CC BY
10ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕСИИ СООТНОШЕНИЕ РЕЦЕПТОРОВ TRKA И Р75 НА КЛЕТКАХ НЕЙРОЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ - НОВАЯ МИШЕНЬ ВОЗДЕЙСТВИЯ КОМБИНАЦИЙ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ С ЦИСПЛАТИНОМ
ИЛИ ТЕМОЗОЛОМИДОМ
А. Н. Чернов
Научный сотрудник лаборатории нейрофизиологии ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси», Минск,
Республика Беларусь,
THE CHANGES IN THE EXPRESSION AND RATIO OF TRKA AND P75 RECEPTORS ON THE CELL NEUROEPITHELIAL TUMORS - A NEW TARGET EFFECT OF NERVE GROWTH FACTOR WITH CISPLATIN AND TEMOZOLOMIDE AND THE COMBINATIONS
А. N. Chernov Scientific researcher of Laboratory of Neurophysiology, Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Belarus, Minsk, the Republic of Belarus
АННОТАЦИЯ
Изучено изменение экспрессии и соотношения рецепторов фактора роста нервов TrkA и p75 на культурах клеток анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы человека под воздействием фактора роста нервов (ФРН) и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом. Установлено, что экспрессия и соотношение рецепторов зависят от типа опухоли и механизма действия реагентов. Экспрессия и соотношение рецепторов TrkA и p75 взаимосвязана с чувствительностью клеток анапластической астроцитомы и глиобластомы к ФРН и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом.
ABSTRACT
The change of expression of TrkA and p75 receptors and their ratio on the human anaplastic astrocytoma, glioblastoma and medulloblastoma cell cultures exposed to nerve growth factor (NGF) and its combination with cisplatin or temozolomide was established. It is found that the expression of the receptors and the relationship depends on the tumor type and reagents' mechanism of action. Expression of TrkA and p75 receptors and their ratio correlated with sensitivity of anaplastic astrocytoma and glioblastoma cells to NGF and its combination with cisplatin or temozolomide.
Ключевые слова: фактор роста нервов, комбинация фактора роста нервов с цисплатином или темозоломидом, рецепторы TrkA, p75, соотношение рецепторов, индекс цитотоксичности, корреляции
Key words: nerve growth factor, combination of nerve growth factor with cisplatin, or temozolomide, TrkA, p75 receptors, the ratio receptors, index of cytotoxicity, correlations
Постановка проблемы.
В настоящее время злокачественные новообразования по распространенности, инвалидизации и смертности вышли на второе место вслед за патологией сердечно-сосудистой системы [20]. У детей и подростков интракра-ниальные неоплазии по распространенности занимают второе место после лейкозов, представляя собой гетерогенную по гистологическим типам группу. К наиболее злокачественным опухолям относятся медуллобласто-мы, нейробластомы, глиобластомы и анапластические астроцитомы [7, 26]. Прогноз для этих пациентов крайне неблагоприятный. Общая 5-летняя выживаемость составляет менее 50-60% после хирургического вмешательства, дополняемого лучевой и химиотерапией [5, 11, 23]. Общеизвестным является тяжелые токсические последствия химиотерапии на организм пациента. Это делает актуальным поиск новых подходов и стратегий терапии опухолей мозга - антиангиогенная, соно-фотодинамиче-ская и таргетная терапии [2, 8]. Последняя подразумевает поиск новых эффективных соединений, а также мишеней их воздействия на опухолевых клетках [2]. Среди таких соединений перспективным выглядит класс эндогенных биорегуляторов полифункциональной природы - ростовых факторов, которых к настоящему времени открыто более 80 [29]. Наиболее хорошо изучен фактор роста нервов - ФРН, способствующий выживаемости и развитию клеток центральной нервной системы, в тоже время вы-
зывающий ингибирование ангиогенеза, инвазии опухолей [4; 30]. Обнаружено, что ФРН обладает цитотоксическим противоопухолевым эффектом на культурах клеток ин-тракраниальных неоплазий, который может усиливаться при комбинированном его применении совместно с хи-миопрепаратами [9]. Поскольку химиотерапия опухолей мозга в клинике проводится с применением темозоломида и препаратов платиновой группы (цисплатина, карбопла-тина и т.д.) [5, 10, 20, 33]. то для сочетания с ФРН автором были выбраны указанные химиопрепараты. Доказано, что ФРН реализует свои эффекты на клетках через связывание с рецепторами - высокоаффинным тирозинкиназным - ТгкА, и низкоаффинным, содержащим домен смерти -р75 [24, 27, 30]. Экспрессия первого из этих рецепторов на нейробластомах является маркером благоприятного прогноза у данных пациентов, способствуя спонтанной регрессии опухоли в менее злокачественную ганглионев-рому [12, 13, 17, 27, 30].
Остается не изученным могут ли рецепторы ТгкА и р75 на клетках анапластической астроцитомы, глиобласто-мы и медуллобластомы являться мишенями воздействия комбинаций ФРН с цисплатином или темозоломидом?
Цель - изучить экспрессию, соотношение ТгкА, р75 рецепторов на клетках анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы и установить их взаимосвязь с чувствительностью клеток опухолей к ФРН и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом.
Материал и методы.
Пациенты. Исследование выполнено на 19 пациентах в возрасте от1 до 16 лет (медиана 8 лет), страдающих ана-пластической астроцитомой (n=5), глиобластомой (n=7) и медуллобластомой (n=7) и находящихся на лечении в детском нейрохирургическом отделении Городской клинической больницы скорой медицинской помощи г Минска в 2010- 2012 гг.
