CC BY
10
мощников саиитарных врачей: предоставление Это будет способствовать повышению активности дополнительного отпуска лучшим ОСИ, как на- ОСИ. 5
пример, членам добровольных народных дружин. Поступила 18.11.85
Методы исследования
УДК 613.632-07:612.616.2 + 615.9.015.4:612.616.2
Ю. В. Иванов
цитологические критерии состояния сперматогенеза в токсиколого-гигиенических исследованиях
Московский НИИ гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана
Для оценки степени гонадотоксичности ксенобиотиков и влияния на гонады других факторов используются различные способы и критерии. Из них особо значимы и важны показатели, характеризующие состояние сперматогенеза. Как известно, наибольшее применение при изучении сперматогенеза нашли морфологические методы исследования [1, 2, 6—8, 10]. Возможности и ограничения морфологического изучения сперматогенеза для характеристики гонадотоксических эффектов уже рассматривались нами ранее [3-5].
В настоящем сообщении анализируются возможности изучения состояния сперматогенеза на мазковых препаратах клеточного гомогената семенников и предлагается комплекс показателей для этого состояния.
В работе использован экспериментальный материал от беспородных белых крыс-самцов массой 400—450 г после 3-месячного хронического перорального воздействия борной кислотой и хлористым кадмием на уровне порога их общетоксического влияния. На мазковых препаратах клеточного гомогената семенников [5], окрашенных по Паппенгейму — Крюкову азур-эозин-метиле-новым синим, проводили количественный анализ состояния сперматогенеза. Изучены следующие показатели:
— сперматограммы — процентное распределение различных типов половых клеток, клеток Сертоли и Лейдига. Подсчет ведется по полям зрения с охватом всего мазка (сосчитывается не менее 1000 клеток);
— митотический индекс — количество митозов на 1000 половых клеток;
— мейотический индекс — количество мейоти-ческих клеток на 1000 всех сосчитанных половых;
— митотическо-мейотический индекс — количество мейотических и митотических клеток на 1000 половых;
— митотическо-мейотическое отношение;
— герминативный индекс — отношение числа сперматогоний к клеткам Сертоли (сосчитывается по полям зрения не менее 300 этих типов-клеток и результат выражается в процентах);
— процент многоядерных сперматогенных клеток (сосчитываются все типы многоядерных половых клеток (при анализе не менее 1000 всех сосчитанных);
— процент дегенерирующих половых клеток (при анализе не менее 1000 клеток);
— напряженность сперматогенеза или индекс релаксации сперматогенеза — отношение числа всех сосчитанных половых ко всем сосчитанным клеткам Сертели (сосчитывается не менее 1000 всех клеток);
— процент патологических митозов (при оценки не менее 300 митотически делящихся клеток в анателофазе; учитываются мосты, фрагменты);
— процент клеток с повреждениями синапто-немального комплекса (при оценке не менее 300 поздних пахитенных сперматоцитов);
— микроядерный тест (учет доли половых клеток с микроядрами при подсчете не менее 5000 клеток; результат выражается в процентах);
— количество патологически измененных спер-матид 14—19 этапов их развития у крыс по Леб-донду и Клермонту (подсчет не менее 5000 спер-матид, результат выражается в процентах; учитываются двуглавые формы, булавовидные головки, микро- и макроформы головок сперматид, перстне- и каплевидные формы головок);
— доля патологически измененных многоядерных сперматогенных клеток (на 300 сосчитанных многоядерных сперматогониев, сперматоцитов и сперматид видется подсчет их патологически измененных форм; учитываются клетки с различными по размеру ядрами, пикнозами отдельных ядер, добавочными микроядрами в цитоплазме, с патологией эндомитозов и мейоза в многоядерных образованиях; в многоядерных сперматидах учитываются ядра под одной акросомной шапочкой,.
Изменение цитологических показателей состояния сперматогенеза у крыс после хронического перорального действия
борной кислоты и хлористого кадмия (М±т)
Показатели Группа животных
контрольная 1-я 2-я
Сперматограмма, %:
сперматогонии 5,2+0,08 4,8±0,1* 4,6+0,04*
сперматоциты 16,5+0,2 18,4±0,1* 17,8±0,2*
сперматиды 67,4± 1,6 64, 0± 1,2 65,2±0,8
клетки Сертоли 6,2±0,2 8,8±0,4* 7,9+0,6
клетки Лейдига 3,0±0,1 6,2±0,1* 6,0±0,2*
Митотнческий индекс, %0 10,2+0,05 8,0±0,04* 8,6±0,06*
Мейотический индекс, %0 155,4+1,9 136,5±2,0* 140,2+1,6*
Митотическо-мейотическии индекс, %0 166,0±2,0 145,0±2.0* 149,0+1,8*
Митотическо-мейотическое отношение 0,065 0,06 0,06
Герминативный индекс, % 62,5±0,1 55,0±0,3* 53,8±0,4*
Многоядерные сперматогенные клетки, % 1,6±0,2 1,8±0,4 1,95+0,4
Дегенерирующие половые клетки, % 4,0+0,1 4,4±0,2 4,8±0,2*
Индекс релаксации сперматогенеза 16,0±0,1 14,0±0,15* 13,5±0,1*
Патологические митозы 0,2+0,008 0,4+0,01* 0,55±0,01*
Сперматоциты с повреждениями синаптонемальных 1,8±0,7 1,7±0,3
комплексов 1,1+0,4
Микроядра, %0 0,1±0,006 0,4±0,004* 0,3+0,002*
Патологические сперматиды, %0 1,7±0,01 2,2±0,04* 2,0±0,01*
Патологические многоядерные половые клетки, % 0,5+0,006 1,1 ±6; 01* 1,4±0,008*
Различия достоверны при Р ^0,05.
с нарушениями процессов конденсации хроматина; результат выражается в процентах).
Уже из перечня параметров оценки состояния сперматогенеза на мазковых препаратах клеточного гомогената семенников видно, что большинство из них не могут быть использованы для гистологических срезов. На срезах семенных канальцев семенников сперматогенез строго ком-партментализован в соответствии со стадийностью процесса и его синхронизованным распространением в виде «волны» сперматогенеза вдоль оси семенных канальцев. Каждый отдельный срез семенного канальца — одна из стадий сперматогенеза со строгим соответствием количественных и качественных взаимоотношений различных типов сперматогенных, фолликулярных клеток и клеток Лейдига вокруг канальцев. Все возможные интегральные оценки состояния сперматогенеза типа перечисленных параметров для мазковых препаратов непригодны или используются только на срезах семенников. На срезах необходимо либо охватить усредненными подсчетами ткань буквально всего семенника, либо соотносить результаты подсчетов к каждой из 14 (у крысы) стадий сперматогенеза да еще и с предварительной идентификацией этих стадий на специально приготовленных и окрашенных препаратах. В то же время возможность получения комплексных, интегральных параметров состояния сперматогенеза и их оценки при изучении гонадотокси-ческих эффектов различных воздействующих на организм факторов представляется очевидной и необходимой. Исходя из этого, а также из возможности экспрессного анализа изменений спер-^матогенеза у экспериментальных животных, раз-
рабатывался метод мазковых препаратов из клеточного гомогената семенников и предлагались использованные в настоящей работе интегральные параметры для оценки состояния спермато-генной ткани.
Результаты изучения состояния сперматогенеза у крыс после хронического перорального воздействия борной кислотой (1-я группа) и хлористым кадмием (2-я группа) на уровне порога их общетоксического влияния на организм (соответственно 0,032 и 0,0005 мг/кг) представлена в таблице.
Прежде чем перейти к анализу изменений состояния сперматогенеза у экспериментальных животных, следует рассмотреть надежность и воспроизводимость результатов (см. таблицу) у ин-тактных крыс.
Контрольная группа (как и опытные) состояла из 5 крыс. У каждого животного анализировали по 2 мазка из клеточного гомогената семенников. Как видно из таблицы, разбросы результатов весьма невелики. Наиболее варьируют данные, касающиеся сперматид в сперматограмме, показатели напряженности сперматогенеза, спер-матоцитов с повреждениями синаптонемального комплекса и дегенерирующих половых клеток.
