Научная статья на тему 'Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из эякулята как часть протокола обследования мужчин с бесплодием в браке'

Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из эякулята как часть протокола обследования мужчин с бесплодием в браке Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
912
102
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
БЕСПЛОДИЕ / СПЕРМАТОГЕНЕЗ / ПАТОЗООСПЕРМИЯ / АЗООСПЕРМИЯ / РЕПРОДУКЦИЯ / МЕЙОЗ / ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ / ЭЯКУЛЯТ / : INFERTILITY / SPERMATOGENESIS / PATHOZOOSPERMIA / AZOOSPERMIA / REPRODUCTION / MEIOSIS / GERM CELLS / EJACULATE

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Андреева М.В., Хаят С.Ш., Шилейко Л.В., Черных В.Б., Штаут М.И.

Мужской фактор вносит значительный вклад в проблему бесплодного брака. Причиной бесплодия может быть изменение морфологических и/или функциональных характеристик половых клеток. В работе представлены результаты исследования 122 образцов эякулята, из них 55 образцов с нормальной (≥ 15 млн/мл) концентрацией сперматозоидов (1-я группа) и 67 образцов с концентрацией < 0,01) в образцах эякулята с нормальной концентрацией сперматозоидов (1-я группа), что указывает на наличие выраженного блока сперматогенеза на стадии профазы I мейоза. В образцах эякулята 2-й группы (с концентрацией < 1 млн/мл (криптозооспермия или тяжелая форма олигозооспермии) (2-я группа). Для всех выполняли стандартное спермиологическое исследование (WHO, 2010) и количественный кариологический анализ незрелых половых клеток эякулята (ККА НПК) (патент Л.Ф. Курило № 2328736,2007 г.). Выявлено, что показатели ККА НПК значимо различаются в 2 проанализированных группах. Доля НПК на стадиях прелептотены-зиготены и пахитены достоверно выше (p < 0,01) в образцах эякулята с нормальной концентрацией сперматозоидов (1-я группа), что указывает на наличие выраженного блока сперматогенеза на стадии профазы I мейоза. В образцах эякулята 2-й группы (с концентрацией< 1 млн/мл) значимо выше доля сперматоцитов II и сперматид, что говорит о наличии выраженного блока сперматогенеза на стадии формирования сперматозоидов (спермиогенеза). В 58 % образцов эякулята из 1-й группы индекс НПК превышал нормативные показатели. В большинстве образцов 2-й группы индекс НПК не рассчитывали из-за недостаточного количества сперматозоидов. У всех обследованных пациентов с подозрением на азооспермию при ККА НПК были обнаружены сперматозоиды (44 образца из 2-й группы). Таким образом, пациентам с предполагаемой азооспермией выполнение ККА НПК может быть рекомендовано как альтернатива диагностической биопсии яичка или его придатка. Оценка НПК на разных стадиях сперматогенеза, неинвазивность данного метода, относительная быстрота выполнения и возможность многократного повторения исследования без риска для здоровья пациента делают метод ККА НПК уникальным при оценке состояния сперматогенеза и его динамики.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Андреева М.В., Хаят С.Ш., Шилейко Л.В., Черных В.Б., Штаут М.И.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

QUANTITATIVE KARYOLOGICAL ANALYSIS OF IMMATURE GERM CELLS FROM EJACULATE AS PART OF EXAMINATION OF PATIENTS WITH INFERTILITY IN MARRIAGE

Male factor contributes significantly to the problem of infertile marriages. Alterations of morphological and/or functional characteristics of germ cells can result in infertility. We analyzed 122 semen samples – 55 samples with normal (≥ 15 million/ml) sperm concentration (group I) and 67 samples with cryptozoospermia or severe oligozoospermia (concentration < 1 million/ml, group II). Standard semen analysis and quantitative karyological analysis of immature germ cells from ejaculate (QKA IGC) (patent L.F. Kurilo № 2328736, 2007) were performed for all samples. The results of QKA IGC are significantly different in the two groups analyzed. The proportion of IGC at stages of preleptotene-zygotene and pachytene is verified to be higher (p < 0.01) in the sperm samples with normal concentration (group 1), indicating spermatogenesis arrest at prophase I of meiosis. In the semen samples of group 2 (patients with cryptozoospermia or with severe oligozoospermia, sperm concentration < 1 million/ml) proportion of spermatocytes II and spermatids is significantly higher than in the group with normal sperm concentration, that indicates the spermatogenesis arrest at the stage of sperm formation (spermiogenesis). IGC index in 58 % of the samples from the group I is higher than normal IGC index. For the majority of the samples from the group II the IGC index was not estimated because of lack of spermatozoa. In all sperm samples with suspected azoospermia examined through QKA IGC spermatozoa were identified (44 samples from group II). Thus, if azoospermia is suspected, QKA IGC can be recommended to patients as an alternative to diagnostic testicular or epididimal biopsy. QKA IGC is unique in the assessment of the of spermatogenesis dynamics, as it is precise, safe, non-invasive and time-saving method that allows multiple repeated evaluation of IGC at different stages of spermatogenesis.

