CC BY
32
Исследование клеток Сертоли и сперматогенных клеток крыс при экспериментально индуцированном метаболическом синдроме
и проведении бальнеофизиотерапии
О.Л. Коломиец1, Е.Е. Брагина2, 3, А.А. Кашинцова1, В.Е. Спангенберг1, Л.А. Никулина4,
Л.В. Михайлик4, Ю.Н. Королев4
ФГБУНИнститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН; Россия, 119991 Москва, ГСП-1, ул. Губкина, 3; 2ФГБНУУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115522 Москва, ул. Москворечье, 1; 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ФГБОУ«Московский
государственный университет им. М.В. Ломоносова»; Россия, 115522 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40; ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр реабилитации и курортологии» Минздрава России;
Россия, 121099 Москва, ул. Новый Арбат, 32
Контакты: Оксана Леонидовна Коломиец olkolomiets@mail.ru
Введение. Метаболический синдром (МС) может быть причиной нарушения сперматогенеза и ухудшения параметров спермо-граммы. Однако механизмы влияния МС на формирующиеся сперматогенные клетки остаются неясными. Сложность этой актуальной проблемы андрологии и репродуктологии и противоречивость опубликованных данных свидетельствуют о целесообразности использования экспериментальных моделей МС для ее решения.
Цель исследования — изучение особенностей течения профазы Iмейоза и активности процессов фагоцитоза и аутофагии в клетках Сертоли крыс с экспериментально вызванным МС и при проведении лечебно-профилактических процедур во время развития экспериментального МС.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на 12 половозрелых самцах крыс. Животные были разделены на 3равные группы: 1-я группа — самцы, рацион питания которых был стандартным; 2-я группа — самцы, рацион которых в течение 60 сут характеризовался высоким содержанием жира и фруктозы; 3-я группа — самцы, получавшие сульфатные минеральные воды и подвергавшиеся воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения сверхвысокой частоты. Клетки семенников исследовали с помощью световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Впервые у животных с МС проведено иммуноцитохимическое исследование особенностей синапсиса хромосом в профазе Iмейоза на основе анализа распластанных синаптонемных комплексов мейотических хромосом и иммуноцитохимического анализа клеток Сертоли и клеток сперматогенного ряда в препаратах давленых клеток семенных канальцев. Для статистической обработки данных использовали параметрический t-критерий Стью-дента и непараметрический U-критерий Манна—Уитни.
Результаты. В результате гистологического исследования структуры семенных канальцев животных 3 групп выявлено статистически значимое снижение индекса сперматогенеза во 2-й и 3-й группах по сравнению с контролем. Иммуноморфологи-чески в распластанных ядрах первичных сперматоцитов крыс 2-й и 3-й групп обнаружены нарушения архитектоники ядер, формирование фрагментов синаптонемных комплексов, а также многочисленных включений, окрашивающихся антителами к белку SCP3. Признаки пахитенного ареста выявлены в 40—50 % ядер сперматоцитов у крыс 2-й группы. При исследовании препаратов давленых клеток семенных канальцев крыс 2-й и 3-й групп в цитоплазме клеток Сертоли обнаружены следы фагоцитированных синаптонемных комплексов, что доказано с помощью окрашивания антителами к белку SCP3. Таким образом, получены доказательства фагоцитоза дегенерирующих первичных сперматоцитов клетками Сертоли. В клетках Сертоли, сперматоцитах к и сперматидах обнаружено множество аутофагосом, маркером которых является белок LC3B. Наличие аутофагосом в клетках -а Сертоли и клетках сперматогенного ряда у животных этих 2 групп подтверждено и при электронной микроскопии. У самцов крыс Е 2-й группы выявлены значительные нарушения в структуре пахитенных ядер. В цитоплазме клеток Сертоли и сперматидах крыс я 2-й группы выявлены липидные капли, многочисленные фаголизосомы, содержащие клеточный детрит. Обнаружено повреждение Е структуры и фагоцитоз митохондрий в клетках Сертоли и сперматоцитах. Аутофагия в клетках Сертоли и клетках спермато-а генного ряда была наиболее ярко выражена у животных 3-й группы.
Заключение. У самцов крыс с экспериментальным МС выявлены значительные нарушения в структуре ядер мейотических клеток, я высокое содержание первичных сперматоцитов с признаками пахитенного ареста. Полученные результаты согласуются с данные s других авторов, сообщивших о снижении количества сперматозоидов в эпидидимисах крыс и мышей при моделировании МС. Предал полагается, что активация аутофагии является важным фактором поддержки жизнеспособности клеток Сертоли и половых ^ клеток в стрессовых ситуациях, в том числе при МС. По-видимому, аутофагия выступает как адаптивный механизм, обеспечи-я вающий удаление остатков апоптических сперматогенных клеток, подвергшихся селекции в результате развития МС. = Ключевые слова: метаболический синдром, сперматогенез, мейоз, синаптонемный комплекс, сперматоциты, сперматиды, клет-i_ ки Сертоли, аутофагия, сульфатные минеральные воды, низкоинтенсивное электромагнитное излучение сверхвысокой частоты
a Для цитирования: Коломиец О.Л., Брагина Е.Е., Кашинцова А.А. и др. Исследование клеток Сертоли и сперматогенных клеток е крыс при экспериментально индуцированном метаболическом синдроме и проведении бальнеофизиотерапии. Андрология и гени-тальнаяхирургия 2020;21(4):76—88.
DOI: 10.17650/2070-9781-2020-21-4-76-88
Study of Sertoli cells and spermatogenic cells in rats with experimentally induced metabolic syndrome
and after balneophysiotherapy
O.L. Kolomiets1, E.E. Bragina2,3, A.A. Kashintsova1, V.E. Spangenberg1, L.A. Nikulina4, L. V. Mikhailik4, Yu.N. Korolev4
'N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences; 3 Gubkina St., GSP-1, Moscow 119991, Russia; 2Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorechye St., Moscow 115522, Russia; 3A.N. Belozersky Institute of Physico-ChemicalBiology, Lomonosov Moscow State University; Bld. 40,1 Leninskie Gory, Moscow 119992, Russia; 4National Medical Research Center for Rehabilitation and Balneology, Ministry of Health of Russia; 32 Novy Arbat St., Moscow 121099, Russia
Introduction. Metabolic syndrome (MS) can cause impaired spermatogenesis and a decrease in sperm counts. However, the details of the effect of MS on developing spermatogenic cells remain unclear. Difficulties in solving this problem, the inconsistency of published clinical data, indicate the advisability of using experimental models to solve this urgent problem of andrology and reproductology. The study objective is to describe to investigate the specifics of the course of meiotic prophase I and the activity of the processes of phagocytosis and autophagy in Sertoli cells of rats with experimentally induced MS and in the course of therapeutic and prophylactic procedures during the development of experimental MS.
Materials and methods. The animals were divided into three groups, each of which included four sexually mature male rats: 1st group — males fed a standard diet; 2nd group — males receiving a diet high in fat and fructose for 60 days; 3d group — males with MS receiving sulphate mineral waters therapy, low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation therapy. Testicular cells were examined using light and transmission electron microscopy. For the first time in animals with MS, an immunocytochemical study of the peculiarities of chromosome synapsis in prophase I of meiosis was carried out on the basis of analysis of spread synaptonemal complexes of meiotic chromosomes and immunocytochemical analysis of Sertoli cells and spermatogenic cells in squashed preparations of seminiferous tubules. The parametric Student's t-test and the nonparametric Mann—Whitney U-test were used for statistical data processing.