Учитывая, что в показатель напряженности сперматогенеза основной вклад вносят сперматиды и их производство в семеннике, можно думать, что этот признак у крыс и должен быть индивидуально заметно варьирующим. На это указывает и разброс по этому признаку в сперматограмме. Колебания доли пахитенных сперматоцитов с повреждениями синаптонемального комплекса в известной мере связаны с трудностями строго стандартизированного приготовления мазковых пре-
паратов с хорошо распластанными терхчленны-ми тяжами, проходящими вдоль оси бивалентов в ядрах пахитенных сперматоцитов, а отсюда и сложностью выбора и учета повреждений синап-тонемальных комплексов. В то же время показатель целостности синаптонемального комплекса в пахитенных сперматоцитах представляется важным и необходимым при анализе возможных нарушений аппарата мейоза при вступлении в кросинговер.
При оценке процента дегенерирующих половых клеток на мазковых препаратах обращает на себя внимание то, что полученные данные не совпадают с теоретическими расчетными, установленными разными авторами при соответствующем анализе на срезах семенных канальцев по стадиям сперматогенеза [7, 11]. Расхождения могут быть связаны как с элиминацией и переходом в детрит части дегенерирующих клеток в процессе приготовления клеточного гомогената семенников, так и с тем, что расчет процента дегенерирующих клеток в нашем случае идет на тотальную сперматогенную ткань, а не на канальцы отдельных стадий сперматогенеза, где он оказывается наибольшим.
Переходя к анализу состояния сперматогенеза на мазковых препаратах гонад экспериментальных крыс, следует также отметить достаточную воспроизводимость и малый разброс данных в каждой группе.
Результаты исследований показывают, что и борная кислота, и хлористый кадмий на уровне порога общетоксического действия на организм вызывают нарушения сперматогенеза. Эти нарушения проявляются снижением мейозов и митозов в сперматогенной ткани, изменении герминативного индекса, увеличении процента дегенерирующих половых клеток. Растет индекс релаксации сперматогенеза, т. е. уменьшается доля половых клеток относительно стабильной и в значительной мере резистентной к воздействиям популяции клеток Сертоли. Увеличивается процент патологических митозов и доля пахитенных сперматоцитов с повреждениями синаптонемальных комплексов. Последнее особенно выражено у крыс при действии борной кислоты. Микроядерный тест показал, что борная кислота и хлористый кадмий дают определенный генотоксический эффект. На это указывают результаты подсчета количества патологически измененных сперма-тид.
Борная кислота и хлористый кадмий увеличивали по сравнению с контролем долю многоядер-н«х клеток сперматогенного ряда с различными нарушениями. При действии борной кислоты в многоядерных клетках увеличивалась патология эидомитозов и мейоза. Часто встречались микроядра, пикнозы отдельных ядер многоядерных сперматогенных клеток. Для хлористого кадмия характерны изменения акросомного аппарата в многоядерных сперматидах. Часто одна акросом-
ная шапочка покрывала несколько ядер. Многие ядра многоядерных сперматид были вообще лишены акросомного аппарата.
В отличие от известного представления о том, что многоядерные клетки в сперматогенезе — результат деструктивных изменений сперматогенных элементов, в частности вызванных борной кислотой [9], мы установили, что нормальный сперматогенез постоянно сопровождается образованием многоядериых сперматогенных клеток. Полученные результаты показывают, что относительное увеличение количества многоядерных клеток при гонадотоксических воздействиях связано в первую очередь с уменьшением общей кле-точности семенников. Если расчет многоядериых клеток вести относительно стабильной популяции клеток Сертоли, то количество многоядерных клеток сперматогенной ткани возрастает незначительно при действии как борной кислоты, так и хлористого кадмия. В то же время гонадотокси-ческие воздействия равновероятностно увеличивают как долю поврежденных одноядерных, так и многоядерных сперматогенных элементов. На это указывают и результаты настоящей работы. Нужно лишь отметить, что повреждения многоядерных сперматогенных клеток более отчетливо проявляют себя и имеют больше вариаций признаков нарушений.
Подводя итог, можно сказать, что преимущества цитологического изучения семенников заключаются, во-первых, в получении широкого круга интегральных биологических параметров состояния сперматогенеза. Это позволяет оценивать и сравнивать его с любыми иными клеточными системами организма. Во-вторых, предлагаемый цитологический метод изучения сперматогенеза является экспрессным. Получаемые количественные параметры хорошо воспроизводимы даже на малых выборках, широко охватывают все стороны биологии мужского гаметогенеза и позволяют, на наш взгляд, дать необходимую трактовку и оценку результатов изучения степени гонадотоксичности воздействующих на организм ксенобиотиков для целей гигиенического регламентирования.
Литература
1. Бороздин Э. К. — Арх. анат., 1964, № 5, с. 33—40.
2. Данилова Л. В. Ультраструктурное исследование сперматогенеза. М., 1978.
3. Иванов Ю. В., Доброславская Т. Л. — Гиг. и сан., 1979, № 2, с. 19—24.
4. Иванов 10. В. — В кн.: Морфологические методы исследования в гигиене и токсикологии. М„ 1983, с. 96-101.
5. Иванов Ю. В. — Там же, 1984, № 8, с. 50—51.
6. Райцина С. С. Травма семенника и аутонммунитет. М., 1970.
7. Рузен-Реанге Э. Сперматогенез у животных: Пер. с англ., 1980.
8. Саноцкий И. В., Фоменко В. Н. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. М., 1979.
9. Силаев A. A., Королев В. В. — В кн.: Ультраструктур- нилова, Е. Ф. Князева и др. М., 1983.
ные аспекты морфогенеза и регенерации в норме и па- 11. Roosen-Runge Е. С. — Z. Zellforsch., 1955, Bd 41,
тологии. M., 1976, с. 158—163. S. 221—235,
10. Сперматогенез и его регуляция /Е. С. Габер, Л. В. Да- Поступила 05.09.85
УДК 616.24-003.656.6-092.9
Г. М. Пичхадзе
о моделировании условий для возникновения пневмокониозов в эксперименте
Карагандинский медицинский институт
При изучении действия на организм аэрозолей химической и другой природы широко используются камеры различной конструкции для ингаляционного запыления животных. Известные камеры (цилиндрической формы) конструктивно могут обеспечить равномерное, динамическое запыление рабочей зоны и непрерывное удаление вносимой пылевзвеси, однако их нельзя ис-фь пользовать для изучения комбинированного воздействия на организм физической нагрузки, пыли и других факторов. Тем самым эти пылевые камеры не позволяют приблизить экспериментальную модель к промышленным производственным условиям деятельности людей, труд которых связан с воздействием аэрозолей различной химической природы и других факторов внешней среды.
Задачей настоящего исследования являлось устранение указанных недостатков и приближение экспериментальной модели к условиям рабо-
Общий вид (а) и разрез (б) пылевой камеры.
Объяснения в тексте.
ты лиц различных профессиональных групп. Для решения этой задачи нами сконструирована установка для запыления животных (см. рисунок)
Установка состоит из цилиндрической камеры 1 с конусообразными воздухопроводящим 2 и воздухоотводящим 3 концами. Камера имеет рассекатель 4 с отверстиями. Клетки с отсеками 5 для животных закреплены неподвижно на корпусе камеры. Отсеки снабжены сетчатыми крышками 6. Дном клеток является движущаяся дорожка 7, натянутая на 2 валиках 8. Под движущейся дорожкой имеется металлическая пластинка 9. Дорожка соединена с электродвигателем 10. Камера имеет загрузочное окно 11, которое открывается на шарнирах и является одновременно и смотровым. На загрузочном окне имеется штуцер 12 для отбора проб воздуха из камеры. На корпусе камеры установлена втулка 13 с краном для слива воды после промывки камеры.
Камера работает следующим образом. Запыленный воздух, поступая через отверстие возду-хопроводящего конуса в полость камеры, равномерно рассеивается, проходя через рассекатель, и воздействует на подопытных животных, находящихся в отсеках клеток, где они находятся в движении в связи с приведением в действие движущейся дорожки. Металлическая пластинка, расположенная под движущейся дорожкой, препятствует западанию дорожки вниз и возможному вследствие этого травмированию животных. Запыленный воздух из камеры выходит через патрубок воздухоотводящего конуса.
Преимущество предложенной пылевой камеры по сравнению с существующими заключается в том, что она позволяет изучить характер воздействия на организм комбинированных факторов (дозированной физической нагрузки, пыли и др.) в биологическом эксперименте.
Поступила 06.09.85
1 Предложенная установка успешно апробирована при моделировании экспериментального антракоза и на нее получено удостоверение № 275 от 15 февраля 1980 г-
