CC BY
19УДК 599:539.1.047
В.П. Мамина, О.А. Жигальский
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И КСЕНОБИОТИКОВ НА СПЕРМАТОГЕННЫЙ ЭПИТЕЛИЙ И ВЫХОД ДОМИНАНТНЫХ ЛЕТАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки. Институт экологии растений и животных УрО РАН, г.
Екатеринбург
Проведена оценка состояния сперматогенного эпителия и выхода доминантных летальных мутаций у мышей линии BALB/c и CBA, подвергнутых действию тотального у- облучения и у крыс линии Вистар после внутрибрю-шинного введения бихромата калия (K2Cr207) в малых и сублетальных дозах. У линии BALB/c при малой дозе облучения (0,25 Гр) выявлен стимулирующий эффект на сперматогенный эпителий, у CBA подобный эффект отсутствует. У мышей обеих линий облучение в дозах 0,25 Гр и 1,0 Гр вызывает увеличение процента патологических форм сперматозоидов и процента доимплантационной гибели эмбрионов. У крыс введение бихромата калия в дозах 0,028 мг/кг и 2,8 мг/кг приводит к увеличению числа сперматид с микроядрами, процента патологических форм сперматозоидов и процента постимплантационной гибели. Таким образом, снижение общей эмбриональной смертности при воздействии облучения происходит за счет доимплантационной гибели эмбрионов, при воздействии шестивалентного хрома — за счет постимплантационных потерь.
Ключевые слова: ионизирующее излучение, шестивалентный хром (Cr VI), сперматогенный эпителий, доминантно-летальные мутации.
V.P.Mamina, O.A. Zhigalsky. Comparative analysis of ionizing radiation and xenobiotics influence on spermatogenic epithelium and on dominant lethal mutations output in laboratory animals
Federal state budgetary establishment of the Science. Institute of Plant and Animal Ecology, Ural Division of Russian Academy of Sciences, Ekaterinburg
The study covered state of spermatogenic epithelium and dominant lethal mutations output in mice of BALB/c and CBA lines, subjected to total gamma-irradiation and in Wistar rats after intraperitoneal injection of potassium bichromate (K2Cr2O7) in small and sublethal doses. The BALB/c line mice under low irradiation dose (0.25 Gy) demonstrated stimulation effect on spermatogenic epithelium, but in the CBA line mice no such effect was seen. Both mice lines under irradiation of 0.25 Gy and 1.0 Gy demonstrated increase in pathologic sperm counts and in percentage of preimplantation embryonal death. In rats, injection of potassium bichromate in doses of 0.028 mg/kg and 2.8 mg/kg increased number of micronuclear spermatids, larger pathologic sperm counts and percentage of postimplantation deaths. Thus, lower general embryonal deaths under radiation exposure is due to preimplantation embryonal deaths, under exposure to 6-valent chromium — is due to postimplantation losses.
Key words: ionizing radiation, 6-valent chromium, spermatogenic epithelium, dominant lethal mutations.
На сегодняшний день в связи с ростом идиопатиче-ского мужского бесплодия [15] проблема воздействия химических и физических факторов окружающей среды на репродуктивную функцию мужчин остается весьма актуальной. Известно, что оценка химических веществ проводится по принципу «порога» действия, а физических факторов (ионизирующее излучение) — по принципу отсутствия «порога» действия [10]. Основными критериями вредности по изучению химических соединений являются органолептический, общетоксический и токсикологический. При исследовании повреждающего действия ионизирующего излучения основным показателем является вероятность канцерогенного эффекта и генетических последствий. В литературе накоплена достаточно обширная информация по изолированному действию ионизирующего излучения и химических веществ на генеративную функцию теплокровных животных [4,8,17]. В перечень потен-
циально опасных химических веществ по действию на репродуктивную функцию человека входят соединения шестивалентного хрома [11]. Экспериментальные и клинические исследования, проведенные в области репродуктивной токсикологии, показали, что гонады самцов более чувствительны к воздействию радиационных и химических факторов, чем женские половые железы [14]. Литературные данные, касающиеся воздействия ионизирующего излучения и шестивалентного хрома в малых дозах на гонады самцов незначительны и зачастую носят противоречивый характер. По-видимому, это обусловлено, прежде всего, тем, что отсутствует единый теоретический подход в гигиенической оценке повреждающих эффектов различной природы. Для сравнительной оценки токсичности вредных агентов (химической и физической природы) необходимо использовать единые, обобщенные показатели, такие как гонадотоксичность, эмбри-
отоксичность, мутагенность и другие. В связи с этим предпринята попытка сравнительной морфофункцио-нальной оценки семенников лабораторных животных при воздействии ионизирующего излучения и шестивалентного хрома в малых и сублетальных дозах, а также эмбриотоксических эффектов после спаривания с интактными самками.