Results. As a result of a histological study of the structure of the seminiferous tubules of animals of three groups, a statistically significant decrease in the indices of the spermatogenesis index in 2nd and 3rd groups compared to the control was revealed. Immunomorphologically, in the spread nuclei of primary spermatocytes of rats of the 2nd and 3rd groups, violations of the architectonics of nuclei, the formation of synaptonemal complexes fragments and circular synaptonemal complexes, numerous atypical inclusions were found. Signs of pachytene arrest were found in 40—50 % of spermatocyte nuclei. In the study of squashed cells preparations of the seminiferous tubules of rats of the 2nd and 3rd groups, signs of phagocytosed synaptonemal complexes were found in the cytoplasm of Sertoli cells, which were confirmed using antibodies to the SCP3 protein. Thus, evidence for the phagocytosis of degenerating primary spermatocytes by Sertoli cells has been obtained. In Sertoli cells, spermatocytes and spermatids, many autophagosomes are found, using LC3B protein marker. The presence of autophagosomes in Sertoli cells and spermatogenic cells in animals of these two groups was also confirmed by electron microscopy. In male rats of the 2nd group, significant disturbances in the structure of the pachytene nuclei were revealed. In the cytoplasm of Sertoli cells and spermatids of rats of the 2nd group, lipid droplets, numerous phagolysosomes containing cell detritus were revealed. Structural damage and phagocytosis of mitochondria were found in Sertoli cells and spermatocytes. Autophagy in Sertoli cells were most distinctive in animals of the 3rd group. Conclusion. In male rats with experimental MS, significant disturbances in the structure of the nuclei of meiotic cells, a high content of primary spermatocytes with signs of pachytene arrest were revealed. The results obtained are in good agreement with the data of other authors, who revealed a decrease in the number of spermatozoa in the epididymis of rats and mice when modeling MS. It is assumed that the activation of autophagy is an important factor in supporting the viability of Sertoli cells and supporting the viability of germ cells in stressful situations, including MS. Apparently, autophagy is an adaptive mechanism that removes the remnants of apoptotic spermatogenic cells that are selected as a result of MS development.
Key words: metabolic syndrome, spermatogenesis, meiosis, synaptonemal complex, spermatocytes of spermatids, Sertoli cells, autophagy, sulphate mineral waters, low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation
For citation: Kolomiets O.L., Bragina E.E., Kashintsova A.A. et al. Study of Sertoli cells and spermatogenic cells in rats with experimentally induced metabolic syndrome and after balneophysiotherapy. Andrologiya i genital'naya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2020;21(4):76—88. (In Russ.).
Введение фертильности [1]. Внимание к проблеме влияния МС
Метаболический синдром (МС) — комплекс мета- и ожирения на мужскую фертильность заметно возро-
болических нарушений, который включает как минимум сло в середине 90-х годов прошлого века, когда было
3 компонента: абдоминальное ожирение, инсулиноре- выявлено прогрессивное ухудшение количественных
зистентность и дислипидемию. Высокая распростра- и качественных параметров спермограммы во многих
ненность МС, в том числе среди лиц репродуктивного регионах мира. Как причины этого явления рассма-
возраста, рассматривается как фактор риска нарушения тривались инфекционные заболевания, широкое
Е га Е
Е га Е
применение в быту хлорсодержащих органических веществ, прием лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков, вредные привычки, ожирение [1, 2].
Актуальность проблемы влияния МС и ожирения на фертильность мужчин связана с высокой частотой бесплодия, которое диагностируют, по разным данным, в 10—15 % пар репродуктивного возраста. При этом приблизительно в 50 % случаев репродуктивные неудачи обусловлены мужским бесплодием, а у 20 % пациентов причину бесплодия установить не удается [3].
Следует подчеркнуть, что ожирение выявляют у 34 % пациентов репродуктивных клиник, а увеличение индекса массы тела — у 40 % [4]. Известно также, что ожирение у мужчин может отрицательно влиять не только на фертильность, но и на результаты использования вспомогательных репродуктивных технологий [5].
К настоящему времени проблеме связи между ожирением и нарушением сперматогенеза посвящено множество публикаций, причем исследования выполнены на больших когортах пациентов. Одни авторы обнаруживают связь между ожирением и ухудшением качества сперматозоидов у мужчин [5—7]. Так, L.M. Davidson и соавт. показали, что ожирение приводит к изменению основных параметров спермограммы и структуры хроматина сперматозоидов. Эти авторы предположили, что избыток жировой ткани нарушает соотношение тестостерона и эстрогена, а снижение выработки тестостерона, в свою очередь, вызывает гомеостатическое разрушение инсулина и нарушение взаимодействия глобулина, связывающего половые гормоны, лептина и ингибина B [7]. Однако A.A. MacDonald и соавт. на основании метаанализа данных 6800 пациентов с ожирением пришли к заключению об отсутствии связи между ожирением и нарушением основных параметров эякулята [8].
Очевидно, противоречия при оценке роли МС и ожирения в возникновении нарушений сперматогенеза могут объясняться наличием в анамнезе пациентов травм, вирусных и бактериальных инфекций, влиянием их терапии, а также воздействием факторов окружающей среды, особенностей образа жизни, вредных привычек, носительством трудновыявляемых мейо-тических мутаций. Ввиду этого особый интерес вызывает возможность создания экспериментальной модели МС и исследования его влияния на сперматогенез в эксперименте на животных.
Интересно, что R.M. Vigueras-Villasenor и соавт. не обнаружили изменений тестикулярной ткани у крыс с ожирением, вызванным диетой с высоким содержанием жиров, но установили увеличение количества апоптотических сперматозоидов в просвете эпидиди-миса [9]. M.D. Gomez-Ellas и соавт. также не выявили изменений морфологии сперматозоидов и нарушений акросомной реакции у самцов мышей с экспериментально вызванным МС, однако обнаружили уменьше-
ние количества сперматозоидов [1]. По мнению этих авторов, нарушение фертильности у пациентов с ожирением, выявляемое в клинических исследованиях, может быть результатом совокупного влияния экологических и/или генетических факторов [1].
Вместе с тем известно, что уменьшение количества сперматозоидов может быть связано и с активной селекцией их предшественников на разных стадиях сперматогенеза, в том числе селекцией сперматоцитов с нарушениями архитектоники ядер и синапсиса гомологичных хромосом [10].
Особый интерес в условиях развития МС, несомненно, представляет взаимодействие клеток сперма-тогенного ряда с клетками Сертоли, с которыми они связаны на всем пути дифференцировки от спермато-гониев до зрелых сперматид и продвижения от базаль-ного компартмента стенки извитого канальца до апикального. Клетки Сертоли играют ключевую роль в контроле сперматогенеза. Их функции заключаются в обеспечении структурной поддержки и питания развивающихся половых клеток, их самообновления и дифференцировки, селекции и фагоцитоза и ауто-фагии дегенерирующих половых клеток, высвобождении зрелых сперматид из стенки канальца. Однако механизмы селекции сперматогенных клеток в условиях развития МС, влияние МС на диплоидные клетки семенника (сперматогонии и сперматоциты) остаются неясными, так же как и особенности взаимодействия сперматоцитов с клетками Сертоли.
Известно, что как в клетках Сертоли, так и в гаплоидных незрелых половых клетках аутофагия является одним из важнейших механизмов спермиогенеза и может усиливаться в ответ на действие различных факторов. Поэтому в настоящем исследовании особое внимание было уделено выявлению признаков аутофа-гии в диплоидных и гаплоидных клетках семенного канальца у животных с МС, в том числе после его терапии.
Целью настоящего исследования стало комплексное изучение особенностей разных этапов сперматогенеза у самцов крыс в условиях формирования МС и у самцов крыс с экспериментальным МС, получавших сульфатные минеральные воды (МВ) и подвергнутых воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения сверхвысокой частоты (ЭМИ СВЧ) в качестве лечебно-профилактических средств.
Актуальность исследования мейоза у животных с экспериментально смоделированным МС продиктована тем, что мейоз является хромосомной основой репродукции, а ошибки в прохождении его этапов могут приводить к аресту мейоза, формированию анеу-плоидных половых клеток и/или бесплодию.
Материалы и методы
Работа выполнена на 12 нелинейных крысах-самцах массой 180—200 г. Все животные были разделены
на 3 равные группы. В 1-ю группу (контрольную) включены интактные крысы, получавшие стандартный корм в обычном количестве; во 2-ю группу — крысы, питание которых было высококалорийным, с высоким содержанием насыщенных жиров и углеводов (с добавлением 20 % маргарина к стандартному корму и 20 % раствора фруктозы в качестве питья); в 3-ю группу — крысы, питание которых было аналогично питанию крыс 2-й группы, но при этом они получали питьевую сульфатную МВ и подвергались воздействию низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ.
Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к раствору фруктозы и обогащенному жиром корму (2-я и 3-я группы), водопроводной воде и стандартному корму (1-я группа).
Питьевую сульфатную МВ вводили крысам ежедневно внутрижелудочно 1 раз в день через иглу с оливой на конце. Введение начинали на 12-й день от начала моделирования МС, курс состоял из 22 процедур.