Текст научной работы на тему «Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из эякулята как часть протокола обследования мужчин с бесплодием в браке»

Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток из эякулята как часть протокола обследования

мужчин с бесплодием в браке

М.В. Андреева1, С.Ш. Хаят1, Л.В. Шилейко1, В.Б. Черных1, 2, М.И. Штаут1, Т. В. Остроумова1, Т.М. Сорокина1, Л.Ф. Курило1

1ФГБНУ«Медико-генетический научный центр»; Россия, 115478 Москва, ул. Москворечье, 1; 2ФГБОУВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России;

Россия, 117997Москва, ул. Островитянова, 1

Контакты: Любовь Федоровна Курило kurilo@med-gen.ru

Мужской фактор вносит значительный вклад в проблему бесплодного брака. Причиной бесплодия может быть изменение морфологических и/или функциональных характеристик половых клеток. В работе представлены результаты исследования 122 образцов эякулята, из них 55 образцов с нормальной (> 15млн/мл) концентрацией сперматозоидов (1-я группа) и 67 образцов с концентрацией <1 млн/мл (криптозооспермия или тяжелая форма олигозооспермии) (2-я группа). Для всех выполняли стандартное спермиологическое исследование (WHO, 2010) и количественный кариологический анализ незрелых половых клеток эякулята (ККА НПК) (патент Л.Ф. Курило № 2328736, 2007 г.). Выявлено, что показатели ККА НПК значимо различаются в 2 проанализированных группах. Доля НПК на стадиях прелептотены-зиготены и пахитены достоверно выше (p < 0,01) в образцах эякулята с нормальной концентрацией сперматозоидов (1-я группа), что указывает на наличие выраженного блока сперматогенеза на стадии профазы Iмейоза. В образцах эякулята 2-й группы (с концентрацией <1 млн/мл) значимо выше доля сперматоцитов II и сперматид, что говорит о наличии выраженного блока сперматогенеза на стадии формирования сперматозоидов (спермиоге-неза). В 58 % образцов эякулята из 1-й группы индекс НПК превышал нормативные показатели. В большинстве образцов 2-й группы индекс НПК не рассчитывали из-за недостаточного количества сперматозоидов.

У всех обследованных пациентов с подозрением на азооспермию при ККА НПК были обнаружены сперматозоиды (44 образца из 2-й группы). Таким образом, пациентам с предполагаемой азооспермией выполнение ККА НПК может быть рекомендовано как альтернатива диагностической биопсии яичка или его придатка. Оценка НПК на разных стадиях сперматогенеза, неинвазивность данного метода, относительная быстрота выполнения и возможность многократного повторения исследования без риска для здоровья пациента делают метод ККА НПК уникальным при оценке состояния сперматогенеза и его динамики.

Ключевые слова: бесплодие, сперматогенез, патозооспермия, азооспермия, репродукция, мейоз, половые клетки, эякулят

DOI: 10.17650/2070-9781-2017-18-1-62-69

Quantitative karyological analysis of immature germ cells from ejaculate as part of examination of patients

with infertility in marriage

M.V. Andreeva1, S.Sh. Khayat1, L. V. Schileiko1, V.B. Chernykh2, M.I. Shtaut1, T. V. Ostroumova1, T.M. Sorokina1, L.F. Kurilo1

1 Research Centre for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow 115478, Russia; .a 2Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow 117997, Russia £ Male factor contributes significantly to the problem of infertile marriages. Alterations of morphological and/orfunctional characteristics of germ w cells can result in infertility. We analyzed 122semen samples — 55samples with normal (> 15million/ml) sperm concentration (group I) and 67 £ samples with cryptozoospermia or severe oligozoospermia (concentration < 1 million/ml, group II). Standard semen analysis and quantitative " karyological analysis of immature germ cells from ejaculate (QKAIGC) (patent L.F. Kurilo № 2328736, 2007) were performedfor all samples. ^ The results of QKA IGC are significantly different in the two groups analyzed. The proportion of IGC at stages of preleptotene-zygotene and — pachytene is verified to be higher (p < 0.01) in the sperm samples with normal concentration (group 1), indicating spermatogenesis arrest at s prophase I of meiosis. In the semen samples of group 2 (patients with cryptozoospermia or with severe oligozoospermia, sperm concentration < ja 1 million/ml) proportion of spermatocytes II and spermatids is significantly higher than in the group with normal sperm concentration, that ^ indicates the spermatogenesis arrest at the stage of sperm formation (spermiogenesis). IGC index in 58 % of the samples from the group I is higher w than normal IGC index. For the majority of the samples from the group II the IGC index was not estimated because of lack of spermatozoa. = In all sperm samples with suspected azoospermia examined through QKA IGC spermatozoa were identified (44 samples from group II).

Thus, if azoospermia is suspected, QKA IGC can be recommended to patients as an alternative to diagnostic testicular or epididimal biopsy.

3 QKA IGC is unique in the assessment of the of spermatogenesis dynamics, as it is precise, safe, non-invasive and time-saving method that n. allows multiple repeated evaluation of IGC at different stages of spermatogenesis.

D

Key words: infertility, spermatogenesis, pathozoospermia, azoospermia, reproduction, meiosis, germ cells, ejaculate

Введение

Гаметогенез — процесс образования и дифференци-ровки половых клеток — имеет ключевое значение для фертильности мужчин и женщин. Гаметогенез в организме мужчин (сперматогенез) представляет собой сложный гормонально зависимый и генетически детерминированный процесс [1—5]. Изменение морфологических и/или функциональных характеристик половых клеток под действием повреждающих факторов различной природы может стать причиной бесплодия [6—8].

