblafloma: an assessment of new therapeutic targets // Neurosurg. Rev. 2008, Vol. 31, № 4, P. 359-368.
3. Pizer B.L., Clifford S.C. The potential impact of tumour biology on improved clinical practice for medulloblafloma:
progress towards biologically driven clinical trials // Br. J. Neurosurg. 2009, Vol. 23, № 4, P. 364-375.
4. Packer R.J., Cogen P., Vezina G., Rorke L.B. Medulloblafloma: clinical and biologic aspects // Neurooncol. 1999, Vol. 1, № 3, P. 232-250.
5. Pfizer S., Remke M., Benner A. et al. Outcome prediction in pediatric medulloblafloma based on DNA copy-number aberrations of chromosomes 6q and 17q and the MYC and MYCN loci // J. Clin. Oncol. 2009, Vol. 27, № 10, P. 16271636.
6. Lamont J.M., McManamy C.S., Pearson A.D. et al. Combined hiflopathological and molecular cytogenetic Gratification of medulloblafloma patients // Clin. Cancer Res.
2004, Vol. 10, № 16, P. 5482-5493.
7. Pan E., Pellarin M., Holmes E. et al. Isochromosome 17q is a negative prognoflic factor in poor-risk childhood medulloblafloma patients // Clin. Cancer Res. 2005, Vol. 11, № 13, P. 4733-4740.
8. Lo K.C., Ma C., Bundy B.N. et al. Gain of 1q is a potential univariate negative prognoflic marker for survival in medulloblafloma // Clin. Cancer Res. 2007, Vol. 13, № 23, P. 7022-7028.
9. Friedrich C. von Bueren A.O., von Hoff K. et al. Treatment of adult nonmetaflatic medulloblafloma patients according to the paediatric HIT 2000 protocol : a prospective observational multicentre fludy // Eur. J. Cancer. 2012, Vol. 49, № 12, P. 893-903.
10. Sandberg A. A., Stone J. F. Medulloblafloma, primitive neuroectodermal tumors, and pineal tumors // The Genetics and molecular biology of neural tumors.- Totowa, New York : Humana Press, 2008, Ch. 8, P. 343-430.
11. Kool M., Kofler J., Bunt J. et al. Integrated genomics identifies five medulloblafloma subtypes with diflinct genetic profiles, pathway signatures and clinicopathological features // PLoS One. 2008, Vol. 3, 8: e3088.
12. Rutkowski S., von Bueren A., Hoff K. et al. Prognoflic relevance of clinical and biological risk factors in childhood medulloblafloma : results of patients treated in the prospective multicenter trail HIT91 // Clin. Cancer Res. 2007, Vol. 13, № 9, P. 2651-2657.
13. Monje M., Beachy P.A., Fisher P.G. Hedgehogs, filies, Wnta and mycs : the time has come for many things in medulloblafloma // J. of Clin. Oncol. 2011, Vol. 29, № 11, P. 1395-1398.
14. Bomken S., Davies B., Chong L. et al. Percentage tumor necrosis following chemotherapy in neuroblafloma correlates with MYCN flatus but not survival // Pediatr. Hematol. Oncol. 2011, Vol. 28, № 2, P. 106-114.
15. Свирновский А. И., Пасюков В. В. Молекулярные основы феномена химио- и радиорезистентности при опухолевых процессах // Мед. новости. 2007, № 11, С. 7-19.
16. von Bueren A. O., Oehler C., Shalaby T. et al. c-MYC expression sensitizes medulloblafloma cells to radio- and chemotherapy and has no impact on response in medulloblafloma patients // BMC Cancer. 2011, Vol. 11: 74.
17. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D. et al. Cancer therapeutics: targeting the dark side of myc // Eur. J. Cancer.
2005, Vol. 41, № 16, P. 2485-2501.