Низкоинтенсивному ЭМИ СВЧ (курс из 12 процедур) крыс подвергали после завершения курса МВ. Ежедневно воздействовали ЭМИ СВЧ на поясничную область в зоне проекции надпочечников с помощью аппарата «Акватон-2» (плотность потока мощности 1 мкВт/см2, частота около 1000 МГц). Облучение проводили с расстояния 2—3 см от поверхности кожи.
Животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков на следующий день после окончания курса процедур. Продолжительность эксперимента составляла 60 дней.
Эксперимент выполнен в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755) и требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (Страсбург, 1986).
В первую очередь было проведено гистологическое исследование ткани семенников как подопытных, так и контрольных самцов крыс. Исследование включало иммуно-цитохимический анализ тотальных препаратов синаптонемных комплексов (СК) в распластанных ядрах сперматоцитов I порядка. СК — специфическая только для профазы I мейоза структура ядра сперма-тоцита, которая формируется между 2 синаптирующи-ми гомологичными хромосомами. СК формируется между гомологами вдоль всего мейотического бивалента и служит каркасом для прохождения ключевых событий профазы I мейоза — формирования двуните-вых разрывов ДНК (double strand breaks), их репарации, синапсиса, кроссинговера. Структура СК является признанным индикатором нарушений мейоза у животных и человека [11, 12]. Кроме того, проведено имму-ноцитохимическое и электронно-микроскопическое исследование клеток Сертоли и гаплоидных клеток сперматогенного ряда с особым вниманием к процес-
сам фагоцитоза и аутофагии в них у животных с МС, в том числе подвергнутых терапии с использованием МВ и низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ. Такая терапия способна оказывать общезащитное, антиоксидантное и цитопротекторное действие [13—16]. Предполагалось, что сочетанное действие этих факторов может оказать адаптогенное влияние на процессы сперматогенеза в условиях развития МС. Воздействие ЭМИ СВЧ рассматривается как профилактическое средство при действии ряда патогенных факторов на организм человека и животных [16].
Светооптическое исследование. Семенники фиксировали в жидкости Буэна, заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха с докраской эозином. Для оценки состояния сперматогенеза подсчитывали 100 извитых семенных канальцев (ИСК) с различным количеством генераций половых клеток (от 4 до 0). Индекс сперматогенеза оценивали по определению доли (в %) ИСК с различным числом генераций половых клеток [17]. Для статистической обработки данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента.
Электронно-микроскопическое исследование клеток семенных канальцев. Кусочки ткани семенника фиксировали в 2,5 % растворе глутарового альдегида на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2), постфиксировали в 1 % осмиевой кислоте и заливали в эпон. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Ultracut III (Reichert, Германия) с помощью алмазного ножа (Diatome, Швейцария), контрастировали цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе JEM 1400 (JEOL, Япония).
Проводили иммуноцитохимическое исследование препаратов распластанных ядер первичных спермато-цитов и препаратов давленых клеток семенных канальцев. Препараты распластанных ядер получали по методу J. Navarro и соавт. [18] в собственной модификации [19]. Препараты давленых клеток семенных канальцев получали по методу J. Page и соавт. [20].
В работе использованы следующие первичные антитела: мышиные IgG к белку латеральных элементов СК SCP3 (Abcam, ab97672) (в разведении 1 : 100) или кроличьи IgG к белку SCP3 (Abcam, ab15903) (в разведении 1 : 250); мышиные IgG к маркеру участков хроматина с незавершенной репарацией двунитевых разрывов ДНК и незавершенным синапсисом хромосом — гистону yH2AX (Abcam, ab26350); куриные антитела к вимен-тину (ThermoFisher, PA1-10003) (в разведении 1 : 1000); кроличьи IgG к белку LC3B — маркеру аутофагосом (Abcam, аЬ48394) (в разведении 1 : 250).
В качестве вторичных антител использовали: бычьи IgG против IgG кролика, конъюгированные с FITQ козьи антитела к IgG мыши, конъюгированные с Al-exaFluor 555 или с FITC; куриные антитела к IgG кролика, конъюгированные с AlexaFluor 594; козьи антитела к IgG курицы, конъюгированные с AlexaFluor 488.
Е га Е
Е га Е
Иммуноокрашивание препаратов проводили по методу P.B. Moens, W.C. Earnshaw [21]. Препараты инкубировали с первичными антителами при +4° С в течение ночи; промывали в 3 сменах натрий-фосфатного буфера. Далее наносили вторичные антитела и инкубировали препараты в течение 2—3 ч при +37° С. Препараты промывали в натрий-фосфатном буфере и заключали в среду Vfectashield (Vfector Laboratories, США), содержащую флюоресцирующий голубой краситель DAPI, избирательно окрашивающий ДНК. На иммуноокрашен-ных препаратах каждую клетку фотографировали, записывали нониус. В некоторых случаях проводили 2-й и 3-й раунды иммуноокрашивания.
Препараты анализировали с помощью универсального флюоресцентного микроскопа Axio Imager D1 (Carl Zeiss, Германия), соответствующего стандарту IC2S-оптики, оборудованного объективами Plan-Neo-fluar (40* и 100*), ртутной лампой НВО, черно-белой CCD-камерой накопления сигнала AxioCam HRm/Rev. 2 (Carl Zeiss, Германия), набором комбинированных фильтров для флюорохромов, имеющего выход на компьютер (Fujitsu-Siemens Technology Solutions, Германия). Документирование фотоизображений выполняли с помощью программы Axiovision Rel. 4.6. Изображения обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS6 (Adobe Systems, США).
Результаты
1. Светооптическое исследование. Высококалорийная диета не привела к увеличению массы тела крыс, однако наблюдалась тенденция к увеличению массы семенников (табл. 1).
При морфометрическом исследовании процесса сперматогенеза животных 2-й группы, содержащихся на высококалорийной диете, было установлено, что количество ИСК с 4 генерациями клеток уменьшилось на 14,6 % (р = 0,05), при этом количество ИСК с 3 генерациями по сравнению с контролем, наоборот, увеличилось (табл. 2). Следовательно, происходило нарушение баланса между ИСК с 4 и 3 генерациями, что
Таблица 1. Масса тела и семенников крыс с метаболическим синдромом, в том числе при применении терапии минеральными водами и низкоинтенсивным электромагнитным излучением сверхвысокой частоты
Table 1. Body weight and testes weight in rats with experimentally induced metabolic Syndrome, during balneotherapy and exposure to low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation
Группа Масса тела, г Масса семенников на 100 г массы тела, мг
Group
lestes weight per 100 g oí body weight, mg
i 343,2 ± 12,7 1011,2 ± 55,3
2 343,1 ± 31,1 1046,7 ± 80,9
3 330,1 ± 13,5 964,5 ± 40,1
может указывать на замедление (нарушение) процессов спермиогенеза. При этом следует отметить, что ИСК с 2 и 1 генерацией клеток, т. е. с меньшим содержанием клеток, не наблюдалось. Выявленные сдвиги привели к отчетливому снижению индекса сперматогенеза. При терапии МВ + ЭМИ СВЧ число ИСК с 4 генерациями и индекс сперматогенеза у животных 3-й группы были близки к показателям контроля (табл. 2). Вместе с тем статистически значимых сдвигов по сравнению с показателями крыс 2-й группы не обнаружено, по-видимому, в связи с большим разбросом полученных данных. Кроме того, в этой группе отмечено повышенное число слущенных клеток в просвете канальцев, что может свидетельствовать о слабой их сце-пленности между собой.
2.1. Иммуноцитохимическое исследование распластанных ядер первичных сперматоцитов крыс 1-й группы (контрольной). Исследование распластанных ядер первичных сперматоцитов животных 1-й группы выявило типичную динамику формирования СК от стадии леп-тотены до стадии ранней пахитены. На стадии лепто-тены в ядрах сперматоцитов формировались осевые элементы мейотических хромосом, которые хорошо видны при окрашивании антителами к белку SCP3 — основному белку осевых элементов хромосом и латеральных элементов СК.