В процессе гаметогенеза выделяют периоды размножения, роста, созревания и формирования половых клеток. Э. Рузен-Ранге (1980) выделяет в сперматогенезе три этапа: сперматоцитогенез (стадия размножения),

мейотические деления сперматоцитов, спермиогенез [9]. На основании работ Э. Рузен-Ранге В.А. Голиченков с соавт. (2004) предлагают следующую периодизацию развития мужских гамет: развитие первичных половых клеток, пресперматогенез, сперматогенез, включающий в себя стадию сперматоцитов (мейотическая стадия) и стадию сперматид (спермиогенез). Схема сперматогенеза по Л.Ф. Курило (1989) представлена на рисунке [6].

Развитие первичных половых клеток

Первичные половые клетки (ППК) имеют внегонад-ное происхождение. По морфологическим критериям (округлой форме и более крупным размерам, чем у соседних соматических клеток), по наличию гликогена

СПЕРМАТОГОНИИ

СПЕРМАТОЦИТ I

МЕТАФАЗА I МЕЙОЗА (MI)

СПЕРМАТОЦИТЫ II

МЕТАФАЗА II МЕЙОЗА (MII)

Е га Е

СПЕРМАТИДЫ

СПЕРМИОГЕНЕЗ

СПЕРМАТОЗОИДЫ

Схема сперматогенеза млекопитающих [6]

А

А

А

Б

Е га Е

и щелочной фосфатазы ППК у эмбрионов человека можно идентифицировать уже на 15-20-й день развития. Из области первичной эктодермы через энтодерму желточного мешка ППК мигрируют в зачатки гонад (до 32-го дня эмбриогенеза) [10].

Важную роль в развитии мужских половых клеток играют клетки Сертоли. Одновременно с процессом трансформации ППК в гоноциты начинается диффе-ренцировка соматических клеток половых тяжей в предшественники клеток Сертоли [2]. Появившись, они запускают процесс превращения половых тяжей в эмбриональные семенные канальцы, а развитие всей гонады — в яички. Образование эмбриональных семенных канальцев из половых тяжей происходит даже в случае отсутствия гоноцитов в них [11].

Пресперматогенез (сперматоцитогенез)

У эмбрионов человека мужского пола мигрировавшие в гонады ППК (гоноциты) делятся митозом. В сперматоцитогенез, или этап размножения, вступают гоноциты, которые завершили ряд митотических делений. С этого момента гоноциты являются сперма-тогониями. Сперматогонии расположены в основании семенного эпителия, среди них различают клетки типов А и В. Среди клеток типа А выделяют А-темные сперматогонии, в нормальных условиях не обладающие пролиферативной активностью, и А-светлые сперма-тогонии, которые при делении образуют сперматого-нии типа В [12; 13]. Клеточные деления сперматого-ниев типа А не завершаются цитокинезом, поэтому возникают синцитиальные скопления — клоны [14]. У человека продолжительность пресперматогенеза (сперматоцитогенеза) составляет около 10 лет [15].

Мейотическая стадия

Митотическое деление сперматогониев типа В приводит к образованию качественно новых клеток — сперматоцитов I порядка, вступающих в профазу I мейоза. Мейоз — это особый тип деления, характерный только для половых клеток. Мейоз проходит в 2 этапа и приводит к уменьшению (редукции) числа хромосом вдвое (до гаплоидного набора). Сперматоциты последовательно проходят этапы редукционного (М1) и экваци-онного (М11) деления. Первое мейотическое деление (редукционное) составляют несколько фаз: профаза, метафаза, анафаза, телофаза. Профаза первого мейо-тического деления является наиболее продолжительной фазой сперматогенеза, у человека она длится около 4 нед [16]. Первому делению мейоза предшествует репликация (удвоение) ДНК. Это происходит в период, который одни авторы считают интерфазой, а другие — прелептотенной стадией профазы первого деления мейоза. Вторая точка зрения предпочтительнее, поскольку стадия лептотены профазы начинается практически сразу после репликации ДНК, без заметного

периода 02 [17]. Таким образом, выделяют 6 последовательных стадий профазы I мейотического деления: прелептотена, лептотена, зиготена, пахитена, дипло-тена, диакинез.

Прелептотенная конденсация хроматина начинается с появления тонких нерегулярных волокон [18]. Для стадии лептотены характерны очень тонкие нитевидные хромосомы. В лептотене начинается сближение гомологичных хромосом. Образуется сложная специальная структура — тяж белковой природы, синаптонем-ный комплекс. Зиготена — стадия прохождения конъюгации гомологичных хромосом. При этом гомологичные хромосомы сближаются и образуют новый хромосомный ансамбль — бивалент. Биваленты — это парные соединения удвоенных гомологичных хромосом, т. е. каждый бивалент состоит из 4 хроматид [16]. Стабильность бивалентов поддерживают специфические белки синаптонемного комплекса. На стадии пахитены происходит ключевое событие мейоза — кроссинговер, взаимный обмен участками гомологичных хромосом. Каждая пара хроматид из бивалента претерпевает обмен сегментами под действием белков-ферментов, расположенных в компартментах синаптонемного комплекса, мейотических узелках [19].

На стадии диплотены гомологичные хромосомы остаются соединенными только в области хиазм. При этом пары сестринских хроматид каждой гомологичной хромосомы соединены между собой в центромерных районах и по всей длине. В диакинезе уменьшается число хиазм, укорачиваются биваленты, исчезают ядрышки. Прекращаются синтетические процессы в клетке, хроматин максимально конденсируется, растворяется ядерная мембрана клетки. Эта стадия является переходной к метафазе. На стадии метафазы I мейоза биваленты хромосом располагаются в области экваториальной пластинки веретена деления клетки, на стадии анафазы I мейоза гомологичные хромосомы, состоящие из 2 сестринских хроматид, расходятся к противоположным полюсам клетки [16]. В телофазе восстанавливаются ядерные оболочки формирующихся клеток. Перетяжка между ядрами, постепенно суживаясь, разделяет клетку на 2 дочерние с сохранением цито-плазматического мостика между ними. Образующиеся клетки — сперматоциты II [17]. На препаратах сперма-тоциты II почти не встречаются, поскольку второе деление мейоза начинается практически сразу же после окончания первого.

