CC BY
37
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(3)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-3-293-296
Original article
Профилактическая токсикология и гигиеническое нормирование
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 614.7:629.76]:616.69-008.6-092.9
Ловинская А.В.1, КолумбаеваС.Ж.1, Абилев С.К.2, Коломиец О.Л.2
ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ СТРУКТУРЫ СИНАПТОНЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ЯДРАХ СПЕРМАТОЦИТОВ МЫШИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КОМПОНЕНТА РАКЕТНОГО ТОПЛИВА
'РГП «Казахский национальный университет им. аль-Фараби» МОН РК, 050040, Алматы, Казахстан; 2ФГБУН «Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова» РАН, 119991, Москва
Проведена оценка генотоксического действия компонента ракетного топлива - несимметричного диметил-гидразина (НДМГ, гептила) на формирующиеся половые клетки самцов мыши. Иммуноцитохимически исследована структура мейотических ядер в разные сроки после внутрибрюшинного введения НДМГ самцам мыши. Выявлены следующие типы нарушений структуры синаптонемных комплексов (СК) мейотических хромосом: единичные и множественные фрагменты СК; ассоциации аутосом с половым бивалентом, атипичная структура СК с частотой, превышающей контрольный уровень. Кроме того, выявлены преждевременный десинапсис половых бивалентов, нарушение формирования полового тельца и кольцевые СК. Установленные нарушения в СК сперматоцитов, проанализированных на 38-е сутки после 10-дневной интоксикации животных компонентом ракетного топлива, свидетельствуют о риске сохранения хромосомных нарушений, возникших в пуле стволовых клеток, в течение длительного времени.
Ключевые слова: несимметричный диметилгидразин; мейоз; синаптонемный комплекс; генотоксичность.
Для цитирования: Ловинская А.В., Колумбаева С.Ж., Абилев С.К., Коломиец О.Л. Иммуноцитохимический анализ нарушений структуры синаптонемных комплексов в ядрах сперматоцитов мыши при воздействии компонента ракетного топлива. Гигиена и санитария. 2016; 95 (3): 293-296. DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-3-293-296
Lovinskaya A.V.1, Kolumbayeva S.Zh.1, Abilev S.K.2, Kolomiets O.L.2.
IMMUNOCYTOCHEMICAL ANALYSIS OF THE DISTURBANCES IN THE STRUCTURE OF SYNAPTONEMAL COMPLEXES IN SPERMATOCYTE NUCLEI IN MICE UNDER EXPOSURE TO ROCKET FUEL COMPONENT
1al-Farabi Kazakh National University", Almaty, 050040, Republic of Kazakhstan; 2ФГБУН «Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова» РАН, 119991, Москва
There was performed an assessment of genotoxic effects of rocket fuel component - unsymmetrical dimethylhydrazine (UDMH, heptyl) - on forming germ cells of male mice. Immunocytochemically there was studied the structure of meiotic nuclei at different times after the intraperitoneal administration of UDMH to male mice. There were revealed following types of disturbances of the structure of synaptonemal complexes (SCs) of meiotic chromosomes: single and multiple fragments of SCs associations of autosomes with a sex bivalent, atypical structure of the SCs with a frequency higher than the reference level. In addition, there were found the premature desinapsis of sex bivalents, the disorder of formation of the genital corpuscle and ring SCs. Established disorders in SCs of spermatocytes, analyzed at 38th day after the 10-days intoxication of animal by the component of rocket fuel, attest to the risk of permanent persistence of chromosomal abnormalities occurring in the pool of stem cells.
Keywords: unsymmetrical dimethyl hydrazine; meiosis; synaptonemal complex; genotoxicity.