Первичная культура клеток нейроэпителиальных опухолей. Поступавший из клиники в течение 1 ч, материал в стерильных условиях ламинарного бока (Lobconco, США) отмывали от крови, освобождали от соединительнотканных элементов в растворе Хэнкса (Sigma-Aldrich, США), содержащим 4%-ный сульфат гентамицина (Белмедпре-параты, РБ) и механически измельчали до мелких частиц. Клетки подвергали 10 мин ферментативной обработке смесью 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го ЭДТА в соотношении 1:3 (Sigma-Aldrich, США) при 37°С. Действие фермента нейтрализовали внесением в чашки Петри с посевами 1 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США). Обработанный материал подсчитывали в камере Горяева (Минимед, РФ) и переносили в количестве 500 тыс. клеток/мл в чашки Петри (d=35 мм, Nunc, Дания) с 1 мл среды Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки опухолей культивировали на протяжении 2 сут в стандартных условиях СО2-инкуба-тора (Heraccell, США) при 37°С, 95%-ной влажности и 5% парциальном давлении СО2 [1, 16].
Индекс цитотоксичности реагентов. На культурах опухолей тестировали цисплатин (Veropharm, РФ) в дозе of 3,3x10-6 M (1 мкг/мл), темозоломид (Orion Pharma, Финляндия) в дозе 10,3x10-6 M (2 мкг/мл), 7S форму рекомби-нантного фактора роста нервов человека (Sigma-Aldrich, USA) в дозе 8,8x10-9 M (0,1 мкг/мл) и комбинации ФРН с 10-кратно сниженной концентрацией цисплатина или темозоломида (цисплатин 3,3x10-7 (0,1 мкг/мл), темозоло-мид - 10,3x10-7 M (0,2 мкг/мл), соответственно). Внесение реагентов проводили на стадии логарифмического роста культур, достижение которой оценивали визуально по резко возросшему количеству митозов и численности клеток с помощью цифровой фотокамеры Altra20, снабженной программным обеспечением Analysis getlT (Olympus, Япония) на инвертированном микроскопе НУ-2Е (Carl Zeiss, Германия) при увеличении x312 [9]. Оценку ИЦ тестируемых соединений проводили спустя 1 сут после экспозиции опухолевых культур с реагентами. Для этого оценивали чувствительность образцов неоплазий к реагентам на основе изучения гибели клеток, визуализируемой по поглощению 0,2%-го раствора трипанового синего (Alta Aesar, Германия) в камере Горяева. Из посевов удаляли среду, добавляли 1 мл 0,25%-го трипсина с ЭДТА и инкубировали в течение 5 мин при 37оС. Клетки пипети-ровали, вносили 1-2 капли 0,2%-го раствора трипанового синего и переносили 20 мкл суспензии в камеру Горяева.
Подсчитывали количество мертвых (окрашенных) и жизнеспособных (прозрачных) клеток в 15 больших квадратах по диагонали и определяли их соотношение [1]. Полученный эффект - степень подавления роста опухоле-
вых клеток химиопрепаратом [6] - был выражен индексом цитотоксичности - ИЦ (формула 1): N% = (1 - Опыт/Контроль) х 100 (1) где N% - индекс цитотоксичности препаратов, опыт - выживаемость клеток при действии химиопре-паратов, ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами, контроль - выживаемость клеток в контроле [6]. Иммунофлуоресценция. Выявление TrkA, р75 рецепторов выполнено на первичных культурах, полученных от пациентов с анапластической астроцитомой, глиобласто-мой и медуллобластомой. В каждую чашку Петри, по истечении двух суток роста культур, наносили ФРН либо его комбинации с 10-кратно сниженными концентрациями цисплатина или темозоломида. Спустя сутки среду удаляли и посевы пятикратно промывали ФСБ (145 мМ хлорида, 7,3 мМ гидрофосфата и 2,7 мМ дигидро-фосфата натрия, рН=7,2), содержащим 1% бычьего сывороточного альбумина, 4% козьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) и 0,2%-го тритона Х-100. На образцы наносили первичные моно-клональные антитела к рецепторам фактора роста нервов: Anti-TrkA (SAB4902032, Sigma-Aldrich, США) и Апй-р75 (Pan-NGFR, Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:100. Указанные антитела разводили ФСБ на 0,3%-м тритоне Х-100. Клетки с антителами инкубировали в течение 24 ч при 4°С. После трехкратной промывки ФСБ, культуры подвергали воздействию вторичных кроличьих FITC-конъюгирован-ных антител: Anti-Rabit Ig-FITC (Sigma-Aldrich, США) в разведении 1:1000 и выдерживали в темноте на протяжении 2 ч при комнатной температуре [19]. После инкубации посевы три раза отмывали от избытка реагентов и просматривали под флуоресцентным микроскопом Leitz MPV-2 (Германия) с цифровой камерой Leica DC350F (Германия) с возбуждающим 330-390 нм
и эмиссионным 455-700 нм фильтрами L2, экспозицией 690 мс, усилением G1 при увеличении объектива '16. Делали калибровку для данного объектива и переводили пиксели в мкм. Применяя компьютерную программу ImageJ (версия 1.45r), оценивали:
1) процентное соотношение флуоресцирующих клеток к их общему количеству в пяти полях зрения для каждого образца;
2) интенсивность флуоресценции (пиксел/мкм2) в расчете на одну клетку;
3) используя эти показатели, рассчитывали соотношение TrkA/p75-рецепторов.