Второе мейотическое деление (эквационное деление, или деление созревания) характеризуется расхождением сестринских хроматид. Клетка последовательно проходит стадии профазы (профаза II мейоза крайне короткая), метафазы, анафазы и телофазы II мейоза. В результате из каждого сперматоцита II образуются 2 сперматиды с гаплоидным набором хромосом, которые отличаются друг от друга по набору половых

хромосом: одни несут хромосому X, другие — хромосому У [16; 17].

Спермиогенез

Заключительным этапом сперматогенеза является спермиогенез (период формирования сперматозоидов), в течение которого сперматиды подвергаются сериям преобразований цитоплазмы, клеточных органелл, изменениям упаковки хроматина, строения и формы ядра и клетки в целом. Ядро удлиняется, смещается к периферии клетки, в нем происходит реорганизация хроматина, который из диффузного превращается в сверх-конденсированный и транскрипционно инертный. При этом большая часть гистонов (у человека до 80—85 %) замещаются на протамины [20]. Утрачивается большая часть цитоплазмы, формируются структуры сперматозоида — акросома, жгутик. Исчезают цитоплазматиче-ские мостики, происходит высвобождение клеток в просвет канальца (спермиация), с этого момента поздние сперматиды становятся сперматозоидами. Дозревание сперматозоидов происходит в придатке яичка, у человека оно длится 1—3 нед [17]. Все эти преобразования приводят к формированию зрелого сперматозоида — автономной подвижной половой клетки — гаметы, способной к оплодотворению.

Материалы и методы

Исследовали 122 образца эякулята пациентов, обратившихся в лабораторию генетики нарушений репродукции ФГБНУ «Медико-генетический научный центр» в связи с бесплодием в браке. Всем мужчинам выполняли стандартное спермиологическое исследование согласно международному руководству Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [21] и количественный кариологический анализ (ККА) незрелых половых клеток эякулята (НПК) (патент Л.Ф. Курило № 2328736, 2007 г. [22]). На основании результатов спермограммы для дальнейшего анализа выделены: 1-я группа (п = 55) с нормальной концентрацией сперматозоидов (от 15 млн/мл), 2-я группа (п = 67) с концентрацией < 1 млн/мл. Средний возраст пациентов 1-й группы составил 33,1 ± 5,7 года, 2-й группы — 35,8 ± 7,2 года. В исследование включали образцы эякулята с объемом > 1 мл.

Для проведения ККА НПК использовали предварительно обработанные, фиксированные и окрашенные клетки из осадка эякулята. Проводили подсчет ядер НПК на разных стадиях сперматогенеза и вычисляли долю (%) клеток каждой стадии от их общего числа. Для каждого образца анализировали > 200—300 клеток НПК (если таковые присутствовали). При обнаружении на препаратах 1000 или более сперматозоидов подсчитывали индекс НПК (число незрелых половых клеток на 1000 сперматозоидов). Параллельно учитывали и другие типы клеток — эпителиальные клет-

ки и лейкоциты [22]. Выделяли следующие стадии развития НПК: сперматогонии, сперматоциты допахитен-ных стадий (клетки на стадиях прелептотены, лептотены, зиготены), сперматоциты I в пахитене профазы I мейоза, сперматоциты I в диплотене профазы I мейоза, сперматоциты в метафазе I и II мейоза (М! и МП), суммарную долю сперматоцитов II порядка и сперма-тид. Кроме того, учитывали долю не разошедшихся в анафазе I и II мейоза ядер сперматид (% от общего числа подсчитанных сперматоцитов II и сперматид). Нормативные показатели ККА НПК (условный контроль) взяты из исследования показателей эякулята доноров спермы [23]. Статистическое сравнение полученных данных проводили с использованием критерия Манна—Уитни, значимыми считали различия при уровнер < 0,01.

Результаты и обсуждение

Сравнение результатов ККА НПК показало значимые различия в доле НПК между группами (р < 0,01). В группе с нормальной концентрацией сперматозоидов (1-я группа) превалирует блок сперматогенеза в профазе I мейоза (значимо повышена доля НПК на стадиях прелептотены, зиготены и пахитены). Во 2-й (пациенты с крипто- и олигозооспермией) значимо выражен блок сперматогенеза на стадии спермиогенеза.

В 1-й группе (с нормальной концентрацией сперматозоидов) индекс НПК (отношение НПК к общему количеству сперматозоидов и НПК рассчитывается не менее чем на 1000 сперматозоидов) в 58 % случаев (32 из 55 образцов) превышал нормативные значения. В 71 % образцов (39 из 55) выявлены признаки частичного блока сперматогенеза на допахитенных стадиях, в 67 % случаях (26 образцов) — сочетанного с блоком на стадии пахитены. Увеличение доли неразошедших-ся сперматид обнаружено в 7 % случаев (4 образца), неидентифицированных половых клеток — в 34,5 % (19 образцов). Не выявлено связи между индексом НПК и возрастом пациентов, показателями морфологии и подвижности сперматозоидов. Следует отметить, что у 2 из 4 входящих в эту группу мужчин с нормозо-оспермией, в анализе ККА НПК индекс НПК более чем вдвое превышал нормативные значения. Поскольку повышение индекса НПК свидетельствует о нарушении процессов сперматогенеза и может являться предвестником патозооспермии, необходимо наблюдение таких пациентов в динамике.

Во 2-й группе (с концентрацией сперматозоидов < 1 млн/мл) в 61 % случаев (41 из 67 образцов) выявлена повышенная доля суммы сперматоцитов II порядка и сперматид. Частичный блок сперматогенеза на допахитенных стадиях выявлен в 34 % образцов (23 из 67 образцов), почти в половине из них сочетается с блоком на стадии пахитены. Доля неразошедшихся сперматид выше нормативных показателей в 9 % случаев

Е га Е

Е га Е

(6 образцов), а неидентифицированных половых клеток — в 24 % (16 образцов). Индекс НПК был подсчитан для 6 образцов (9 %) данной группы, при этом в половине случаев (3 образца) он превышал нормативные показатели (в 1 образце почти в 2 раза, еще в 2 образцах — более чем в 6 раз). В большинстве образцов 2-й группы индекс НПК не рассчитывали из-за малой концентрации сперматозоидов. Средние показатели ККА НПК и стандартные отклонения в исследуемых группах приведены в таблице.

Сравнение показателей ККА НПК в группе с нормальной концентрацией сперматозоидов и у пациентов с криптозооспермией или олиго-зооспермией тяжелой степени

Доля НПК из эякулята на разных стадиях развития M ± m, %

1-я группа (концентрация сперматозоидов от 15 млн/мл), n = 55 2-я группа (концентрация сперматозоидов < 1 млн/мл), n = 67

Индекс НПК* 6,21 ± 5,76 11,20 ± 12,34

В прелептотене-зиготене 2,91 ± 2,47 1,16 ± 1,81

В пахитене 0,89 ± 1,12 0,44 ± 1,09

В диплотене 0,63 ± 1,09 0,32 ± 0,75

В диакинезе, М1, М11 0,01 ± 0,04 0,01 ± 0,09

Сперматоциты II + сперматиды 89,65 ± 7,18 93,53 ± 7,89

Неразошедшиеся сперматиды 11,65 ± 8,23 10,77 ± 8,95

Неидентифиц. половые клетки 5,91 ± 5,34 4,55 ± 6,63

*Во 2-й группе из-за малого количества половых клеток индекс НПК рассчитывали только для 6образцов. Жирным шрифтом выделены значимые (р <0,01)различия между группами.

I

I

Необходимо отдельно отметить результаты исследования ККА НПК 2 пациентов из 2-й группы. В эякуляте данных пациентов обособленные (не включенные в конгломераты) сперматозоиды не были обнаружены при стандартном спермиологическом анализе. На препарате для ККА НПК было найдено более 1000 обособленных сперматозоидов и конгломераты из слизи, лейкоцитов, незрелых половых клеток и сперматозоидов. Рассчитанный индекс НПК в обоих случаях входил в пределы нормативных значений, хотя были выявлены признаки частичного блока сперматогенеза на пред-пахитенных стадиях (у обоих пациентов) и на стадии пахитены (у одного из них). Таким образом, большинство половых клеток в эякуляте данных мужчин находились в тяжах слизи и конгломератах, которые были дезинтегрированы (разрушены) или распались на со-

ставные части при приготовлении препарата для ККА НПК (в процессе гипотонии и фиксации). Все обнаруженные сперматозоиды были атипичными, с аномалиями акросомы и жгутика. Для одного из рассматриваемых пациентов был выполнен поиск частых микроделеций Y-хромосомы в локусе AZF (не выявлены) и проведен цитогенетический анализ (идентифицирован нормальный мужской кариотип, 46,XY). В повторных спермиологических исследованиях концентрация сперматозоидов была < 1 млн/мл. Другой пациент болен муковисцидозом, подтвержденным наличием мутаций гена CFTR.

В случаях чрезвычайно низкой концентрации половых клеток в эякуляте наиболее актуальной является проблема обнаружения сперматозоидов. При оценке результатов исследования следует учитывать трудности подсчета единичных сперматозоидов и ошибки, возникающие при анализе большого числа полей зрения и осадка эякулята с большим количеством клеточного дебриса [21].

В 44 (66 %) из 67 образцов во 2-й группе было подозрение на азооспермию. Однако при ККА НПК из осадка эякулята во всех 44 образцах найдены обособленные сперматозоиды. Их число варьировало от 3 до 317 на 1000 полей зрения (не считая описанных выше 2 случаев, когда было найдено более 1000 сперматозоидов).

Азооспермия является наиболее тяжелой формой патозооспермии и характеризуется отсутствием сперматозоидов в эякуляте. Когда в 2 влажных препаратах эякулята не обнаружено ни одного сперматозоида, для большинства клинических целей образец следует центрифугировать. Если сперматозоиды отсутствовали в на-тивном препарате, но присутствуют в осадке эякулята, говорят о криптозооспермии [21]. Несмотря на то что вероятность нахождения половых клеток связана с относительной центробежной силой центрифугирования, рекомендации по методике нахождения сперматозоидов противоречивы. Руководство ВОЗ (2012) рекомендует центрифугировать аликвоту эякулята объемом 1 мл при 3000 g в течение 15 мин, хотя ранее было показано, что это не гарантирует осаждение всех имеющихся в эякуляте половых клеток [24].