Динамику репарации запрограммированных разрывов ДНК при движении клеток от стадии лептотены к стадии диплотены отражает результат окрашивания антителами к фосфорилированному гистону уН2АХ — маркеру участков хроматина, содержащих двунитевые разрывы ДНК. На стадии лептотены антитела к гисто-ну уН2АХ окрашивают весь хроматин, при продвижении к стадии зиготены происходит синапсис гомологичных хромосом, сопровождающийся репарацией двунитевых разрывов ДНК и формированием СК. В местах завершения синапсиса и, следовательно, завершения репарации двунитевых разрывов ДНК гистон уН2АХ отсутствует. На стадии пахитены, когда синап-сис аутосом полностью завершен, гистон уН2АХ виден только на асинаптированных осевых элементах хромосом полового (XY) бивалента (рис. 1а). На стадии диплотены аутосомы десинаптируют, половой бивалент смещается на периферию распластанного ядра, формируя типичное половое тельце (рис. 16). Однако в 16 % ядер сперматоцитов выявлена ассоциация полового бивалента с аутосомами. В единичных ядрах обнаружены мелкие включения.
2.2. Иммуноцитохимическое исследование препаратов давленых клеток семенных канальцев крыс 1-й группы (контрольной). Основной задачей такого исследования был анализ активности процессов фагоцитоза и аутофагии в клетках Сертоли в норме и в условиях эксперимента. У самцов 1-й группы не выявлено признаков дегенерации сперматоцитов и их остатков
Таблица 2. Результаты светооптического исследования срезов семенных канальцев крыс с метаболическим синдромом, в том числе при применении терапии минеральными водами и низкоинтенсивным электромагнитным излучением сверхвысокой частоты
Table 2. Results of a light-optical study of seminal tubules sections in rats with experimentally induced metabolic syndrome, during balneotherapy and exposure to low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation
Группа Количество извитых семенных канальцев, % The number of convoluted seminiferous tubules, % Число слущи- ваний Squamous cells number Spermatogenesis index Среднее количество клеток Сертоли на 1 извитый каналец
Group c 4 генерациями c 3 генерациями Average number of Sertoli cells per 1 convoluted tubule
1 68,70 ± 3,19 31,30 ± 3,19 5,80 ± 3,50 3,69 ± 0,03 6,43 ± 0,21
2 58,70 ± 2,10* 41,30 ± 2,10* 2,30 ± 0,42 3,59 ± 0,02* 7,30 ± 0,38
3 71,00 ± 5,04 29,00 ± 5,04 12,70 ± 7,10 3,71 ± 0,05 8,67 ± 0,71**
*р <0,05; **р <0,01 по сравнению с контролем. *p <0.05; **p <0.01 compared to the control.
5CP3
uH2AX
\
' Ljl-S?
\ Ai - I
J__SA vb
\t • . ■ cm cnt *' т. SCP3 DAPI VIMENTIN
* I . lb. w ' *
ВСП КС
DAP I VIMENTIN
J л 0
ВСП
W Л
Рис. 1. Иммуноцитохимическое исследование распластанных ядер первичных сперматоцитов (СП1) (а, б) и давленых клеток семенных канальцев (в, г) крыс 1-й группы (контрольной): а — пахитена. Аутосомы полностью синаптированы и формируют 20 синаптонемных комплексов (СК-бивалентов). Половые хромосомы (Х и Y) соединены конец в конец. Хроматин Х- и Y-хромосом инактивирован; б — диплотена. Асинапсис латеральных элементов СК. Половой бивалент (XY) формирует типичное половое тельце и занимает периферическое положение в ядре. Препараты окрашены антителами к основному белку осевых элементов хромосом и СКSCP3 (зеленый) и фосфорилированному гистону yH2AX (красный); в, г — сперматоциты I порядка (СП1), клетки Сертоли (КС), половой бивалент (XY), вытянутые сперматиды (ВСП). . Препараты окрашены антителами к виментину — белку промежуточных филаментов (красный), белку SCP3 (зеленый). Сигналы SCP3 не выявлены в клетках Сертоли. Хроматин окрашен DAPI(синий). Масштабный отрезок 1 мкм
Fig. 1. Immunocytochemical study ofspreading nuclei ofprimary spermatocytes (СП1) (а, б) and squash seminiferous tubule cells (в, г) of control animals (1st group): а — pachytene. Autosomes are completely synapsed and form 20 synaptonemal complexes bivalents. The sex chromosomes (Xand Y) are connected end-to-end. Chromatin ofXY chromosomes is inactivated; б — diplotene. Asynapsis of the lateral elements of the synaptonemal complexes. The sexual bivalentforms a typical genital sex body and occupies a peripheral position in the nucleus. The preparations were stained with antibodies to the basic protein of the axial elements of chromosomes and synaptonemal complexes SCP3 (green) and phosphorylated histone yH2AX (red); в, г — primary spermatocytes (СП1), Sertoli cells (КС); sex bivalent (XY), elongated spermatids (ВСП). The preparations were stained with antibodies to vimentin, a protein of intermediatefilaments (red) in the cytoplasm of Sertoli cells. Synaptonemal complexes in the nuclei of spermatocytes are stained with antibodies to the SCP3 protein (green). SCP3 signals were not detected in Sertoli cells. Chromatin is stained with DAPI dye (blue). Bar 1 ^m
E
W
E
а
Е га Е
в фагосомах в клетках Сертоли. Не выявлено признаков аутофагии ни в клетках Сертоли, ни в сперматоцитах (рис. 1в, г).
2.3. Электронно-микроскопическое исследование клеток семенных канальцев крыс 1-й группы (контрольной). Ультраструктура клеток семенных канальцев крыс 1-й группы имеет типичную морфологию. Клетки Сертоли лежат на базальной мембране, уплощенные ядра содержат диффузный хроматин, ядрышко с типичной морфологией, состоящее из фибриллярного центра, компактного гранулярного компонента и ретикулярного компонента. В цитоплазме выявляются митохондрии, лизосомы, вакуоли, единичные аутофагосомы. Выявляются специализированные контакты между клетками Сертоли, являющиеся компонентом гемато-тестикулярного барьера (рис. 2). Незрелые половые клетки (сперматогонии, сперматоциты) имеют обычную ультраструктуру [22].
3.1. Иммуноцитохимическое исследование распластанных ядер первичных сперматоцитов крыс 2-й группы. У животных этой группы не выявлено отклонений в формировании осевых элементов хромосом на стадиях лептотены и зиготены. Однако на стадии пахитены обнаружены значительные нарушения в архитектонике ядер. В ядрах сперматоцитов выявлены множественные включения различной формы (рис. 3а—в). Причем в одних ядрах преобладали крупные включения округлой (или каплевидной) формы (рис. 3а, б), в других — вытянутые структуры, расположенные вдоль СК (рис. 3б). Встречались и единичные мелкие кольцеобразные включения (рис. 3в). Все перечисленные включения интенсивно связывались с антителами к основному белку СК SCP3, что осложняло идентификацию половых (ХY) бивалентов и выявление их связи с аутосомами (рис. 3б). Но в среднем в 40 % ядер сперматоцитов такие ассоциации были выявлены (рис. 3а, в).
3.2. Иммуноцитохимическое исследование препаратов давленых клеток семенных канальцев крыс 2-й группы выявило фрагменты дегенерирующих ядер сперма-тоцитов I порядка (рис. 3д), причем часть из них видна в фагосомах клеток Сертоли, где они обнаруживаются при иммуноокрашивании антителами к белку SCP3 (рис. 3ж). В цитоплазме клеток Сертоли обнаруживается множество аутофагосом, маркером которых является белок LC3B (рис. 3е, ж). Следует отметить, что аутофагосомы выявляются как сперматоцитах, так и в сперматидах (рис. 3з). У самцов 1-й группы такие структуры не выявлялись.