For citation: Lovinskaya A.V, Kolumbayeva S.Zh., Abilev S.K., Kolomiets O.L. Immunocytochemical analysis of the disturbances in the structure of synaptonemal complexes in spermatocyte nuclei in mice under exposure to rocket fuel component. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal) 2016; 95(3):293-296. (In Russ.). DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-3-293-296
For correspondence: Anna V. Lovinskaya, PhD doctoral student. E-mail: ankalav@mail.ru; annalovinska@rambler.ru
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. Работа выполнена в рамках проекта МОН РК ГР № 0112РК00580. Руководитель: Колумбаева С.Ж. Received 10.11.2014 Accepted 30.12.2014
Стремительно развивающаяся космическая индустрия способствует появлению новых экологически опасных факторов, оказывающих негативное действие на компоненты окружающей среды и здоровье человека. Результаты российских и казахстанских комплексных экспедиционных работ на местах па-
Для корреспонденции: Ловинская Анна Владимировна, студент PhD-докторантуры, РГП «Казахский национальный университет им. аль-Фараби» МОН РК, 050040, Алматы, Казахстан, E-mail: annalovinska@rambler.ru, ankalav@mail.ru
дения остаточных частей космических ракет свидетельствуют о наличии компонента ракетного топлива несимметричного диметилгидразина (НДМГ, гептил) и продуктов его окисления в почве, воде и растениях в концентрациях, превышающих ПДК [1]. НДМГ -токсичное вещество, отнесенное к 1-му классу опасности. По физиологическому воздействию на организм человека и животных его квалифицируют как супертоксикант. Он является мобильным токсикантом, легко мигрирующим по любым объектам окру-
гиена и санитария. 2016; 95(3)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-3-293-296_
Оригинальная статья
жающей природной среды [2]. НДМГ также обладает общетоксичным и кожно-раздражающим действием. В организме животных распределяется равномерно, поражая печень, центральную нервную, иммунную, сердечно-сосудистую, пищеварительную, выделительную, дыхательную, кроветворную, половую системы. Кроме общетоксичного действия, НДМГ дает отдельные эффекты - канцерогенный, мутагенный, гонадо- и эмбриотоксический [3-5]. Агентство США по охране окружающей среды (US EPA) не классифицировало 1,1-диметилгидразин как потенциальный канцероген, однако Международное агентство по изучению рака (МАИР) относит 1,1-диметилгидразин к группе 2B - возможный канцероген для человека [5]. В настоящее время нет однозначного мнения о гено-токсическом действии НДМГ на репродуктивную систему и онтогенез, а также о его канцерогенном действии на человека. Все вышесказанное определяет актуальность всестороннего изучения влияния НДМГ на жизнедеятельность организма млекопитающих.
Целью настоящего исследования явилось изучение генотоксического действия НДМГ на структуру мейотических хромосом сперматоцитов мыши на основе анализа синаптонемных комплексов (СК) и сай-ленсинга хроматина на стадии профазы I мейоза.
Материал и методы
В эксперименте использованы 25 половозрелых самцов лабораторной мыши линии BALB/cYwal в возрасте 3 мес. Масса тела самцов в среднем составляла 25-30 г. Водный раствор НДМГ (98%, Sigma-Aldrich, США) в дозе 6,6 мг/кг вводили самцам вну-трибрюшинно однократно (острое воздействие) и в течение 10 дней ежедневно (подострое воздействие). Согласно условиям эксперимента, животные были разделены на 5 групп: I группа - интактные животные; III группа - животные, забиваемые через 3 ч после однократного введения ксенобиотика; II группа -животные, забиваемые через 3 ч после 10-дневного воздействия; IV группа - животные, забиваемые через 10 дней после 10-дневного воздействия; V группа -животные, забиваемые через 38 дней после 10-дневного воздействия.
Тотальные препараты распластанных препаратов СК получали и фиксировали по методу Navarro и со-авт. [6] с модификациями O.L. Kolomiets и соавт. [7]. Двойное иммуноокрашивание белков проводили с помощью первичных и вторичных (меченных флу-орохромами) антител. Синаптонемные комплексы и осевые элементы хромосом выявляли с помощью кроличьих антител против основного белка латеральных элементов СК - SCP3 (Abcam, Великобритания); центромеры - с помощью IgG человека против белков кинетохора (CREST) (Antibody Incorporated, США); участки инактивированного хроматина - с помощью мышиных антител против гистона yH2AX (Abcam, Великобритания) (все в разведении 1:200-500). В качестве вторичных антител использовали соответственно бычьи IgG против IgG кролика, конъюгированные с FITC (Invitrogen, США); козьи IgG против IgG человека, конъюгированные с Alexa Fluor 546 (Invitrogen, США), и козьи IgG против IgG мыши, конъюгирован-ные с Alexa Fluor 546 (Jackson, США) (в разведении
1:200-800). Отмывали препараты водно-солевым буфером и заключали в среду Vectashield с красителем DAPI, специфически окрашивающим хроматин. Препараты просматривали во флуоресцентном микроскопе Zeiss Axioimager D1. Изображения обрабатывали в программе Adobe Photoshop 8 CS (Adobe Systems Incorporated, США). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Win Stat - приложения для Excel. Уровень значимости определяли по ^-критерию Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
У интактных животных (I группа) сперматоциты с поврежденным СК составили 13,07%. Были отмечены ядра с единичной фрагментацией СК (7,42%) и атипичной структурой СК (6,23%), а также с ассоциацией аутосом с ХУ бивалентом (1,36%). К атипичным структурам осевых элементов СК мы отнесли изгибы, петли, истончение осевых элементов и скопление их в виде клубка.