18. Ryan S. L., Schwalbe E.C., Cole M. et al. MYC family amplification and clinical risk-factors interact to predict an extremely poor prognosis in childhood medulloblafloma // Acta Neuropathology 2012, Vol. 123, № 4, P. 501-513. Shalaby
T., von Bueren A.O., Hurlimann M.L. et al. Disabling c-MYC in childhood medullobla^oma and atypical teratoid/rhabdoid tumor cells by the potent G-quadruplex interactive agent S2T1-6OTD // Mol. Cancer Ther. 2010, Vol. 9, № 1, P. 167-179.
19. Чернов А.Н., Талабаев М.В., Конопля Н.Е. и др. Влияние химиопрепаратов и фактора роста нервов на выживаемость клеток первичной культуры нейроэпителиальных опухолей // Весщ Нац. aкад. навук Беларусь Серыя мед. на-вук. 2013, № 1, С. 46-51.
20. Nakagawara A. Trk receptor tyrosine kinases: a bridge between cancer and neural development // Cancer Lett. 2001, Vol. 169, № 2, P. 107-114.
21. Tacconelli A., Farina AR., Cappabianca L. et al. TrkA alternative splicing: a regulated tumor-promoting switch in human neurobla^oma // Cancer Cell. 2004, Vol. 6, № 4, P. 347-360.
22. Божкова В. П. Брежестовский П.Д., Буравлев В.П. и др. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы. под ред.: Б. П. Вепринцева, И. В. Викторова, Б. Я. Вильнера. - М.: Наука, 1988. - 318 с.
24. Калюнов В. Н. Фактор роста нервной ткани. - Мн.: Наука и техника, 1984. - 216 с.
25. Миронов А. Н., Бунатян Н.Н., Васильева А.Н. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Под ред.: Муляра А. Г., Чиченкова О. Н. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
26. Zitterbart K., Filkova H., Tomasikova L. et al. Low-level copy number changes of myc genes have a progno^ic impact in medullobla^oma // J. Neurooncol. 2011, Vol. 102, № 1, P. 25-33.
27. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М. : Практика, 1999. - 459 с.
28. Свирновский А. И., Шман Т. В., Сергиенко Т. Ф. и др. Корреляция между чувствительностью к химиотерапев-тическим препаратам опухолевых лимфоидных клеток in
vitro // Гематология и трансфузиология. 2007, Т. 52, № 5, C. 26-31.
29. van Belle G., Fisher L., Heagertyet P. et al. Bio&ati&ics : a methodology for the helth sciences eds: L. D. Fisher, G. van Belle. - Canada: Jonh Wiley and Sons Inc., 2004. -889 p.
30. Nakagawara A., Brodeur G. M. Role of neurotrophins and their receptors in human neurobla^omas: a primary culture sftudy. Europ. J. Cancer 1997; 33 (12): 2050-2053.
31. Woo C.W., Lucarelli E., Thiele C. J. NGF activation of TrkA decreases N-myc expression via MAPK path leading to a decrease in neurobla^oma cell number // Oncogene. 2004, Vol. 23, № 8, P. 1522-1530.
32. Свирновский А. И., Григорович С. А. Плейотроп-ная резистентность опухолевых клеток к терапевтическим воздействиям при В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях // Мед. новости. 2005, № 9, С. 5-16.
33. Shimada H., Nakagawa A., Peters J. et al. TrkA expression in peripheral neurobla^ic tumors: progno^ic significance and biological relevance // Cancer 2004, Vol. 101, № 8, P. 1873-1881.
34. Caiazzo M., Colucci-D'Amato L., Esposito M.T. et al. Transcription factor KLF7 regulates differentiation of neuroectodermal and mesodermal cell lineages. Exp. Cell Res. 2010, Vol. 316, № 14, P. 2365-2376.
35. Li C., Macdonald J.I., Hryciw T. et al. Nerve growth factor activation of the TrkA receptor induces cell death, by macropinocytosis, in medullobla^oma Daoy cells// J. Neurochem. 2010, Vol. 112, № 4, P. 882-899.
36. Rutkowski S., von Bueren A., von Hoff K. et al. Progno^ic relevance of clinical and biological risk factors in childhood medullobla^oma: results of patients treated in the prospective multicenter trail HIT91 // Clin. Cancer Res. 2007, Vol. 13, № 9, P. 2651-2657.