3.3. Электронно-микроскопическое исследование клеток семенных канальцев крыс 2-й группы. Данные ультраструктурного исследования подтверждают результаты иммуноцитохимического. В цитоплазме клеток Сертоли семенников крыс с МС обнаруживаются многочисленные фаголизосомы, содержащие клеточный детрит (рис. 4а). Так как при иммуноокрашивании
Рис. 2. Ультраструктура клеток семенного канальца крысы 1-й группы. Клетка Сертоли лежит на базальной мембране (БМ), ядро (Я) содержит ядрышко (ЯД), в цитоплазме — многочисленные митохондрии (М), лизосомы с электронно-плотным содержимым (ЛЗ) и вакуоли (В). ГТБ — специализированные контакты гематотестикулярного барьера. Масштабный отрезок 10 нм
Fig. 2. The ultrastructure of the seminiferous tubule cells of the control rat (1stgroup). The Sertoli cell lies on the basement membrane (БМ), the nucleus (Я) contains the nucleolus (ЯД), in the cytoplasm there are numerous mitochondria (M), lysosomes with electron-dense contents (ЛЗ) and vacuoles (B). ГТБ — specialized contacts of the blood-testicular barrier. Ваr 10 nm
в фаголизосомах выявляются фрагменты СК, это, вероятно, фагоцитированные сперматоциты. В структуре базальной мембраны, гематотестикулярного барьера и митохондрий не обнаружено отклонений по сравнению с результатами исследования клеток животных 1-й группы. В цитоплазме клеток Сертоли выявлено большое количество липидных включений и лизосом. Аутофагосомы обнаружены в цитоплазме клеток Сертоли и сперматоцитов и имеют характерную морфологию — фрагмент цитоплазмы, окруженный двойной мембраной (рис. 4б). В цитоплазме клеток Сертоли выявлены также фагофоры — двумембранные незамкнутые образования, предшественники аутофа-госом.
4.1. Иммуноцитохимическое исследование распластанных ядер первичных сперматоцитов крыс 3-й группы
выявило множественные нарушения в структуре СК почти во всех пахитенных ядрах. Но они, как правило, они были мельче, чем в сперматоцитах животных
2-й группы. Причем в одних ядрах преобладали многогранные или палочковидные включения (рис. 5а), в других — мелкие кольцеобразные включения (рис. 5б). Встречались и включения, имеющие сетчатое строение. Независимо от формы все они интенсивно окрашивались антителами к белку SCP3. Также следует отметить наличие в ядрах фрагментов СК и ассоциаций XY-би-валента с аутосомами (рис. 5а, б).
4.2. Иммуноцитохимическое исследование клеток семенных канальцев крыс 3-й группы. У животных
3-й группы обнаружена значительная активация аутофагии как в диплоидных клетках — сперматоцитах (рис. 5е)
SCP3
XY
tV
*
t
5CP3
XY
Hr-*^ :
% к -
^4 Ч ^л
• V ^
SCP3
*ê
Л
ОТ
ФСК
LC3B у
it \
% т* V
¿ксзв 1; / ■к С
(
е Л
Рис. 3. Иммуноморфологическое исследование клеток семенных канальцев крысы, содержавшейся на высококалорийной диете (2-й группы): а—в — распластанные ядра первичных сперматоцитов крыс; а, б — в ядрах сперматоцитов, распластанных на стадии пахитены, видны множественные атипичные включения, окрашивающиеся антителами к белку синаптонемных комплексов (СК) SCP3 (желтые звездочки), фрагменты СК; в — кольцеобразная структура в ядре сперматоцита (белая звездочка). На рис. «а» и «в» половые (XY) биваленты ассоциируют с аутосома-ми; г—з — препараты клеток семенных канальцев крыс, окрашенные антителами к белкам SCP3 (зеленый) и белку LCP3 (голубой). Хроматин окрашен DAPI (синий); г — ядра клеток Сертоли (ЯКС) окрашены DAPI; д — фрагменты СК (ФСК), окрашенные антителами к белку SCP3 (зеленый); е — при окрашивании антителами к белку LC3B (голубой) выявлено множество аутофагосом в клетках Сертоли; ж — совмещение рис. «д» и «е»; з — аутофагосомы в цитоплазме удлиненных сперматид (оранжевые стрелки). Масштабный отрезок 1 мкм
Fig. 3. Immunomorphological study of seminiferous tubule cells of rats kept on a high-calorie diet (2nd group): a—в — spread nuclei ofprimary rat spermatocytes; a, б — in the nuclei ofspermatocytes spread out at the pachytene stage, multiple atypical inclusions are visible, immunostaining with antibodies to the CK protein SCP3 (yellow asterisks), fragments of CK; в — an annular structure in the nucleus of a spermatocyte (white asterisk). In fig. "а" and "б", sex (XY) bivalents are associated with autosomes; г—з — preparations of cells of seminiferous tubules of rats. The preparations are stained with antibodies to SCP3 (green) and LCP3 (blue) proteins. Chromatin is stained with DAPI (blue); г — Sertoli cell nuclei (ЯКС) were stained with DAPI dye; д — fragments of synaptonemal complexes (ФСК), stained with antibodies to the SCP3 protein (green); е — immunostaining of the preparation with antibodies to the LC3B protein (blue) reveals many autophagosomes in Sertoli cells; ж — combination and images offig. "д" and "е"; з — autophagosomes in the cytoplasm of elongated spermatids (orange arrows). Bar 1 ^m
и клетках Сертоли (5 г), так и в гаплоидных — округлых и вытянутых сперматидах (рис. 5ж, з) по сравнению с активностью аутофагии у животных 2-й группы. Плотность фокусов белка LC3B в клетках всех типов была гораздо выше, чем у животных 2-й группы (рис. 5г, е—з).
4.3. Электронно-микроскопическое исследование клеток семенных канальцев крыс 3-й группы. Клетки Сертоли и первичные сперматоциты у животных 3-й груп-
пы, как и соответствующие клетки животных 2-й группы, содержат большое количество фаголизосом, липидных капель и лизосом (рис. 5а, в). В цитоплазме клеток Сертоли и сперматоцитов выявлены аутофагосомы, фагофоры (рис. 5б). Базальная мембрана и гематоте-стикулярный барьер имеют типичное строение, не отличающееся от такового у интактных животных. Обращает на себя внимание повреждение митохондрий:
Е га Е
б
а
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
ANDROLOGY
AND GENITAL SURGERY
4
Я fm
I М— л "
JM „ __ WS i ) t
Рис. 4. Ультраструктура клеток семенных канальцев крысы, содержавшейся на высококалорийной диете (2-й группы): а — в цитоплазме клетки Сертоли видно уплощенное ядро (Я), лежащее вблизи базальной мембраны (БМ), липидные капли (Л) и гигантские фаголизосомы (ФЛ). Митохондрии (М) лежат свободно в цитоплазме, часть митохондрий плотно примыкает к липидным каплям (МК). Аутофагосомы (АФ), представляющие собой фрагмент цитоплазмы, окруженный двойной мембраной, обнаружены в клетке Сертоли и в сперматоците (СП); б — фрагмент рис. «а» при большем увеличении. ГТБ — элемент гематотестикулярного барьера; ЛЗ — лизосомы. Масштабный отрезок 10 нм Fig. 4. Ultrastructure of cells of seminiferous tubules of rats kept on a high-calorie diet (2nd group): а — in the cytoplasm of the Sertoli cell, a flattened nucleus (Я) is visible, lying near the basement membrane (БМ); lipid droplets (Л), and giant phagolysosomes (ФЛ). Mitochondria (M) liefreely in the cytoplasm; some mitochondria are tightly adjacent to lipid droplets (MK). Autophagosomes (АФ), which are a fragment of the cytoplasm surrounded by a double membrane, are found in the Sertoli cell and in the spermatocyte (СП); б —fragment of fig. "a" at higher magnification. ГТБ — an element of the blood-testicular barrier; ЛЗ — lysosomes. Bar 10 nm
E
W
E
SCP3 *
t- » * f »* XY
• ъ г *
у * •
¿И
SCP3 Vimentin
DAPI- КС
ЯКС
*
* -
в - В
CP3 ЮВ
SCP3
LC3B LC3B
* 1
cm ■ 5 t cm * F J
LC3B
е ^ ж ^LT я '
д