Определяли корреляции между соотношением TrkA/ р75-рецепторов и ИЦ ФРН, его комбинации с химиопрепаратами на клетки опухолей. Проанализировано п=800 посевов.
Статистическая обработка данных. Каждый эксперимент проводили не менее чем в трех (три-пять) независимых повторах. Результаты представляли как средняя арифметическая плюс/минус стандартная ошибка среднего для выборки объема n (M±m). Для сравнения двух групп со сравнительно большим объемом выборки (n>50) по выраженности количественных признаков применяли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA one-way) и F-критерий (Фишера) [31]. Предварительно каждую выборку проверяли на нормальность (распределение Гаусса)
по критерию Колмогорова-Смирнова/Лиллифора и на однородность дисперсий по F критерию. Вариабельность признаков оценивали по величине стандартного квадра-тического отклонения (а «сигма»).
Применяя двухфакторный дисперсионный анализ без повторений (ANOVA two-way), рассчитывали уровни значимости для зависимости экспрессии
TrkA, р75 рецепторов, их соотношения от типа опухоли, механизма действия ФРН и его комбинаций с химиопре-паратами.
Установление корреляционных зависимостей между двумя неродственными показателями в выборке, подчиняющимися нормальному распределению, осуществляли с использованием коэффициента ранговой корреляции
Пирсона r [3, 31]. Статистическая значимость коэффи-
Индекс цитотоксичности (%) химиопрепаратов, фактора воздействии на клетки интракраниальных опухолей
циентов корреляции
в выборках, подчиняющихся нормальному распределению, оценивали по критерию Стьюдента 1 [3, 31]. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р<0,05. Для проведения описательной статистики и оценки статистической значимости различий между двумя группами данных использовали программу 81а1Р1и8 2005 пакета 81аЙ811еа 6.0. Результаты и обсуждение.
На первом этапе оценивали ИЦ реагентов и их комбинаций при воздействии на культуры опухолевых клеток. Для этого ИЦ фактора роста нервов и его комбинаций с химиопрепаратами сравнивали с обособленным действием химиопрепаратов (таблица 1).
Таблица 1
роста нервов и его комбинаций с химиопрепаратами при
Реагент Индекс цитотоксичности, %
анапластическая астро-цитома глиобластома медуллобластома
Цисплатин 53,3±6,4 46,9±4,8 47,5±5,1
Темозоломид 46,0±5,4 40,0±5,6 36,5±3,3
Фактор роста нервов 55,8±5,4 48,2±4,7 37,4±3,2
ФРН + цисплатин 84,7±3,6* 43,2±4,2 47,3±2,6*
ФРН + темозоломид 52,4±9,0 41,2±6,4 52,2±5,9*
Примечание * обозначает статистически значимые (р<0.05) отличия ИЦ комбинаций реагентов от обособленного действия фактора роста нервов
Данные таблицы 1 показывают, что цитотоксическое действие комбинации ФРН + цисплатин было выше (р<0.05) индивидуального эффекта ФРН на культурах клеток анапластической астроцитомы и медуллобластомы. Противоопухолевый эффект комбинации ФРН + темозо-ломид был выше (р<0.05) действия ФРН на клетках ме-дуллобластомы. Эффективность ФРН была сопоставима с цитотоксическим действием химиопрепаратов на клетках всех тестируемых опухолей.
Аддитивный эффект комбинации реагентов на культурах неопластических клеток поставил вопрос: могут ли рецепторы ФРН - ТгкА и р75 являться мишенями ком-
бинаций ростового фактора с химиопрепаратами? Как изменяется экспрессия рецепторов на опухолевых клетоках при воздействии комбинаций ФРН с цисплатином или темозоломидом? Определяли количество неопластических клеток, экспрессирующих ТгкА и р75 рецепторы под воздействием ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом.
С целью изучения экспрессии ТгкА и р75 рецепторов и их соотношения ТгкА/р75, на опухолевые клетки наносили антитела к рецепторам и реагенты, определяя интенсивность ИТС-флуоресценции рецепторов в пересчете на одну клетку (рисунки 1, 2).
-9271,2
Ж 12*,зЛ HÜ
392,2 457,5
_■
ФРН, МБФРН+ темозоломид, МБФРН, ГБ ФРН+ цисплатФрНГБтемозоломид, АА
TrkA p75
О
Рисунок 1. Серии экспериментов, где в опухолевых клетках преобладала интенсивность ИТС-флуоресценции антител к р75 рецепторам (группа «р75») Символом х обозначены статистически значимые (р<0,05) отличия интенсивности флуоресценции ТгкА рецептора от р75 в пределах одной серии
-8-
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
345в,8х
L14J3
439,7« т 473,4х -г- 24 8 S
ИТ.,.. ^ШУ/уа
ФРН,АА ФРН+ ФРН + ФРН +
цисплатин, АД темозоломид цисплатин,
ГБ МБ
■ ТгкА -к р75
Рисунок 2. Серии экспериментов, где в опухолевых клетках преобладала интенсивность ШТС-флуоресценции антител к ТгкА рецепторам (группа «ТгкА») Символом х обозначены статистически значимые (р<0,05) отличия интенсивности флуоресценции ТгкА рецептора от р75 в пределах одной серии
Анализ результатов позволил распределить серии экспериментов при воздействии ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом по двум группам, в каждой из которых статистически значимо (р<0,05) преобладала экспрессия ТгкА или р75 рецепторов (рисунки 1 и 2).