Для получения сперматозоидов у пациентов с азооспермией может быть использована биопсия яичка или его придатка. Наибольшее распространение получили получение сперматозоидов из ткани яичка (testicular sperm extraction, TESE) и транскутанная аспирация эпи-дидимальных сперматозоидов (percutaneous epididymal sperm aspiration, PESA) [25]. Применение данных методик у пациентов с необструктивной (секреторной) формой азооспермии малоэффективно [26]. Одним из основных недостатков биопсии является вероятность возникновения осложнений, к наиболее прогнозируемым из которых относят интратестикулярную гематому,

снижение продукции андрогенов и гипогонадизм, фиброз тканей яичка, острый эпидидимит, гидроцеле [27, 28]. Методика микрохирургической биопсии яичка (микро-TESE) вследствие удаления меньшего объема тестику-лярной ткани при микро-TESE (по сравнению с TESE) снижает риск этих осложнений [29]. Ранее биопсия яичка являлась стандартной диагностической процедурой, но подавляющее большинство современных специалистов выступают против биопсии для диагностических целей и рекомендуют разрабатывать и использовать неивазивные прогностические методики [30].

Л.Ф. Курило и соавт. (1997) провели сравнительный анализ соотношения незрелых половых клеток на разных этапах их дифференцировки в биоптате яичка и эякуляте у пациентов с азооспермией и олигозооспермией и показали соответствие показателей отдельных стадий сперматогенеза при ККА НПК из эякулята с таковыми в биоптатах у пациентов с азоо- и олигозооспермией [31]. Таким образом, количественный кариологический анализ НПК из осадка эякулята, как и гистологический анализ биоптатов яичек (с учетом методических ограничений), способен достаточно точно и наглядно характеризовать морфофункциональное состояние мужских половых желез.

Процессы дифференцировки половых клеток в сперматогенном эпителии протекают непрерывно, что делает процесс сперматогенеза уязвимым на молекулярном и клеточном уровнях при действии повреждающих факторов различной природы [8, 32—35]. В серии количественных исследований оценки гамето-

токсического и гонадотоксического эффекта ряда химических, физических и биологических факторов на беременных мышей и крыс, состояния гаметогенеза их потомства показано, что внутренние и внешние сре-довые факторы могут индуцировать генные, хромосомные, геномные, гаметотоксические и эмбриотоксиче-ские эффекты, нарушая уникальный процесс деления половых клеток — мейоз, дифференцировку и резерв гамет, а также оплодотворение и развитие эмбрионов [36, 37]. Токсический эффект, выявленный на гамето-генезе грызунов, может обладать таким же действием и на гаметы приматов.

При экзогенном и эндогенном поражении сперматогенеза необходимо исследовать его в динамике. Ценность метода ККА НПК из осадка эякулята, не только в его информативности, но и в возможности многократного повторения оценки состояния сперматогенеза без риска для здоровья пациента. В связи с объективными трудностями обнаружения сперматозоидов в случаях с крайне низкой концентрацией половых клеток при стандартном спермиологическом исследовании, с неоправданностью использования инвазивных методик (биопсии яичка или его придатка) для диагностических целей метод ККА НПК особенно актуален при обследовании пациентов с подозрением на азооспермию. Учитывая безопасность, информативность, точность, быстроту и относительную простоту проведения количественного кариологического анализа НПК из осадка эякулята, можно рекомендовать метод ККА НПК для широкого клинического применения.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Райцина С.С. Гормональный контроль сперматогенеза у млекопитающих.

В кн.: Сперматогенез и его регуляция. Под ред. Л.О. Даниловой. М.: Наука, 1983. С. 3-61. [Raytsina S.S. Hormonal control of spermatogenesis in mammals. In: Spermatogenesis and its regulation. Ed.L. O. Danilova. Moscow: Nauka, 1983. P. 3-61. (In Russ.)].

2. Захидов С.Т., Кулибин А.Ю., Маршак Т. Л. Стволовые клетки и клетки ниши сперматогенной системы.

В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии: В 2 т. Под ред. М.А. Пальцева. М.: Медицина; Шико, 2009. Т. 2. С. 311-380. [Zakhidov S.T., Kulibin A.Yu., Marshak T. L. Stem cells and spermatogonial niche cells. In: Stem cell biology and cell technology: In 2 volumes. Ed.M. A. Paltsev. Moscow: Meditsina; Shiko, 2009. V. 2. P. 311-380. (In Russ.)].

3. Черных В.Б. AZF делеции - частая генетическая причина бесплодия у муж-

чин: современное состояние исследований. Проблемы репродукции 2009;1:10-5. [Chernykh V.B. AZF deletions as a common cause of infertility in males: Current state of the research. Problemy reproduktsii = Russian Journal of Human Reproduction 2009;1:10-5. (In Russ.)].

4. Курило Л.Ф., Штаут М.И. Генетические и эпигенетические механизмы регуляции, хронология и динамика сперматогенеза у млекопитающих. Андрология и генитальная хирургия 2015;(1):31-40. [Kurilo L.F.,

Shtaut M.I. Genetic and epigenetic mechanisms of regulation, chronology and dynamics of spermatogenesis of mammals. Andrologiya i genitalnaya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2015;16(1):31-40. (In Russ.)].

5. Брагина Е.Е., Сорокина Т. М., Арифулин Е.А., Курило Л.Ф. Генетически обусловленные формы патозоо-спермии. Обзор литературы и результа-

ты исследований. Андрология и генитальная хирургия 2015;16(3):29— 39. [Bragina E.E., Sorokina T.M., Arifulin E.A., Kurilo L.F. Genetically determined patozoospermia. Literature review and research results. Andrologiya i genitalnaya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2015;16(3):29-39. (In Russ.)].