Рис. 5. Иммуноцитохимическое исследование распластанных ядер первичных сперматоцитов (а, б) и давленых клеток семенных канальцев (в—з) крыс, содержавшихся на высококалорийной диете, получавших минеральную воду и подвергавшихся воздействию электромагнитного излучения сверхвысокой частоты (3-я группа): а — пахитена. Атипичные структуры в ядре сперматоцита (желтые звездочки) и множественные фрагменты синаптонемных комплексов (СК), окрашенные антителами к белку SCP3 (зеленый); б — пахитена. Множественные кольцеобразные структуры (белые звездочки), окрашенные антителами к белку SCP3 (зеленый). XY — половой СК-бивалент; в — в цитоплазме клеток Сертоли (КС) среди филаментов, окрашенных антителами к виментину (красный) видны фрагменты СК (зеленые стрелки), окрашенные антителами к белку SСP3 (зеленый). ЯКС — ядро клетки Сертоли; г — та же клетка, что и на рис. «в». Множество аутофагосом в цитоплазме клеток Сертоли, окрашенных антителами к белку LC3B; д — ядро давленого первичного сперматоцита (СП1), в котором видны остатки СК; е — та же клетка, что на рис. «д». Высокая плотность аутофагосом, маркированных антителами к белку к белку LC3B, в цитоплазме сперматоцита; ж — множество аутофагосом, окрашенных антителами к LC3B, в округлой сперматиде; з — аутофагосомы в цитоплазме удлиненной сперма-тиды. Хроматин окрашен DAPI(синий). Масштабный отрезок 1 мкм
Fig. 5. Immunocytochemical study of spreading nuclei ofprimary spermatocytes (a, б) and cells of squashed preparations of testicular tubules (в—з) obtainedfrom rats kept on a high-calorie diet and receiving balneotherapy and exposure to low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation (3rd group): a — pachytene. Atypical structures in the nucleus of a spermatocyte (yellow asterisks) and multiple synaptonemal complexes (CK) fragments stained with antibodies to SCP3 (green); б — pachytene. Multiple ring-shaped structures (white asterisks), stained with antibodies to SCP3 protein (green). XY— sex SC bivalent; в — in the cytoplasm of Sertoli cells (КС), among the filaments stained with antibodies to vimentin (red), fragments of SC (green arrows) are visible, stained with antibodies to the SCP3 protein (green); г — the same cell as in fig."в". Many autophagomas are seen in the cytoplasm of Sertoli cells, stained with antibodies to the LC3B protein; ЯКС — the nucleus оf Sertoli cell; д — the nucleus of the squashed spermatocyte (СП1), in the nucleus of which the remains of SC are visible; е — the same cell as in fig. "д". High density of autophagosomes, marked with antibodies to the protein to the LC3B protein, in the cytoplasm of the spermatocyte; ж — multiple autophagosomes (LC3B) in a rounded spermatid. Autophagosomes in the cytoplasm of an elongated spermatid. Chromatin is stained with DAPI (blue). Bar 1 nm
а
г
АНДРОЛОГИЯ
И ГЕНИТАЛЬНАЯ ХИРУРГИЯ
ANDROLOGY
AND GENITAL SURGERY
4
« «■
-"tSSS?! . s - ШУ Ж .Г
я
ретт Gr
i-jig I
г
i
В Ii
Рис. 6. Электронная микроскопия клеток семенных канальцев крыс, содержавшихся на высококалорийной диете, получавших минеральную воду и подвергавшихся воздействию электромагнитного излучения сверхвысокой частоты (3-я группа): а — в клетке Сертоли выявлены фаголизосо-мы (ФЛ), содержащие лизированные клетки. Аутофагосома (АФ) видна в сперматоците (СП). Я — ядро клетки Сертоли; М — митохондрии с электронно-прозрачным матриксом. Масштабный отрезок 10 нм; б — фрагмент цитоплазмы клетки Сертоли. Масштабный отрезок 2 нм; В фаголизосоме выявлен конгломерат митохондрий (МК). Двумембранный серповидный фагофор — предшественник аутофагосомы — виден в цитоплазме клетки Сертоли; в — фрагмент цитоплазмы сперматоцита. В цитоплазме видны лизосомы (Л) и митохондрии, структура которых аналогична структуре митохондрий в клетке Сертоли. ГТБ — специализированные контакты гематотестикулярного барьера. Масштабный отрезок 2 нм; г — фрагмент цитоплазмы клетки Сертоли с митосомой (АМ) — аутофагосомой, окруженной двойной мембраной и содержащей поврежденную митохондрию. Масштабный отрезок 2 нм
Fig. 6. Electron microscopy ofseminiferous tubule cells ofrats kept on a high-calorie diet and receiving balneotherapy and exposure to low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation (3"1 group): a—phagolysosomes (ФЛ) containing lysed cells were found in the Sertoli cell. Autophagosome (АФ) is visible in the spermatocyte (СП). Я — the nucleus of the Sertoli cell; M — mitochondria with an electron-transparent matrix. Bar 10 nm; б — fragment of the Sertoli cell cytoplasm of the A conglomerate of mitochondria (МК) is detected in phagolysosomes. The two-membrane sickle-shaped phagophore, the precursor of the autophagosome, is visible in the cytoplasm of the Sertoli cell. Bar 2 nm; в —fragment of the cytoplasm of the spermatocyte. In the cytoplasm, lysosomes (Л) and mitochondria are visible, the structure of which is similar to the structure ofmitochondria in the Sertoli cell. ГТБ — specialized contacts of the blood-testicular barrier. Bar 2 nm; г — afragment of the cytoplasm of the Sertoli cell with mitosome (AM) — an autophagosome surrounded by a double membrane and containing damaged mitochondria. Bar 2 nm
они имеют округлую форму, электронно-прозрачный матрикс и лизированные кристы (рис. 5б). Поврежденные митохондрии обнаружены как в фаголизосомах (рис. 5б), так и в аутофагосомах (митосомах) (рис. 5г).
Обсуждение
При электронно-микроскопическом и иммуноци-тохимическом исследовании клеток семенных канальцев половозрелых крыс с экспериментально смоделированным МС выявлена активация процессов фагоцитоза, митофагии и аутофагии в клетках Сертоли, а также процесса аутофагии в первичных сперматоцитах, округлых и вытянутых сперматидах. После терапии МВ и ЭМИ СВЧ животных в условиях развития МС наблюдается еще большая активация этих процессов.
Аутофагия — это путь выживания клеток путем очистки от клеточных компонентов, поврежденных окислительным стрессом, перегрузки липидами. Ау-тофагия характеризуется образованием изолированных мембранами структур, которые охватывают область аутофагосом. Аутофагосомы сливаются с лизосомами, формируя фаголизосомы, содержимое которых переваривается лизосомальными ферментами [23]. Ауто-
фагическая элиминация поврежденных митохондрий (митофагия) является механизмом выживания при воздействии на клетки различных повреждающих агентов [24]. Поскольку клетки Сертоли играют центральную роль в выживании половых клеток, их гибель может привести к заметной утрате половых клеток и бесплодию [25]. Эффективность реакций аутофагии и мито-фагии помогает выживанию клеток Сертоли в условиях действия повреждающих факторов [26], обусловливая их устойчивость.
В настоящем исследовании выявлены значительные изменения митохондрий после действия ЭМИ СВЧ, которые выражались в просветлении матрикса и изменении формы митохондрий и разрушении крист. Возможно, этим объясняется активация аутофагии и митофагии после терапии. В то же время, как показано нами при изучении репаративных процессов в печени крыс с МС, при действии МВ и ЭМИ СВЧ в митохондриях гепатоцитов наблюдали, напротив, уплотнение матрикса и, следовательно, возрастание их биоэнергетического потенциала [27]. По-видимому, требуются различные режимы применения ЭМИ СВЧ для гепатоцитов и более чувствительной тестикулярной
Е га Е
Е га Е
ткани, что следует учитывать, разрабатывая методики физиотерапии.
Доказательства того, что именно первичные спер-матоциты подвергаются деградации, а их фрагменты фагоцитируются клетками Сертоли, получены нами при иммуноокрашивании препаратов давленых клеток семенных канальцев. В таких препаратах в цитоплазме клеток Сертоли среди цитоплазматических филамен-тов, окрашенных антителами к виментину, отчетливо видны фагосомы, содержимое которых окрашивается антителами к белку SCP3 — основному белку осевых элементов мейотических хромосом и латеральных элементов сформированных СК. Дегенерация части первичных сперматоцитов на стадии пахитены хорошо объясняется тем, что в 39 % распластанных ядер первичных сперматоцитов выявляется ассоциация половых бивалентов с аутосомами и нарушение формирования структуры полового тельца. Известно, что это нарушение является маркером пахитенного ареста сперматоцитов. В результате ареста на стадии пахите-ны их дифференцировка прекращается и они вступают в апоптоз [28, 29]. Большое количество фаголизосом, содержащих клеточный детрит, скорее всего апопто-тических клеток, подтверждает результаты иммунохи-мического окрашивания.