К группе «р75» (рисунок 1) были отнесены 5 серий опытов (в каждой из которых на клетки одного типа опухоли воздействовали одним из реагентов): при воздействии ФРН и комбинации ФРН + темозоломид на клетки медул-лобластомы; ФРН, комбинации ФРН + цисплатин на клетки глиобластомы; ФРН + темозоломид на клетки анапла-стической астроцитомы.
К группе «ТгкА» (рисунок 2) - четыре серии: при воздействии комбинации ФРН + цисплатин на клетки медул-лобластомы, комбинации ФРН + темозоломид на клетки глиобластомы; ФРН, комбинации ФРН + цисплатин на клетки анапластической астроцитомы.
Из данных на рисунках 1 и 2 видно, что экспрессия ТгкА рецептора в пределах каждой серии статистически значимо (р<0,05) отличалась от таковой для р75 рецептора. Исключение составили серии при применении комбинации
ФРН + цисплатин на клетки глиобластомы и ФРН + темо-золомид на клетки анапластической астроцитомы.
Следует обратить внимание, что в пределах одной серии все пациенты с одним типом опухоли относились к одной группе («ТгкА» или «р75»), то есть для всех пациентов было характерно преобладание экспрессии одного типа рецепторов. Тогда как клетки тех же пациентов (с указанным типом опухоли) под действием другого реагента (в другой серии) проявляли доминирование другого типа рецепторов для всех лиц. Например, все исследуемые пациенты (п=7), страдающих медуллобластомой, при воздействии ФРН и комбинации ФРН + темозоломид были отнесены к группе «р75», а при воздействии ФРН + цисплатин все указанные пациенты были отнесены к группе «ТгкА». Такое доминирование того или иного типа рецепторов в каждой серии опытов связано с механизмом действия реагентов и зависит от типа опухоли. Необходимо отметить, что экспрессия р75 рецепторов статистически значимо (р<0,05) отличалась от ТгкА рецепторов как внутри каждой из указанных групп («ТгкА», «р75»), так и между ними (таблица 2).
Таблица 2.
Зависимость экспрессии ТгкА, р75 рецепторов и их соотношения от типа опухоли и механизма действия реагентов
Зависимость экспрессии ТгкА, р75 рецепторов и их соотношения Реагент
все реагенты ФРН ФРН + цисплатин ФРН + темозоломид
От типа опухоли, уровень значимости р 2,0x10-11(90) 0,0028(18) 0,011(18) 0,52(18)
тип опухоли
От механизма действия реагента, уровень значимости р все типы анапластиче ская астроцитома глиобластома медуллобластома
1,1 х10-23(90) 0,00074(25) 1,0x10-18(30) 5,8 х10-9(30)
Примечание - Жирным шрифтом обозначены статистически значимые значения уровня значимости р<0,05. В скобках - число степеней свободы для образцов опухолей пациентов, подвергнутых воздействию фактора роста нервов и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом. Цифры в столбцах отражают уровень значимости р.
В группе «р75» преобладала экспрессия рецептора р75, которая была статистически значимо (р=0,001) выше экспрессии в группе «ТгкА, и, наоборот.
Методом двухфакторного дисперсионного анализа установлена зависимость экспрессии ТгкА, р75 рецепторов и их соотношения от типа опухоли и механизма воздействия реагентов (табл. 2).
Данные таблицы 2 показывают, что экспрессия ТгкА, р75 рецепторов
и их соотношение статистически значимо зависят от типа опухоли (р=2,0х10-11)
Таблица 3.
Интенсивность флуоресценции антител к ТгкА и р75 рецепторам, их соотношение и индекс цитотоксичности в группах пациентов с преобладанием ТгкА и р75 рецепторов
и механизма действия реагентов (р=1,1х10-23). Зависимость от типа опухоли была установлена при действии ФРН и комбинации ФРН + цисплатин. Зависимость от механизма действия реагента была констатирована для всех рассматриваемых типов опухолей. Таким образом, документирована более сильная зависимость экспрессии ТгкА, р75 рецепторов от механизма действия реагента, чем от типа опухоли.
Изучали соотношение рецепторов ТгкА/р75 на клетках опухолей (таблица 3).
Показатель Группа «ТгкА» Группа «р75» Уровень значимости между группами, р
Интенсивность флуоресценции к ТгкА, пиксел/мкм2 1379,9±316,7 уровень значимости внутри группы, р р=0,01 616,2±137,1 уровень значимости внутри группы, р р= 0,0005 р= 0,04
Интенсивность флуоресценции к р75, пиксел/мкм2 459,2±153,4 3095,9±652,7 р= 0,0002
Разница, % 842,4±455,3 1587,9±206,5 р= 0,03
Соотношение ТгкА /р75 7,7±0,2 0,6±0,2 р= 0,0004
Индекс цитотоксичности, % 48,8±3,5 45,4±4,8 р= 0,39
Примечание - Жирным шрифтом обозначены статистически значимые показатели уровня значимости р<0,05. Разница % - это различие между преобладающим и меньшим значениями интенсивности флуоресценции в % в серии эксперимента, рассчитывали по формуле: ((экспрессия ТгкА / экспрессия р75) х100) - ((экспрессия р75 / экспрессия ТгкА)х100) в серии, где преобладала экспрессия ТгкА рецептора и ((экспрессия р75 / экспрессия ТгкА)х100) - ((экспрессия ТгкА / экспрессия р75)х100) в серии, где преобладала экспрессия р75 рецептора. В таблице приведены средние значения ± ошибка среднего, вычисляемые по данным всех пациентов (во всех сериях) в пределах одной группы.