Материал и методики. Исследования проведены на половозрелых самцах мышей линии BALB/c (100 особей), СВА (100 особей), крыс линии Вистар (42 особи) и самках (мышей по 48 особи в каждой линии и крыс — 24 особи). Всего использовано мышей — 200 самцов и 96 самок, крыс — 42 самца и 24 самки. Проведенный эксперимент соответствует этическим нормам работы с животными [5], на основе руководства ВОЗ, зарубежных и отечественных методических рекомендаций и указаний по оценке репродуктивной токсичности химических соединений [6]. Мышей подвергали тотальному у-облучению на установке «ИГУР-1» в дозе 0,25 и 1,0 Гр, мощность дозы 1,2 Гр/мин (LD50/30 для линии BALB/c составляет 7,2 Гр, для СВА — 9,0 Гр). Моделирование хромовой интоксикации осуществлялось у двух групп самцов при ежедневном внутрибрюшинном введении бих-ромата калия (К2Сг207) на протяжении одного цикла сперматогенного эпителия (48 дней) в диапазоне доз кратным от LD50: 1/1000 (1-я группа животных) и 1/10 (2-я группа), что составляет 0,028 и 2,8 мг/кг массы тела по веществу. Цитологическую оценку состояния сперматогенеза проводили на мазковых препаратах из клеточного гомогената семенников [2]. Основными показателями служили сперматограмма — распределение различных типов половых клеток (%), митотическо-мейотический индекс — учет доли сперматид с микроядрами (%о). Из хвостовой части эпидидимиса выделяли сперматозоиды для получения мазковых препаратов (морфологический анализ) и определения подвижности сперматозоидов [7]. Для определения частоты доминантно-летальных мутаций (ДЛМ) к каждому самцу подсаживали на неделю двух интактных девственных самок. Животных умерщвляли на 20-й день беременности и анализировали эмбриональный материал. У мышей частоту ДЛМ определяли при воздействии облучения на пре- и постмейотические клетки [13]. В 1-ю неделю после облучения в оплодотворении участвуют гаметы, которые во время облучения находились на стадии зрелой спермы, с 11-го по 21-е сутки — на стадии сперма-тид, с 22 по 24-е — на стадии сперматоцитов, с 29 со 35-е сутки — на стадии сперматогоний.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программного пакета «^айзйса 6.0» с использованием непараметрического и-критерия Уилкоксона-Манна-Уитни [3].
Результаты и их обсуждение. У мышей линии BALB/c на 8-16-е сутки после облучения в малой дозе (0,25 Гр) происходит стимуляция пролиферативной активности сперматогенного эпителия (возрастает мито-
тическо-мейотический индекс), что приводит к возрастанию числа сперматогоний (р <0,05). Стимулирующий эффект (гормезис), по-видимому, связан с опосредованным действием облучения через нейрогумораль-ные механизмы. Сперматогенез — гормонозависимый процесс. Эндокринная часть семенника находится под контролем гонадотропных гормонов гипофиза — фол-ликулостимулирующего (ФСГ), который способствует митотическому делению сперматогоний и лютеини-зирующий гормон (ЛГ), стимулирующий продукцию тестостерона, который влияет на возобновление стволовых клеток [1]. Изменения, которые происходят в системе гипоталамус — гипофиз — гонады под воздействием облучения в пределах малых доз могут служить компенсаторно-защитной реакцией, благодаря которой создаются оптимальные условия для восстановления нормальной функции семенников (сохранение общей численности сперматогенных клеток). К 32-м суткам пролиферативная активность снижается, и количество сперматогоний достигает контрольного уровня. У мышей линии СВА гормезис отсутствует, по-видимому, это связано с тем, что они более радиоустойчивы, чем BALB/c (LD50/30 для линии BALB/c составляет 7,2 Гр, для СВА — 9,0 Гр). Анализ спермограммы показал, что на 32-е сутки после облучения у мышей обеих линий возрастает процент патологических форм сперматозоидов (р <0,05), у мышей BALB/c к тому же снижается и подвижность сперматозоидов (р <0,05).