Достаточно критичным для продолжения диффе-ренцировки сперматоцитов считается и нарушение архитектоники пахитенных ядер. Следует подчеркнуть, что в ядрах сперматоцитов наблюдалось формирование крупных включений разнообразной формы, в том числе кольцевых структур. Такие структуры окрашивались антителами к белку SCP3. У самцов 1-й (контрольной) группы такие структуры не выявлялись. Ассоциации полового бивалента с аутосомами встречались в 16 % пахитенных ядер. У крыс с МС ассоциация аутосом с ХY-бивалентами обнаружена чаще — в 40—50 % ядер. У самцов с МС после терапии МВ + ЭМИ СВЧ крупные включения имели вид неправильных многоугольников, а количество кольцеобразных структур в ядрах сперматоцитов значительно возросло. Природа этих нарушений остается неясной. Следует подчеркнуть, что в ядрах клеток животных 3-й группы встречались фрагменты СК, что может приводить к формированию неполноценных половых клеток.
При этом у животных всех групп в ядрах сперма-тогониев и ранних сперматоцитов на стадиях лептотены-зиготены никаких нарушений обнаружить не удалось.
Иными словами, обновление пула сперматогенных клеток поддерживается у животных всех групп. Более того, по данным светомикроскопического исследования, количество ИСК у самцов 2-й и 3-й групп сохранялось на высоком уровне, а у самцов 3-й группы было больше, чем у животных 2 -й группы и даже 1-й группы.
Естественно, возникает вопрос о механизмах, обеспечивающих парадоксально высокую сохранность сперматогенеза у животных с наиболее выраженными на стадии пахитены профазы I мейоза нарушениями. На основании полученных результатов мы вынуждены ограничиться предположением о том, что сохранение высокого индекса сперматогенеза может быть связано с высокой активностью аутофагии как в клетках Сер-толи, так и в диплоидных и гаплоидных клетках спер-матогенного ряда. Причем признаки аутофагии были наиболее ярко выражены в клетках Сертоли, сперма-тоцитах и сперматидах именно у животных 3-й группы. В научной литературе имеются данные о высокой токсичности насыщенных жирных кислот для клеток Сер-толи и активации в них программы апоптоза при экспериментально вызванном ожирении [30]. Аутофагия — это процесс переработки собственных компонентов клетки, поврежденных органелл, долгоживущих белков в ауто-фагосомах. Причем аутофагия может запускаться как компенсаторный механизм, поставляющий питание клетке из эндогенных источников, так и как механизм самоликвидации или выживания клетки в стрессовых условиях. В нормальной клетке с помощью аутофагии осуществляется обновление органелл.
Активация аутофагии в клетках Сертоли и спермато-цитах в ответ на действие самых разных повреждающих факторов описано на экспериментальных моделях [31].
Заключение
Активация аутофагии может быть важной частью обеспечения жизнеспособности клеток Сертоли и поддержки жизнеспособности половых клеток в стрессовых ситуациях, в том числе и при МС. По-видимому, аутофагия является адаптивным механизмом, обеспечивающим удаление остатков апоптических сперма-тогенных клеток, подвергшихся селекции в результате развития МС. Возможно, именно активация апоптоза и аутофагии, выявленная нами, объясняет данные других авторов, сообщивших о снижении количества сперматозоидов в эпидидимисах крыс и мышей при моделировании МС [1, 9].
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Gömez-Ellas M.D., Rainero Caceres T.S., Giaccagli M.M. et al. Association between high-fat diet feeding and male fertility in high reproductive performance
mice. Sci Rep 2019;9(1):18546. DOI: 10.1038/s41598-019-54799-3. 2. Carlsen E., Giwercman A., Keiding N., Skakkeback N.E. Evidence
for decreasing quality of semen during past 50 years. Br Med J 1992;305:609-13. DOI: 10.1136/bmj.305.6854.609.
3. Foresta C., Moro E., Ferlin A.
Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis. Endocrine Reviews 2001;22(2):226-39. DOI: 10.1210/edrv.22.2.0425.
4. Епанчинцева Е.А., Селятицкая В.Г., Свиридова М.А., Лутов Ю.В. Медико-социальные факторы риска бесплодия у мужчин. Андрология и генитальная хирургия 2016;17(3):47-53.
DOI: 10.17650/2070-9781-2016-17-347-53. [Epanchintseva Е.А., Selyatitska-ya V.G., Sviridova M.A., Lutov Yu.V. Sociomedical risk factors for male infec-undity. Andrologiya i genital'naya khirur-giya = Andrology and Genital Surgery 2016; 17(3):47-53. (In Russ.)]. DOI: 10.17650/ 2070-9781-2016-17-3-47-53.
5. Campbell J.M., Lane M., Owens J.A., Bakos H.W. Paternal obesity negatively affects male fertility and assisted reproduction outcomes: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2015;31(5):593-604. DOI: 10.1016/j.rbmo. 2015.07.012.
6. Belloc S., Cohen-Bacrie M., Amar E. et al. High body mass index has a deleterious effect on semen parameters except morphology: results from
a large cohort study. Fertil Steril
2014;102(5):1268-73.
DOI: 10.1016/j.fertnstert.2014.07.1212.
7. Davidson L.M., Millar K., Jones C. et al. Deleterious effects of obesity upon the hormonal and molecular mechanisms controlling spermatogenesis and male fertility. Hum Fertil (Camb) 2015;18(3):184-93. DOI: 10.3109/14647273.2015.1070438.
8. MacDonald A.A., Herbison G.P., Showell M., Farquhar C.M. The impact of body mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a systematic review with meta-analysis. Hum Reprod 2010;16(3):293-311. DOI: 10.1093/humupd/dmp047.
9. Vigueras-Villasenor R.M., Rojas-Castaneda J.C., Chavez-Saldana M. et al. Alterations in the spermatic function generated by obesity in rats. Acta Histochem 2011;113(2):214-20.
DOI: 10.1016/j.acthis.2009.10.004.
10. Turner J.M.A., Mahadevaiah S.K., Fernandez-Capetillo O. et al. Silencing of unsynased meiotic chromosomes in the mouse. Genetics 2005;37(1):41-7. DOI: 10.1038/ng1484.
11. Kolomiets O.L., Atsaeva M.M., Dadashev S.Ya. et al. Damage
to synaptonemal complex structure and peculiarities of selection of mouse spermatocytes I at response to drug administration. Russian Journal of Genetics 2013;49(11):1098-106. DOI: 10.1134/S1022795413110100.
12. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Синап-тонемный комплекс - индикатор мей-оза и изменчивости хромосом. М., 2007. 358 с. [Bogdanov Yu.F., Kolomiets O.L. Synaptonemal complex as indicator
of chromosome variability. Moscow, 2007. 358 p. (In Russ.)].
13. Королев Ю.Н., Никулина Л.А., Гениа-тулина М.С. и др. Профилактика ранних постстрессорных нарушений в семенниках крыс при применении питьевой сульфатной минеральной воды в сочетании с цинком и кремнием. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2011;(5):33-5. [Korolev Yu.N., Nikulina L.A., Geniatulina M.S. et al. Prevention of early post-stress disorders in rat testicles under effect
of drinking sulfate mineral water containing zinc and silicium. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoy fizicheskoy kultury = Problems of Balneology, Physiotherapy, and Exercise Therapy 2011;(5):33-5. (In Russ.)].
14. Королев Ю.Н., Курило Л.Ф., Гениату-лина М.С. и др. Пострадиационные нарушения в семенниках крыс и их профилактика при применении питьевой сульфатной минеральной воды. Проблемы репродукции 2003;9(6):16—9. [Korolev Yu.N., Kurilo L.F., Geniatulina M.S. et al. Post-radiation disorders
in the testes of rats and their prevention when using drinking sulphate mineral water. Problemy reproduktsii = Problems of Reproduction 2003;9(6):16-9. (In Russ.)].
15. Королев Ю.Н., Гениатулина М.С., Никулина Л.А., Михайлик Л.В. Ультраструктурные проявления регенеративных процессов в клетках Сер-толи при действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения
в условиях стресса у крыс. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2015;92(3): 40-4. [Korolev Yu.N., Geniatulina M.S., Nikulina L.A., Mikhailik L.V. The ultrastructural manifestations of the regenerative processes in the Sertoli cells under the action of low-intensity electromagnetic radiation in the rats subjected to stress. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoy fizicheskoy kultury = Problems of Balneology, Physiotherapy, and Exercise Therapy 2015;92(3):40-4. (In Russ.)].