Данные таблицы 3 показывают, что в группах «ТгкА» и «р75» значения интенсивности флуоресценции антител к ТгкА и р75 рецепторам, а также соотношение ТгкА/р75 статистически значимо отличались в своей группе,
но в тоже время статистически значимо отличались (р=0,04, р=0,0002, и р=0,0004 соответственно) от аналогичных показателей между группами. Между группами были выявлены статистически значимые (р=0,03) отличия для величин, выражающих в процентном отношении разницу интенсивностей флуоресценции преобладающего над меньшим типами экспрессирующихся рецепторов («разница %»), данный показатель был статистически значимо выше в группе «р75». При одинаковом уровне ИЦ в группах «ТгкА» и «р75» этот факт свидетельствует о большей аффинности ТгкА рецептора и различиях в механизмах взаимного функционирования рецепторов. Он подтверждается цифрами соотношения ТгкА/р75 рецепторов, отличающимися между группами в 12,8 раз (р=0,0004).
Анализ полученных результатов поставил вопрос: существует ли взаимосвязь экспрессии ТгкА, р75 рецепторов и их соотношения (ТгкА/р75) с чувствительностью клеток опухолей к ФРН и его комбинациям с цисплатином или темозоломидом? С этой целью автор рассчитывал ко-
эффициент корреляции между ИЦ неопластических клеток пациентов, обработанных ФРН и его комбинациями с цисплатином или темозоломидом и экспрессией ТгкА, р75 рецепторов, их соотношением.
С целью выявления механизмов действия ФРН и его комбинаций с химиопрепаратами в опухолевых клетках определяли изменение экспрессии ТгкА, р75 рецепторов относительно их экспрессии на клетках контрольных серий. Статистически значимые корреляции экспрессии ТгкА и р75 рецепторов с ИЦ реагентов выявлены для клеток анапластической астроцитомы и глиобластомы. В сериях опытов документировано наличие различных вариантов корреляций индекса цитотоксичности с экспрессией рецепторов и их соотношением. Это свидетельствует о наличии различных механизмов действия реагентов, некоторые из которых можно установить путем сопоставления коэффициентов корреляций со значениями, отражающими в процентах экспрессию ТгкА и р75 рецепторов по отношению к экспрессии рецепторо в контрольных сериях. Противоположные знаки коэффициентов корреляций ТгкА и р75 рецепторов с ИЦ документируют антагонизм действия указанных рецепторов по отношению к гибели клеток (таблица 4).
Примечание - В скобках указаны значения экспрессии преобладающего типа рецептора по отношению к меньшему в каждой серии (количество преобладающего в соотношении типа рецепторов/количество рецепторов противоположного типа). Жирным шрифтом, знаками * и ** обозначены статистически значимые (р<0,05, р<0,01) отличия значений экспрессии преобладающего рецептора по отношению к меньшему в каждой серии по сравнению с контрольной. Интенсивность флуоресценции антител к рецепторам по отношению к контрольной серии, % вычислялась по формуле: (экспрессия ТгкА (или р75) под воздействием реагента / экспрессия ТгкА (или р75) в контроле) х 100. Условно интенсивность флуоресценции антител к ТгкА или р75 рецепторам в контрольных сериях для каждого типа опухоли принята за 100%. Жирным шрифтом и символом # обозначены статистически значимые (р<0,05) отличия интенсивности флуоресценции антител к рецепторам по отношению к контрольной серии. Жирным шрифтом обозначены статистически значимые (р<0,05) коэффициенты корреляции ИЦ с экспрессией ТгкА и р75 рецепторов и их соотношением, df - число степеней свободы для каждой серии экспериментов. Знак прочерка в графах для корреляций в контрольных сериях указывает на то, что данные корреляции не рассчитаны, поскольку индекс цитотоксичности в контрольных посевах равен нулю
Таблица 4
Коэффициент корреляции между экспрессией ТгкА, р75 рецепторов, их соотношением и индексом цитотоксичности реагентов при воздействии на клетки опухолей
Серия эксперимента df Преобладающий тип рецептора в серии Интенсивность флуоресценции антител к рецепторам по отношению к контрольной серии, % Коэффициент корреляции с индексом ци-тотоксичности, г, уровень значимости, р
TrkA р75 TrkA р75 соотношение ТгкА/ р75
АА-контроль 54 ТгкА (6,7) 100,0 100,0 - - -
АА-ФРН 54 ТгкА (7,2) 112,9 106,4 0,13 -0,32 0,43 р<0,05
АА-ФРН + ЦП 54 ТгкА (2,7)* 176,4 # 434 # -0,19 0,68 р<0,0001 -0,20
АА-ФРН + ТД 54 нет преобладания 100,7 792,9 # 0,42 р<0,05 -0,51 р<0,01 0,46 р<0,05
ГБ -контроль 68 р75 (20,8) 100,0 100,0 - - -
ГБ-ФРН 68 р75 (34,6)* 94,6 157,9 # 0,27 -0,71 р<0,0001 0,44 р<0,02
(34,6)* 94,6 157,9 # 0,27 -0,71
ГБ-ФРН+ЦП 68 нет преобладания 385,4 # 23,4 # -0,65 р<0,0001 -0,06 -0,47 р<0,02
ГБ-ФРН + ТД 68 ТгкА (3,1) 1221 # 18,8 # 0,50 р<0,001 -0,53 р<0,001 0,63 р<0,0001
МБ-контроль 66 р75 (2,1) 100,0 100,0 - - -
МБ-ФРН 66 р75 (1,9) 117,4 110,3 0,12 -0,28 0,26
МБ-ФРН + ЦП 66 ТгкА (1,9) 48,7 # 12,4 # -0,04 -0,3 0,25
МБ-ФРН + ТД 66 р75 (11,2)* 13 # 70,1 0,27 0,34 -0,01