При облучении мышей обеих линий в сублетальной дозе (1,0 Гр) изменений в сперматограмме не наблюдается. При анализе спермограммы на 24, 32-е сутки после облучения у мышей линии BALB/c возрастает процент патологических форм сперматозоидов и снижается подвижность сперматозоидов (р <0,05), у мышей СВА подобные изменения отмечаются лишь на 32-е сутки после облучения.
В результате спаривания экспериментальных самцов с интактными самками, когда в оплодотворении участвуют сперматозоиды, облученные в дозе 0,25 Гр на стадии сперматогоний, у обеих линий мышей происходит увеличение доимплантационной гибели эмбрионов (отношение разницы числа желтых тел и мест имплантаций к числу желтых тел). Возрастание доимплантационной гибели эмбрионов наблюдается при спаривании мышей линии BALB/c, когда в оплодотворении участвуют сперматозоиды, облученные в дозе 1,0 Гр на всех стадиях сперматогенеза (р <0,05), а у линии СВА — на стадиях сперматогоний и сперматоцитов (р <0,05). При изучении разных видов генетических повреждений (ДЛМ, РЛМ, ПЛМ) было обнаружено, что у самцов мышей половые клетки находящиеся на разных стадиях сперматогенеза, располагаются по мере возрастания генетической радиочувствительности в следующем порядке: сперматогонии, сперматоциты, сперматозоиды, сперматиды [9]. Различия в частоте возникновения мутаций в половых клетках на разных стадиях сперматогенеза определяются как особенностями, присущими наследственным структурам клеток, так и
биосинтетическими процессами, протекающими в них [16]. Эти особенности могут влиять на репарационные процессы, происходящие в хромосомах поврежденных клеток [12]. Увеличение доимплантационных потерь возможно обусловлено снижением оплодотворяющей способности сперматозоидов или внесением в зиготу таких нарушений, которые препятствуют дроблению яйца [13]. У крыс после введения бихромата калия в исследуемых дозах возрастает число сперматид с микроядрами и процент патологических форм сперматозоидов (р <0,05). Микроядерный тест (экструзия части генетического материала ядра в цитоплазму) отражает мутагенный эффект вещества. При дозе 2,8 мг/кг происходит снижение числа сперматоцитов (р <0,05), которое может быть обусловлено блокированием процессов митоза и мейоза. Результаты спаривания экспериментальных самцов с интактными самками показали снижение эмбриональной смертности за счет постим-плантационных потерь (р <0,05).
Известно, что генетические изменения в половых клетках, приводящие к доминантно-летальным мутациям, могут вызывать гибель эмбрионов как до имплантации (ранние летальные мутации — РЛМ), так и после имплантации (поздние летальные мутации — ПЛМ). РЛМ могут быть результатом снижения оплодотворяющей способности сперматозоидов генетического и не генетического характера. Поэтому, в качестве основного показателя мутагенного действия факторов различной природы используют постимплантационную гибель (поздние летальные мутации — ПЛМ).
Результаты исследований показали, что при воздействии облучения в малых дозах снижение эмбриональной смертности происходит за счет РЛМ, которые связаны не столько с генетическими нарушениями в половых клетках, сколько со снижением оплодотворяющей способности сперматозоидов (увеличение патологических форм сперматозоидов, снижение подвижности).