Через 3 ч после однократного введения животным НДМГ (II группа) количество ядер спермато-цитов I порядка с нарушениями в структуре СК составило 74,19%. Спектр наблюдаемых повреждений СК был достаточно широким. Фрагментация СК выявлена в 38,67% ядер, причем обнаружена как множественная фрагментация СК («мейотическая катастрофа»), так и/или единичные фрагменты СК. Ассоциация полового бивалента с аутосомами выявлена в 25,17% ядер, атипичная структура СК -в 53,17%. Необходимо отметить, что НДМГ также вызывал нарушение формирования полового тельца (в 1,22% ядер), кольцевые СК (в 1,22% ядер), деси-напсис половых хромосом (в 2,18% ядер); последние не выявлены в ядрах сперматоцитов I порядка ин-тактных животных.
В сперматоцитах мышей III опытной группы так же, как и в остром опыте, обнаружены ядра с нарушениями СК, частота которых составила 76,08%, что статистически значимо выше контрольного уровня. Спектр повреждений СК был достаточно широким и представлен фрагментацией (34,59%), атипичной структурой СК (49,05%), ассоциацией аутосом и полового бивалента (25,54%), нарушениями формирования полового тельца (7,50%), кольцевыми СК (7,02%), десинапсисом половых хромосом (10,07%). Сравнительный анализ клеток с нарушениями СК у животных II и III экспериментальных групп не выявил достоверных различий в уровне общего количества ядер с нарушением СК и частоте отдельных типов в спектре нарушений. Однако наблюдалось снижение количества ядер с фрагментацией СК и изгибами и петлями СК, в то время как количество ядер с другими типами нарушений в структуре СК увеличилось.
У животных IV опытной группы, анализ сперма-тоцитов которых проводили через 10 дней после завершения длительной интоксикации НДМГ, доля поврежденных клеток составила 78,96%, что статистически значимо выше по сравнению с контролем, но на уровне значений у животных II и III групп. Наблюдалось увеличение количества ядер с фрагментацией СК и с ассоциацией аутосом и полового бива-
Рис. 1. Суммарное количество ядер (в %) с нарушениями структуры СК у интактных и подверженных воздействию НДМГ животных.
лента по сравнению с II и III экспериментальными группами (48,08 и 27,25% соответственно), в то время как частота остальных типов нарушений снижалась. Так, атипичные структуры СК выявлены в 47,24% исследованных ядер, с нарушением формирования полового тельца - 4,07%, кольцевыми СК - 4,92%, деси-напсисом половых хромосом - в 5,82% ядер.
У животных V опытной группы доля ядер с нарушениями в структуре СК составила 86,67%. Наблюдалось достоверное увеличение ядер с атипичной структурой СК (73,05%) по сравнению со всеми предыдущими вариантами. Ядра с фрагментацией СК составили 49,16%, ядра с ассоциацией аутосом с половым бивалентом - 39,63%, с нарушением формирования полового тельца - 12,5%, десинапсисом половых хромосом - 7,76%. Сравнительный анализ соотношения наблюдаемых нарушений в структуре СК животных всех групп (I-V) показал, что увеличение числа нарушений происходило за счет фрагментации СК, атипичной структуры СК, ассоциации аутосом с половым бивалентом. Выявлены преждевременный десинапсис или асинапсис половых бивалентов, нарушение формирования полового тельца и кольцевые СК (рис. 1, 2).
Фрагментация СК может быть связана с процессом апоптоза или некроза мейотических клеток. Высокие уровни фрагментации СК (20-70%) также могут быть связаны с развитием блока мейоза на стадии спер-матоцитов I [8]. Формирование одно- и двунитевых разрывов ДНК, разрывов хромосом несет риск формирования хромосомных аберраций и комплексных хромосомных перестроек (CCRs - complex chromosome rearrangements). Носители сбалансированных CCRs имеют высокий риск рецидивирующих спонтанных абортов, бесплодия и/или появления ребенка с умственной отсталостью и врожденными аномалиями [9].