Например, на клетках анапластической астроцитомы при воздействии ФРН преобладала экспрессии ТгкА рецептора, как и в контрольной серии, при этом была отмечена положительная корреляция (р<0,05) ИЦ с соотношением ТгкА/р75 рецепторов. Следовательно, цитотоксический эффект ФРН реализуется преимущественно через ТгкА рецепторы (таблица 4). Воздействие комбинации ФРН + цисплатин на клетки анапластической астроцитомы приводило к снижению экспрессии преобладающего в серии ТгкА рецептора по отношению к экспрессии р75 рецептора в сравнении с контрольной серией. Положительная (р<0,0001) корреляция ИЦ с экспрессией р75 рецептора свидетельствует о наличии сигнального пути, запускаемого через указанный рецептор (табл. 4). Механизм действия данной комбинации, проявляющийся значитель-
ным увеличением экспрессии р75 рецепторов (при менее интенсивном росте ТгкА), совпадает с механизмом гибели клеток опухоли через р75 рецепторы, что свидетельствует о потенциальной эффективности данной комбинации реагентов. На клетках анапластической астроцитомы при воздействии комбинации ФРН + темозоломид установлены положительные (р<0,05) корреляции ИЦ с экспрессией ТгкА рецептора, соотношением ТгкА/р75 рецепторов и отрицательная (р<0,01) корреляция с экспрессией р75 рецептора, что свидетельствует о запуске гибели неопластических клеток в основном через ТгкА-путь. Тогда как механизм действия комбинации ФРН + темозоломид выраженный отсутствием преобладающего типа рецептора в соотношении (в отличие от контроля, где преобладает ТгкА) и значительным ростом экспрессии р75 рецептора,
препятствует ее эффективному цитотоксическому действию.
При воздействии ФРН на клетки ГБ установлена положительная корреляция (р<0,02) ИЦ реагента с соотношением ТгкА/р75 рецепторов и отрицательная (р<0,0001) ИЦ реагента с экспрессией р75 рецептора, что указывает на запуск гибели клеток через ТгкА-путь. Противоположные знаки корреляционных зависимостей указывают на антагонизм ТгкА и р75 рецепторов в гибели опухолевых клеток. Механизм действия ФРН в клетках глиобластомы характеризовался преобладанием экспрессии р75 рецептора (также как в контроле), уменьшением соотношения ТгкА/ р75 (в сравнении с контролем). Экспрессия ТгкА рецептора статистически значимо не изменялась.
Такой механизм действия ФРН препятствует гибели опухолевых клеток через ТгкА рецепторы. При воздействии комбинации ФРН + темозоломид на клетки глиоб-ластомы выявлены положительные корреляции между ИЦ комбинации и экспрессией ТгкА рецептора (р<0,001), соотношением ТгкА/р75 рецепторов (р<0,001) и отрицательная (р<0,0001) корреляция между ИЦ комбинации и экспрессией р75 рецептора. Такие показатели констатируют активацию гибели клеток опухоли через ТгкА сигнальный путь. При этом механизм действия комбинации ФРН + темозоломид по своим показателям соответствовал установленным корреляционным зависимостям. Например, при положительной корреляции между ИЦ и экспрессией ТгкА рецептора, соотношением ТгкА/р75 рецепторов, в механизме действия наблюдали доминирование ТгкА рецептора над р75 (в отличие от контроля, где доминировал р75 рецептор), увеличение численности ТгкА рецептора (в 12 раз) по сравнению с контролем. При отрицательной корреляции между ИЦ и р75 рецептором, его экспрессия была статистически значимо ингибирована (в 5 раз по отношению к контролю). Таким образом, комбинация ФРН + темозоломид обладает потенциальной противоопухолевой эффективностью.
При воздействии ФРН и его комбинаций с цисплати-ном или темозоломидом на клетки медуллобластомы не было установлено статистически значимых корреляций экспрессии ТгкА, р75 рецепторов и его соотношения с ИЦ реагентов. В сериях при воздействии ФРН и комбинации ФРН + темозоломид на клетках медуллобластомы преобладал р75 рецептор. Применение ФРН стимулировало на неопластических клетках экспрессию р75 рецептора в большей степени, чем ТгкА рецептора по отношению к контролю, при этом их численность становилась примерно одинаковой. Воздействие комбинации ФРН + те-мозоломид на клетки медуллобластомы приводило к статистически значимому (р<0,001) ингибированию на них экспрессии ТгкА рецептора (в 7,5 раз) при незначительном подавлении экспрессии р75 рецепторов, что явилось причиной статистически значимого преобладания р75 рецептора на клетках опухоли по сравнению с контролем. При воздействии комбинации ФРН + цисплатин на клетки медуллобластомы преобладала (р<0,05) экспрессия ТгкА рецепторов. Она явилась результатом стимулирования (р<0,01) комбинацией синтеза молекул ТгкА рецептора и сильного ингибирования р75 рецептора на клетках опухо-
ли. Вследствие наличия функционального антагонизма у данных рецепторов и более выраженного подавления экспрессии р75 рецептора, чем ТгкА рецептора (образующих структурные гетерокомплексы на мембранах клеток), р75 рецептор препятствует значительному увеличению численности ТгкА рецептора и гибели клеток медуллобласто-мы через ТгкА-сигнальный путь. Приведенные механизмы действия ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом на клетки МБ, отсутствие статистически значимых корреляций с ИЦ, свидетельствуют о том, что гибель клеток осуществляется через альтернативные сигнальные пути.