6. Курило Л.Ф. Возможности цитогене-тического исследования мейоза при мужском бесплодии. Цитология и генетика 1989;23(2):63-70.

[Kurilo L.F. Cytogenetic study of meiosis in male infertility. Tsitologiya i genetika = Cytology and Genetics 1989;23(2):63-70. (In Russ.)].

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

7. Курило Л. Ф. Гаметогенез человека: выявление и анализ аномалий хромосом и гамет в целом, тестирование гамето-токсического эффекта повреждающих факторов. Лабораторное дело 1989;(10):4-8. [Kurilo L.F. Gametogenesis in humans: Identification and analysis

E

W

E

Е га Е

of anomalies in chromosomes and gametes as a whole, evaluation of gametotoxic effects of damaging factors. Laboratornoe delo = Laboratory Science 1989;(10):4-8. (In Russ.)].

8. Захидов С.Т. Процессы нормального и атипичного сперматогенеза у животных. Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 1993. 45 с. [Zakhidov S.T. Processes of normal and atypical spermatogenesis in animals. MD dissertation summary, 03.00.11. Moscow, 1993. 45 p. (In Russ.)].

9. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез

у животных. М.: Мир, 1980. 255 с. [Ruzen-Range E. Spermatogenesis in animals. Moscow: Mir, 1980. 255 p. (In Russ.)].

10. Семенова-Тян-Шанская А.Г. Первичные половые клетки зародыша человека в период миграции к зачаткам гонад. Архив анатомии, гистологии

и эмбриологии 1969;56(6):3-8. [Semenova-Tyan-Shanskaya A.G. Primary germ line cells in human embryo during migration to gonadal primordium. Arkhiv anatomii, gistologii i embriologii = Archive of Anatomy, Histology, and Embryology 1969;56(6):3-8. (In Russ.)].

11. Wilhelm D., Palmer S., Koopman P. Sex determination and gonadal development in mammals. Physiol Rev 2007;87(1):1-28.

12. Clermont Y. Renewal of spermatogonia in man. Am J Anat 1966;118:509-524.

13. Ehmcke J., Schlatt S. A revised model for spermatogonial expansion in man: lessons from non-human primates. Reproduction 2006;132(5):673-80.

14. Райцина С. С. Сперматогенез и структурные основы его регуляции.

М.: Наука, 1985. 207 с. [Raytsina S.S. Spermatogenesis and structural basics of its regulation. Moscow: Nauka, 1985. 207 p. (In Russ.)].

15. Голиченков В. А., Иванов Е.А., Никерясова Е.Н. Эмбриология. М.: Академия, 2004. 224 с. [Golichenkov V.A., Ivanov E.A., Nikeryasova E.N. Embryology. Moscow: Akademiya, 2004. 224 p. (In Russ.)].

16. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. М.: Академкнига, 2004. 495 с. [Chentsov Yu.S. Introduction to cell biology. Moscow: Akademkniga, 2004. 495 p. (In Russ.)].

17. Кузнецов С.Л., Мушкамбаров Н.Н. Гистология, цитология и эмбриология. М.: Медицинское информационное агентство, 2007. 600 с. [Kuznetsov S.L. Mushkambarov N.N. Histology, cytology, and embryology. Moscow: Meditsinskoe informatsionnoe agentstvo, 2007. 600 p. (In Russ.)].

18. Хилькевич Л.В., Курило Л.Ф. Кинетика популяции мужских половых клеток человека в антенатальном периоде онтогенеза. Онтогенез 1992;23(5):506-10.

[Khilkevich L.V., Kurilo L.F. Kinetics of male sex cells in antenatal period of ontogenesis. Ontogenez = Russian Journal of Developmental Biology 1992;23(5):506-10. (In Russ.)].

19. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Си-наптонемный комплекс — индикатор динамики мейоза и изменчивости хромосом. M.: КМК, 2007. 358 с. [Bogdanov Yu.F., Kolomiets O.L. Synaptonemal complex as an indicator of meiosis dynamics and chromosome variability. Moscow: KMK, 2007. 358 p. (In Russ.)].

20. Oliva R. Protamines and male infertility. Hum Reprod Update 2006;12(4):417—35.

21. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макарова. Науч. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. М.: Капитал Принт, 2012. 291 с. [WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Translation from English by N.P. Makarov. Ed.L. F. Kurilo. 5th edition. Moscow: Kapital Print, 2012. 291 p. (In Russ.)].

22. Курило Л. Ф. Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза. Патент на изобретение № 2328736 от 01.02.2007. [Kurilo L.F. Method

of cytological diagnostics of spermatoge-netic disorders. Patent # 2328736 from 01.02.2007. (In Russ.)].

23. Курило Л.Ф., Дубинская В.П., Остроумова Т. В. и др. Оценка сперматогенеза по незрелым половым клеткам эякулята. Проблемы репродукции 1995;3:33-8. [Kurilo L.F., Dubinskaya V.P., Ostroumova T.V. et al. Spermatogenesis evaluation using immature sex cells of the ejaculate. Problemy reproduktsii = Russian Journal of Human Reproduction 1995;3:33-8. (In Russ.)].

24. Corea M., Campagnone J., Sigman M. The diagnosis of azoospermia depends on the force of centrifugation. Fertility and Sterility 2005;83(4):920-2.