Если фрагментация хромосом происходит на стадиях лептотены-зиготены, то на стадии пахитены формируются гетероморфные биваленты. Начиная с ранней пахитены, гетероморфные биваленты ассоци-
Hygiene & Sanitation (Russian Journal). 2016; 95(3)
_DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-3-293-296
Original article
80 -,
Вид нарушений ® Контроль ЙЗн (острый) И 3 ч (подострый)
^ 10 сут (подострый) 03 38 сут (подострый)
Рис. 2. Динамика распределения ядер с нарушениями СК у интакт-ных и подверженных воздействию НДМГ животных. Атип СК - атипичная структура СК; Фр - фрагментация СК, Ас ХУ с А - ассоциация полового бивалента с аутосомами, Дес - десинапсис половых хромосом, Нар ПТ - нарушение формирования полового тельца, К - кольцевая хромосома
ируют с половым (XY) бивалентом. Половой бивалент, ассоциированный с аутосомой, не перемещается на периферию ядра и не формирует половое тельце, обособленное от аутосом. У самцов млекопитающих нарушение синапсиса аутосом, формирования полового тельца вследствие ассоциации аутосомных СК с половым бивалентом приводит к блоку мейоза или пахитенному аресту. Отмеченные нарушения ведут к увеличению ошибок в мейотической сегрегации хромосом, снижая уровень рекомбинации и транскрипции. У человека такие нарушения приводят к самопроизвольным абортам на ранних стадиях беременности или рождения потомков с такими заболеваниями, вызванными анеуплоидией, как синдромы Дауна, Клайнфельтера, Эдвардса и Тернера [10]. Сперматогенез у мышей можно разделить на несколько этапов: сперматогониальные половые клетки, дифференциации сперматогоний, спермацитов, сперма-тид и формирование тестикулярных сперматозоидов. Общая продолжительность сперматогенеза у мышей составляет примерно 35 дней [11]. Следовательно, на 38-е сутки пахитены достигают клетки, которые подвергались воздействию НДМГ на стадии сперматого-ниальных стволовых клеток и сперматогониев.
Заключение
В результате проведенных исследований установлено выраженное генотоксическое действие НДМГ на половые клетки мышей. Анализ синаптонемных комплексов хромосом сперматоцитов мыши на стадии профазы I мейоза выявил значительные изменения его структуры при различных сроках воздействия НДМГ. Установленные нарушения в СК сперматоци-тов, исследованных на 38-е сутки после 10-дневной интоксикации животных НДМГ, свидетельствуют о риске сохранения хромосомных нарушений, возникших в пуле стволовых клеток, в течение длительного времени.
гиена и санитария. 2016; 95(3)
DOI: 10.18821/0016-9900-2016-95-3-296-301_
Оригинальная статья
Финансирование. Работа выполнена в рамках проекта МОН РК ГР
№ 0112РК00580. Руководитель: Колумбаева С.Ж.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта
интересов.
Литература (пп. 1, 4-11 см. References)
2. Ушакова В.Г., Шпигун О.Н., Старыгин О.И. Особенности химических превращений НДМГ и его поведение в объектах окружающей среды. Ползуновский вестник. 2004; (4): 177-84.
3. Панин Л.Е., Перова А.Ю. Медико-социальные и экологические проблемы использования ракет на жидком топливе (гептил). Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2006; (1): 124-31.
References
1. Kenessov B., Alimzhanova M., Sailaukhanuly Ye., Baimatova N., Abilev M., Batyrbekova S. et al. Transformation products of 1,1-dimethylhydrazine and their distribution in soils of fall places of rocket carriers in Central Kazakhstan. Sci. Total Environ. 2012; 427-428: 78-85.
2. Ushakova V.G., Shpigun O.N., Starygin O.I. Features of chemical transformations UDMH and its behavior in the environment. Polzunovskiy vestnik. 2004; (4): 177-84. (in Russian)
3. Panin L.E., Perova A.Yu. Medico-social and environmental problems of use of liquid-propellent rockets (heptyl). Byulleten' Si-birskogo otdelenya RAMN. 2006; (1): 124-31. (in Russian)
4. Christudoss Р., Selvakumar R., Pulimood А.В., Fleming J.J., Mathew G. Unsymmetrical DMH - an isomer of 1,2 DMH - is it potent to induce gastrointestinal carcinoma in rats? Exp. Toxicol. Pathol. 2008; 59 (6): 373-5.