Таким образом, установлены статистически значимые положительные и отрицательные корреляции между ИЦ реагентов и экспрессией ТгкА, р75 рецепторов, их соотношением (ТгкА/р75) на клетках анапластической астроцитомы и глиобластомы. Различные варианты корреляционных зависимостей указывают на доминирование разных сигнальных каскадов, запускающих гибель опухолевых клеток. Среди них для исследованных типов опухолей преобладал ТгкА-путь: при воздействии ФРН, комбинаций ФРН + темозоломид на клетки анапластической астроцитомы и глиобластомы. Гибель клеток анапласти-ческой астроцитомы и глиобластомы через р75 рецепторы установлена при воздействии комбинации ФРН + циспла-тин. На клетках МБ статистически значимых корреляций экспрессии указанных рецепторов с ИЦ не выявлено.
Во всех сериях экспериментов и на всех типах опухолей документирован функциональный антагонизм экспрессии ТгкА, р75 рецепторов по отношению к гибели клеток (только в случае применения ФРН + цисплатин на клетках глиобластомы он маскируется экспрессией аберрантных ТгкАШ рецепторов). Соотношение ТгкА/р75 рецепторов и коэффициент его корреляции с ИЦ документируют механизм (сигнальный каскад), по которому идет гибель клеток опухоли при воздействии ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом. На гибель опухолевых клеток также влияет тип доминирующего рецептора, его статус, описываемый соотношением ТгкА/р75 (сверхэкспрессия, ингибирование или одинаковое количество), возможно, формирование структурных гетерокомплексов ТгкА-р75 рецепторов [25]. На наличие последнего факта указывают коэффициенты корреляций между ИЦ реагентов и экспрессией ТгкА, р75 рецепторов одного знака и соответствующие им функциональные изменения экспрессии рецепторов [14, 15, 18, 28, 32].
Выводы.
1. Установлено присутствие ТгкА и р75 рецепторов на клетках анапластической астроцитомы, глиобластомы и медуллобластомы при воздействии на них ФРН и его комбинаций с цисплатином или темозоломидом.
2. При воздействии любого из указанных реагентов на клетки опухоли наблюдали различия в экспрессии ТгкА и р75 рецепторов и их соотношения (в пересчете на одну клетку) в пределах одного и различных типов опухолей.
3. В каждой серии эксперимента статистически значимо (р=0,001) преобладала экспрессия ТгкА либо р75 рецептора, на основании чего сформированы группы «ТгкА» и «р75». Экспрессия ТгкА и р75 рецепторов также
статистически значимо (p=0,03) различалась между указанными группами.
4. Верифицирована зависимость экспрессии
TrkA, p75 рецепторов от механизма действия реагента (p=1,1x10-23) и от типа опухоли (p=2,0x10-11).
Установлены статистически значимые (p<0,05, p<0,0001) положительные (r=0,42-0,68, df=54-68) и отрицательные (r=-0,42--0,71, df=54-68) корреляции между ИЦ ФРН, его комбинаций с цисплатином, темозоломи-дом и показателями экспрессии TrkA, р75 рецепторов, их соотношением на клетках анапластической астроцитомы и глиобластомы. Различные варианты корреляционных зависимостей указывают на доминирование разных сигнальных каскадов (TrkA-, р75-пути), запускающих гибель опухолевых клеток при воздействии реагентов. Соотносительная экспрессия TrkA/p75 рецепторов и коэффициент ее корреляции с ИЦ указывают на механизм (сигнальный путь), по которому идет гибель клеток.
Литература
1. Божкова В.П., Вепринцев Б.П., Викторов И.В. и др. Руководство по культивированию нервной ткани. Методы. Техника. Проблемы. М.: Наука, 1988. - 318 с.
2. Борисов К.Е., Сакаева Д.Д. Таргетная терапия злокачественных глиом: состояние проблемы // Российский онкологический журнал. - 2011. - № 3. - С. 47-53.
3. Гланц С. Медицинская и биологическая статистика: М. Практика, 1999. -356 с.
4. Калюнов В. Н. Биология фактора роста нервной ткани. Минск: Наука и техника, 1986. - 206 с.
5. Конопля Н. Е. Лечение медуллобластомы у детей младше 4 лет // Мед. Журн. - 2009. - № 1. - С. 112-114.
6. Миронов А.Н., Бабаян Н.Д., Васильева АН. и др. Руководство по проведению доклинических испытаний лекарственных средств. Часть 1. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
7. Савва, Н.Н., Зборовская А.А., Алейникова О.В. Злокачественные новообразования у детей Беларуси : заболеваемость, выживаемость, смертность, подходы к паллиативной помощи. - Мн.: Респ. науч. мед. б-ка, 2008. -180 с
8. Церковский Д. А. Соно-фотодинамическая терапия - новый метод лечения злокачественных опухолей мозга // Онколог. журн. - 2015. - Т. 9, № 1. - С. 94-106.
9. Чернов А.Н., Талабаев М.В., Конопля Н.Е. и др. Влияние химиопрепаратов и фактора роста нервов на выживаемость клеток первичной культуры нейроэпители-альных опухолей // Весщ Нац. акад. навук Беларусь Серыя мед. навук. - 2013. - № 1. - С. 46-51.
10. Чу Э., де Вита-младший В и др. Химиотерапия злокачественных опухолей. Под ред. Э. Чу, В. де Вита-младше-го. М.: Практика, 2008. - 447 p.
11. Bobustuc G.C., Baker C.H., Limaye A. et al. Levetiracetam enhances p53-mediated MGMT inhibition and sensitizes glioblastoma cells to temozolomide // Neurooncology. - 2010. - Vol. 12, № 9. - P. 917-927.
12. Brodeur G.M. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma // Nature Review. - 2003. -Vol. 3, № 3. - P. 203-215.
13. Brodeur G.M., Nakagawara A., Yamashiro D.J. et al.
Expression of TrkA, TrkB and TrkC in human neuroblastomas // J. of Neurooncology. -1997. - Vol. 31, № 1. - P. 249-256.
14. Chen J., Zhe X. Cotransfection of TrkA and p75NTR in neuroblastoma cell line IMR-32 promotes differentiation and apoptosis of tumor cells // Chinease Med. J. - 2003. -Vol. 116, № 6. - P. 906-912.
15. Evangelopoulos M.E., Weis J., Kruttgen A. Neurotrophin effects on neuroblastoma cells : correlation with Trk and p75NTR expression and influence of Trk receptor bodies // J. of Neurooncology. - 2004. - Vol. 66, № 1-2. - P. 101-110.
16. Freshney R. I. et al. Animal Cell Culture : a Practical Approach; eds Masters. JR.W., 3rd ed, London: Oxford Univ. Press, 2000. - 315 c.
17. Harel L., Costa B., Fainzilber M. On the death Trk // Developmental of Neurobiology. - 2010. - Vol. 70, № 5. - P. 298-303.
18. Heymach J.V., Schooter E.M. The biosyntesis of neurotrophin heterodimeres by transfected mammalian cells // J. of Biological Chemistry. - 1995. - Vol. 270, № 20. - P. 1229712304.
19. Ghinelli E., Johansson J., Rios JD. et al. Presence and localization of neurotrophins and neurotrophin receptors in rat lacrimal gland // Investigative Ophthalmology and Visual Science. - 2003. - Vol. 44, № 8. - P. 3352-3357.
20. Grauer O., Pascher Ch., Hartmann Ch. et al. Temozolomide and 13-cis retinoic acid in patients with anaplastic gliomas: a prospective single-arm monocentric phase-II study (RN0P-05) // J. of Neurooncology. - 2011. -Vol. 104, № 3. - P. 801-809.
21. International agency for research of cancer. Globocan, the World of Health Organization [Electronic resource]. Access mode: http: www.globocan.iarc.fr / data of access: 23.03.2016.
22. Kimura S., Yoshino A., Katayama Y. et al. Growth control of C6 glioma in vivo by nerve growth factor // J. of Neuroncology. - 2002. - Vol. 59, № 3. - P. 199-205.
23. Kokunai T. Iguchi H., Tamaki N. Differentiation and growth inhibition of glioma cells induced by transfer of trk A proto-oncogene // J. of Neurooncology. - 1999. - Vol. 42, № 1. - P. 23-34.
24. Korade M. Z., Yan Ch., Portugal C. et al. Expression and p75 neurotrophin receptor dependence of cholesterol synthetic enzymes in adult mouse brain // Neurobiology of Aging. - 2007. - Vol. 28, № 10. - P. 1522-1531.
25. Kruttgen A., Schneider I., Weis J. The dark side of the NGF family: neurotrophins in neoplasias // Brain Pathology. -2006. - Vol. 16, № 4. - P. 304-310.
26. Lafai-Cousin L., Strother D. Current treatment approaches for infants with malignant central nervous system tumors // The Oncologist. - 2009. -Vol. 14. -P. 433-444.
27. Nakagawara A. Trk receptor tyrosine kinases: a bridge between cancer and neural development // Cancer Letters. -2001. - Vol. 169, № 2. - P. 107-114.
28. Pflug BR., Colangelo AM., Tornatore C. et al. TrkA induces differentiation but not apoptosis in C6-2B glioma cells // J. of Neuroscience Research. - 2001. - Vol. 64, № 6. - P. 636-645.
29. Pimentel E. Handbook of growth factors: [in 3 vol.] London, Tokyo: CRC Press Inc, 1994, Vol. 2., Ch. 5:
Neurotrophic growth factors, 217-240 p.
30. Tacconelli A., Farina AR., Cappabianca L. et al. TrkA alternative splicing: a regulated tumor-promoting switch in human neuroblastoma // Cancer Cell. - 2004. - Vol. 6, № 4. -P. 347-360.
31. van Belle G., Fisher LD., Heagerty PJ. et al. Biostatistics: a methodology for the health sciences; eds by L.D. Fisher, G. van Belle. Canada: Jonh Wiley and Sons Inc, 2004. - 889 p.
32. Wadhwa S., Nag T.C., Jindal A. et al. Expression of the neurotrophin receptors TrkA and TrkB in adult human
astrocytoma and glioblastoma // J. of Bioscience. - 2003. - Vol. 28, № 2. - P. 181-188.
33. Wolff J.E., Kortmann R-D., Wolff B. et al. High-dose methotrexate for pediatric high grade glioma - results of the HIT-GBM-D pilot study // J. of Neurooncology. - 2011. - Vol. 102, № 3. - P. 433-442.