16. Королев Ю.Н., Никудина Л.А., Михайлик Л.В. Метаболические и ультраструктурные механизмы адаптации при первично-профилактическом действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения в условиях нормы и радиации. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2019;(5):44-50. [Korolev Yu.N., Nikudina L.A., Mikhailik L.V. Metabolic and ultrastructural adaptation mechanisms during the primary prophylactic action
of low-intensity electromagnetic radiation under normal and radiation conditions. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoy fizicheskoy kultury = Problems of Balneology, Physiotherapy, and Exercise Therapy 2019;(5):44-50. (In Russ.)].
17. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф. Морфо-метрические методы в оценке функционального состояния семенников. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии 1983;84(3):66-72. [Ukhov Yu.I., Astrakhantsev A.F. Morphometric methods in assessing the functional state of the testes. Arkhiv anatomii, gistologii
i embriologii = Archive of Anatomy, Histology and Embryology 1983;84(3):66-72. (In Russ.)].
18. Navarro J., Vidal F., Guitart M., Egozcue J. A method for the sequential study of synap-tonemal complexes by light and electron microscopy. Hum Genet 1981;59(4): 419-21. DOI: 10.1007/BF00295483.
19. Kolomiets O.L., Matveevsky S.N., Bakloushinskaya I.Y. Sexual dimorphism in prophase I of meiosis in the Northern mole vole (Ellobius talpinus Pallas, 1770) with isomorphic (XX) chromosomes
in males and females. Comp Cytogenet 2010;4(1):55-66.
DOI: 10.3897/compcytogen.v4i1.25.
20. Page J., Suja J.A., Santos J.L., Rufas J.S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res 1998;6(8):639-42. DOI: 10.1023/a:1009209628300.
21. Moens P.B., Earnshaw W.C. Anti-topoiso-merase II recognizes meiotic chromosome cores. Chromosoma 1989;98(5):317-22. DOI: 10.1007/BF00292383.
22. Kerr J.B. Ultrastructure of the seminiferous epithelium and intertubular tissue of the human testis. J Electron Microsc Tech 1991;19(2):215-40.
DOI: 10.1002/jemt.1060190208.
23. Kroemer G., Marino G., Levine B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell 2010;40(2):280-93. DOI: 10.1016/j.molcel.2010.09.023
24. Eid N., Ito Y., Horibe A., Hamaoka H., Kondo Y.A. Method for in vivo induction and ultrastructural detection of mitophagy in Sertoli cells. Methods Mol Biol 2018;1748: 103-12. DOI: 10.1007/978-1-4939-7698-0_9.
25. Oliveira P.F., Martins A.D., Moreira A.C. et al. The Warburg effect revisited — lesson from the Sertoli cell. Med Res Rev 2015; 35(1):126—51. DOI: 10.1002/med.21325.
26. Bao Z.Q., Liao T.T., Yang W.R. et al. Heat stress-induced autophagy promotes lactate secretion in cultured immature boar Sertoli cells by inhibiting apoptosis and driving SLC2A3, LDHA, and SLC16A1 expression. Theriogenology 2017;87:339-48. DOI: 10.1016/j. theriogenology.2016.09.016.
27. Королев Ю.Н., Никулина Л.А., Ми-хайлик Л.В. Влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения на семенники крыс при метаболическом синдроме. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2020;97(6-2):59-60. [Korolev Yu.N., Bragina E.E., Nikulinа L.A., Mikhailik L.V. Feature of action
of low-intensive electromagnetic radiation
E
W
E
under the development of metabolic syndrome (experimental study). Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoy fizicheskoy kultury = Problems of Balneology, Physiotherapy, and Exercise Therapy 2020;97(6-2):59-60. (In Russ.)].
28. Homolka D., Jansa P., Forejt J. Genetically enhanced asynapsis of autosomal chromatin promotes transcriptional dysregulation and meiotic failure.
Chromosoma 2012;121(1):91—104. DOI: 10.1007/s00412-011-0346-5.
29. Turner J., Mahadevaiah S., Fernandez-Capetillo O. et al. Silencing of unsynased meiotic chromosomes in the mouse. Genetics 2005;37(1):41-7.
DOI: 10.1038/ng1484.
30. Hu X., Ge X., Liang W. et al. Effects of saturated palmitic acid and omega-3 polyunsaturated fatty acids on Sertoli cell
apoptosis. Syst Biol Reprod Med
2018;64(5):368-80.
DOI: 10.1080/19396368.2018.1471554.
31. Horibe A., Eid N., Ito Y., Otsuki Y., Kondo Y. Ethanol-induced autophagy in Sertoli cells is specifically marked at androgen-dependent stages of the sper-matogenic cycle: potential mechanisms and implications. Int J Mol Sci 2019;20(1): 184. DOI: 10.3390/ijms20010184.
Вклад авторов
О.Л. Коломиец: разработка дизайна иммуноцитохимического исследования тестикулярной ткани, анализ полученных результатов, обзор литературы по теме исследования, написание текста статьи;
Е.Е. Брагина: разработка дизайна электронно-микроскопического исследования клеток тестикулярной ткани, анализ полученных результатов, обзор литературы по теме исследования, написание текста статьи;
A.А. Кашинцова: иммуноцитохимическое исследование клеток тестикулярной ткани, анализ полученных результатов и данных литературы, написание текста статьи;
B.Е. Спангенберг: иммуноцитохимическое исследование и анализ полученных результатов;
Л.А. Никулина: проведение эксперимента по моделированию метаболического синдрома на животных, разработка дизайна и проведение гистологического исследования, статистический анализ данных;
Л.В. Михайлик: проведение эксперимента по моделированию метаболического синдрома на животных, обзор литературы по теме исследования, написание текста статьи;
Ю.Н. Королев: разработка дизайна исследования, проведение эксперимента по моделированию метаболического синдрома на животных, написание текста статьи. Authors' contributions
O.L. Kolomiets: developing the design of an immunocytochemical examination of testicular tissue, analysis of the results, reviewing of the literature on the article's theme, article writing;
E.E. Bragina: developing the design of electron microscopic examination of testicular cells, analysis of the results, reviewing of the literature the article's theme, article writing;
A.A. Kashintsova: immunocytochemical examination of testicular cells, analysis of the results and literature data, article writing; V.E. Spangenberg: immunocytochemical examination and analysis of the results;
L.A. Nikulina: conducting an experiment on modeling the metabolic syndrome in animals, developing the design and conducting a histological examination, statistical analysis;
L.V. Mikhailik: conducting an experiment on modeling the metabolic syndrome in animals, reviewing the literature on the topic of the study, article writing; Yu.N. Korolev: developing the study design, conducting an experiment on modeling the metabolic syndrome in animals, article writing.
ORCID авторов / ORCID of authors
О.Л. Коломиец / O.L. Kolomiets: https://orcid.org/0000-0002-1915-0039 Е.Е. Брагина / E.E. Bragina: https://orcid.org/0000-0002-8422-4962
A.А. Кашинцова / A.A. Kashintsova: https://orcid.org/0000-0001-9715-381X
B.Е. Спангенберг / V.E. Spangenberg: https://orcid.org/0000-0002-6623-9124 Л.А. Никулина / L.A. Nikulina: https://orcid.org/0000-0003-2200-868X Л.В. Михайлик / L.V. Mikhailik: https://orcid.org/0000-0002-9717-4749 Ю.Н. Королев / Yu.N. Korolev: https://orcid.org/0000-0001-5530-1538
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование частично выполнено в рамках госзадания № 0112-2019-0002 Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, за счет средств гранта РФФИ № 17-00-00429 КОМФИ, программы развития Московского государственного университета 5.13. Funding. The study was partially funded within the framework of State task No. 0112-2019-0002 of the N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences of the Russian Academy of Sciences, at the expense of the RFFR grant No. 17-00-00429 of the COMF1, the development program of Moscow State University 5.13.
Соблюдение правил биоэтики
Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей. Compliance with principles of bioethics
The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences. The study was performed in accordance with ethical principles adopted by the European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes.
Статья поступила: 22.11.2020. Принята к публикации: 29.12.2020. Article submitted: 22.11.2020. Accepted for publication: 29.12.2020.