Патологические формы сперматозоидов представлены аномальными головками и изменениями хвостовой части. Имеются данные, что повышение частоты АГС не связаны с реципрокными транслокациями или крупными хромосомными аберрациями, а обусловлено точко-выми мутациями или мелкими делециями [13]. Наблюдаемое снижение подвижности сперматозоидов связано с нарушениями их в хвостовой части. При воздействии шестивалентного хрома в малых дозах снижение эмбриональной смертности происходит за счет ПЛМ, которые обусловлены генетическими повреждениями в половых клетках (увеличение числа сперматид с микроядрами и сперматозоидов с аномальными головками).
Выводы. 1. В условиях эксперимента при воздействии различных по природе факторов у лабораторных животных наблюдаются однонаправленные изменения показателей репродуктивной функции: увеличение патологических форм сперматозоидов и общей эмбриональной смертности. 2. Шестивалентный хром в исследуемых дозах обладает наиболее выраженным, по сравнению с облучением, мутагенным эффектом. 3.
Механизмы мутагенного эффекта ионизирующего излучения и шестивалентного хрома в малых дозах имеют различную природу: при воздействии облучения снижение эмбриональной смертности происходит за счет ранних летальных мутаций (РЛМ), при воздействии шестивалентного хрома — за счет поздних летальных мутаций (ПЛМ). 4. Высокий уровень доминантно-летальных мутаций говорит о том, что репаративные системы клеток не способны полностью компенсировать повреждающее действие исследуемых факторов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ (см. REFERENCES пп. 15-17)
1. Гормональная регуляция размножения у млекопитающих / Под ред. К.Остина, Р Шорта. — М.: «Мир». 1987.
2. Иванов Ю.В. // Гиг. и сан. — 1986. — № 4 — С. 52-55.
3. Кобзарь А.И. Прикладная математическая статистика. — М., 2006.
4. Мамина В.П. О механизмах действия малых доз ионизирующей радиации на сперматогенный эпителий // Проблемы репродукции. — 2003. — Т.9.№2 — С. 22-24
5. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных. Основные принципы // Ланималогия. 1993.1. С.22.
6. Методические рекомендации по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств: 98/304. 1998.
7. Молнар Е. Общая сперматология. — Будапешт,: АН Венгрии, 1969. — 393с.
8. Никитин А.И. Вредные факторы среды и репродуктивная система человека (ответственность перед будущими поколениями) 2-е изд., дополненное. — С-Пб, 2008. — 240 с.
9. Померанцева М.Д., Чехович А.В., Рамайя Л.К., Ефименко И.А. // Радиационная биология. Радиоэкология. — 1995. — Т.35. — В.5. — С. 765-772.
10. Рамзаев П.В., Машнева Н.И. Принципы сравнительной оценки радиационного и химического факторов. — Энергоа-томиздат,. 1984. — 84 с.
11. Хром. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 61. ВОЗ. Женева. 1990.
12. Шапиро Н.И. Радиационная генетика. В сб.: Основы радиационной биологии. — М.:, Наука, 1964. — с.131.
13. Шевченко В.А., Померанцева М.Д. // Генетические последствия действия ионизирующих излучений. — М.: Наука, 1985. — С. 41-42.
14. Шейко Л.Д., Мамина В.П. // Уральское медицинское обозрение. — 1998. — №1 — С. 87-89.
REFERENCES
1. Hormonal regulation of reproduction in mammals. K. Ostin, R. Short, eds. — Moscow: «Mir», 1987 (in Russian).
2. Ivanov YuV. // Gig. i san. — 1986. — 4. — Р. 52-55 (in Russian).
3. Kobzar A.I. Applied mathematic statistics. — Moscow, 2006 (in Russian).
4. Mamina V.P. On mechanisms underlying effects of ionizing radiation in small doses on spermatogenic epithelium. Problemy reproduktsii. — 2003. — V. 9. — 2. — Р. 2-24 (in Russian).
5. International recommendations on conducting medical and biologic studies with laboratory animals. Main principles. Lanimalogia, 1993. — 1. — P. 22 ( in Russian).
6. Methodic recommendations on preclinical study of reproductive toxicity of pharmacologic substances; 98/304, 1998 (in Russian).
7. Molnar E. General spermatology. — Budapest: AN Vengrii, 1969. — 393 p. (in Russian).
8. Nikitin A.I. Environmental hazards and human reproductive system (responsibility to descendants). 2nd edition, added. — St-Petersburg, 2008. — 240 p. ( in Russian).
9. Pomerantseva M.D., Chekhovich AV., Ramayya L.K., Efimenko I.A. // Radiatsionnaya biologiya. Radioekologiya. — 1995. — V. 35. — 5. — P. 765-772 (in Russian).
10. Ramzaev PV.Mashneva N.I. Principles of comparative evaluation of radiation and chemical factors. — Energoatomizdat, 1984. — 84 p. (in Russian).
11. Chromium. Hygienic criteria of environmental state. Issue 61. WHO. Geneva, 1990 (in Russian).
12. Shapiro N.I. Radiation genetics. In: Basic radiation biology. — Moscow: Nauka, 1964. — 131 p. (in Russian).
13. Shevchenko V.A., Pomerantseva M.D. Genetic consequences of ionizing radiation. — Moscow: Nauka, 1985. — Р. 41-42 (in Russian).
14. Sheyko L.D., Mamina V.P. // Ural'skoe meditsinskoe obozrenie. — 1998. — 1. — Р. 87-89 (in Russian).
15. Dohle G.R., Diemer T., Giwercman A. Europ.Assoc. Urology,2010.
16. Russell L.B., Saylors C.L. Science, 1960. — 131. — Р. 1321-1322.
17. Usha Rani Acharya et al. // Reproductive Toxicology 2006. — № 22. —Р. 87-91.
Поступила 25.02.2014
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Мамина Вера Павловна,
ст. науч. сотр. лаб. экологического прогнозирования, канд. биол.наук. E-mail: mamina@ipae.uran.ru. Жигальский Олег Антонович,
зав.лаб. экологического прогнозирования, д-р биол. наук. E-mail: zig@ipae.uran.ru.
УДК 6/3.648-613.875
Б.Ж. Култанов., Т.Т.Едильбаева., А. А. Турмухамбетова., Р.С. Досмагамбетова ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ПОРАЖЕНИИ
Карагандинский государственный медицинский университет, Казахстан
Представлены результаты изучения влияний ионизирующей радиации на организм экспериментальных животных при абсолютно летальных дозах 8 грей. При однократном тотальном облучении у крыс наблюдаются изменения продуктов липоперекисного каскада и угнетения активности ферментов антиоксидантной защиты в генеративных клетках, что приводит к нарушению метаболического процесса.
Ключевые слова: ионизирующая радиация, продукты липоперекисного каскада, ферменты антиоксидантной защиты.
B.Zh.Koultanov, T.T.Edil'bayeva, A.A.Tourmukhambetova, R.S. Dosmagambetova. Oxidative metabolism in radiation injury
Karaganda state medical university, Kazakhstan
The article represents results of studies concerning influence of ionizing radiation on experimental animals under absolutely lethal doses of 8 Gy. In single total irradiation the rats demonstrate changes in lipoperoxic cascade products and suppressed activity of anioxidant defence enzymes in generative cells — that causes metabolic disorders.
Key words: ionizing radiation, lipoperoxic cascade products, antioxidant defence enzymes.
Значительный дисбаланс гомеостаза [1,4] вызывается воздействием ионизирующего излучения, который является стресс-агентом, оказывая чрезвычайную функциональную нагрузку на организм.
Комплексное исследование состояния антиокислительной системы и содержания продуктов ПОЛ в органах и тканях необходимо для выявления механизмов действия ионизирующего излучения [3]. Устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов
внешней и внутренней среды определяется состоянием перекисного окисления липидов. При облучении организма наблюдается усиление свободнорадикаль-ного окисления (СРО) липидов [5].
Усиление СРО с накоплением продуктов ПОЛ, изменения в системе АОЗ, нарушения клеточных мембран, угнетение ряда реакций обмена веществ, активация протеолитических процессов, токсемия, сбои генетического аппарата и процессов клеточного деле-