25. Гамидов С.И., Попова А.Ю., Овчинников Р. И. Необструктивная азооспермия - клинические рекомендации. РМЖ 2015;23(11):595—601. [Gamidov S.I., Popova A.Yu. Ovchinnikov R.I. Non-obstructive azoospermia: Clinical guidelines. RMZh = Russian Medical Journal 2015;23(11):595—601. (In Russ.)].

26. Okada H., Dobashi M., Yamazaki T. et al. Conventional versus microdissection testicular sperm extraction for nonobstructive azoospermia. J Urol 2002;168(3):1063—7.

27. Ron-El R., Strauss S., Friedler S. et al. Serial sonography and color flow Doppler imaging following testicular and epididymal sperm extraction. Hum Reproduct 1998;13(12):3390—3.

28. Аль-Шукри С.Х., Боровец С.Ю., Торопов В. А. и др. Частота обнаружения сперматозоидов и вероятность осложнений после различных видов биопсии яичка (TESA, TESE

и MICRO-TESE) у больных с необ-структивной азооспермией. Ученые записки СПб ГМУ им. акад. И. П. Павлова 2016;23(1):10—4. [Al-Shukri S.Kh., Borovets S.Yu., Toropov V.A. et al. The frequency of detection of sperm and probability of postoperation complications after TESA, TESE and micro-TESE in patients with non-obstructive azoospermia. Uchenie zapiski SPbGMU imeni akademika I.P. Pavlova = Record of the I.P. Pavlov Saint-Petersburg State Medical University 2016;23(1):10—4. (In Russ.)].

29. Schlegel P.N. Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod 1999;14:131—5.

30. Nieschlag E., Behre H.M., Nieschlag S. (eds.) Andrology: male reproductive health and dysfunction. 3rd ed. Berlin; Heidelberg: Springer Verlag, 2010. 629 р.

31. Курило Л.Ф., Чеботарев А.Н., Шилей-ко Л.В. и др. Сравнительный анализ соотношения незрелых половых клеток на разных стадиях их дифференци-ровки в биоптате яичка и эякуляте

у пациентов с азоо- и олигозоосперми-ей. Проблемы репродукции 1997;(1):80—4. [Kurilo L.F., Chebotarev A.N., Shileyko L.V. et al. Comparative analysis of the ratio between immature sex cells in different differentiation stages in testicular biopsy samples and ejaculates of patients with azoo- and oligozoospermia. Problemy reproduktsii = Russian Journal of Human Reproduction 1997;1:80—4. (In Russ.)].

32. Курило Л.Ф., Королев Ю.Н., Никулина Л .А. и др. Анализ влияния общего облучения на сперматогенез и систему кроветворения крыс. Подходы к первичной профилактике радиационного облучения, приводящей к коррекции индуцированных нарушений. Андро-логия и генитальная хирургия 2004; (1—2):64—6. [Kurilo L.F., Korolev Yu.N., Nikulina L.A. et al. Analysis of the effect of general irradiation on spermatogenesis and hematopoiesis in rats. Methods

of primary prevention of irradiation leading to correction of induced disorders. Andrologiya i genitalnaya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2004; 1—2:64—6. (In Russ.)].

33. Курило Л.Ф., Макарова Н.П., Шилей-ко Л.В. Система оценки состояния сперматогенеза человека и млекопитающих. Андрология и генитальная хирургия 2005;4:8—17. [Kurilo L.F.,

Makarova N.P., Shileiko L.V. System of assessment of the state of spermatogenesis of humand and mammals(clinical lectures). Andrologiya i genitalnaya khirurgiya = Andrology and Genital Surgery 2005;(4):8—17. (In Russ.)].

34. Королев Ю.Н., Курило Л.Ф., Гениатулина М.С., Никулина Л. А. Структурно-функциональные нарушения в семенниках крыс в условиях острого иммобилизационного стресса. Андрология и генитальная хирургия 2012;13(4):25-8. [Korolev Y.N., Kurilo L.F., Geniatulina M.S., Nikulina O.A. Structural and functional testicular anomalies in male rats exposed to acute immobilization stress. Andrologiya i genitalnaya khirurgiya =

Andrology and Genital Surgery 2012;13(4):25-8 (In Russ.)].

35. Павлюченкова С.М. Изучение закономерностей развития мужских половых клеток и клеток Сертоли у мышей после различных экспериментальных воздействий. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2015. 23 с. [Pavluchenkova S.M. Study of principles of development of male sex cells and Sertoli cells in mice after different experimental treatments. PhD dissertation summary 03.03.05. Moscow, 2015. 23 p. (In Russ.)].

36. Игнатьева Е.Л., Курило Л.Ф. Антенатальный оогенез у мышей и его экспериментальная модификация. Онтогенез 1984;15(2):206—11. [Ignatieva E.L.,

Kurilo L. F. Antenatal oogenesis in mice and its experimental modification. Ontogenez = Russian Journal of Developmental Biology 1984;15(2):206-11. (In Russ.)].

37. Курило Л.Ф., Игнатьева Е.Л.,

Хилькевич Л.В., Леонов Б.В. Нарушение пролиферации оогониев при введении в культуру яичников плодов ок-ситетрациклина либо 17^-эстрадиола. Акушерство и гинекология 1985;(4): 53-5. [Kurilo L.F., Ignatieva E.L., Khikevich L.V., Leonov B.V. Alteration of proliferation of oogoniums after introduction of oxytetracycline or 17-ß-estradiol into fetal ovary culture. Akusherstvo i ginekologiya = Obstetrics and Gynecology 1985;4:53-5. (In Russ.)].

E

W

E

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.