5. U.S. Environmental Protection Agency. 1,1-Dimethylhydrazine. 2000. Available at: http://www.epa.gov/ttn/uatw/ hlthef/dimethyl.html
6. Navarro J., Vidal R., Quitart M., Egozcue J. A method for the sequential study of synaptonemal complex by light and electron microscopy. Hum. Genet. 1981; 59 (4): 419-21.
7. Kolomiets O.L., Matveevsky S.N., Bakloushinskaya I.Yu. Sexual dimorphism in prophase I of meiosis in mole vole (Ellobius talpinus Pallas) with isomorphic (XX) chromosomes in males and females. Comp. Cytogenet. 2010; 4 (1): 55-66.
8. Tassistro V., Ghalamoun-Slaimi R., Saias-Magnan J., Guichaoua M.R. Chronology of meiosis and synaptonemal complex abnormalities in normal & abnormal spermatogenesis. Indian J. Med. Res. 2009; 129 (3): 268-78.
9. Madan K. Balanced complex chromosome rearrangements: reproductive aspects. A review. Am. J. Med. Genet. A. 2012; 158A (4): 947-63.
10. Guiraldelli M.F., Eyster C., Wilkerson J.L., Dresser M.E., Pezza R.J. Mouse HFM1/Mer3 is required for crossover formation and complete synapsis of homologous chromosomes during meiosis. PLoS Genet. 2013; 9 (3): e1003383.
11. Adler I.D. Comparison ofthe duration of spermatogenesis between male rodents and humans. Mutat. Res. 1996; 352 (1-2): 169-72.
Поступила 10.11.14 Принята к печати 30.12.14
Методы гигиенических исследований
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 613.5:697.94]-078
РахманинЮ.А.1, Шибанов С.Э.2, Козуля С.В.2
ВЫБОР САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ БЕЗОПАСНОСТИ СПЛИТ-СИСТЕМ
1ФГБУ «НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина» Минздрава России, 119991, Москва; 2ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», 295007, Симферополь, Республика Крым
Цель работы - обобщить данные о микрофлоре, заселяющей сплит-системы для выбора санитарно-показа-тельных микроорганизмов, чье присутствие в пробах будет свидетельствовать о необходимости проведения очистки и дезинфекции сплит-систем.
Материал и методы. При выборе санитарно-показательных микроорганизмов, указывающих на загрязнение сплит-систем, использованы в первую очередь данные пятилетней работы авторов в направлении разработки профилактических мероприятий, направленных на снижение частоты заболеваний органов дыхания, связанных с использованием локальных систем кондиционирования воздуха. Также использовали данные источников литературы.
Результаты. Для выбора индикаторной микрофлоры, указывающей на загрязнение сплит-системы и необходимость проведения ее обработки, мы предлагаем использовать 9 критериев, каждому из которых присвоено числовое значение от 0 до 3 баллов (опасность для здоровья, распространенность заболевания, установленная эпидемиологическая связь, скорость заселения сплит-системы микроорганизмами, сложность культивации, устойчивость во внешней среде, устойчивость к дезинфицирующим средствам, частота выявления в домашних системах кондиционирования, частота выявления в системах кондиционирования общественных зданий). Подсчет суммы баллов позволяет выделить два индикаторных микроорганизма, определение которых в биопленке будет свидетельствовать о небезопасности сплит-систем и необходимости проведения их очистки и дезинфекции: Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Данная микрофлора также будет являться критерием качества проведенной обработки сплит-систем - определение вышеупомянутых микроорганизмов в пробах после очистки и дезинфекции систем кондиционирования будет говорить о низком качестве проведенной работы.
Выводы. 1. Поскольку сплит-системы заселяются условно-патогенной и патогенной микрофлорой, они могут представлять угрозу здоровью людей, находящихся в помещениях, где эти системы кондиционирования установлены. 2. Для предотвращения вероятного ущерба здоровью необходима разработка нормативной базы, согласно которой должен осуществляться санитарно-гигиенический контроль за эксплуатацией сплит-систем. 3. Предложенные нами критерии позволяют считать Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus
