CC BY
44
Медицинская иммунология 2001, Т.З, № 1. аир 15-19 © 2001, СПб РО РАЛКИ
Обзоры
ЦИТОКИНЫ У БОЛЬНЫХ С АТОПИЕЙ И БЕЗ АТОПИИ - ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
Фрейдхельм Диел
Institute of Environment and Health (IUG) and University of Applied Sciences FH Fulda
Ключевые слова: атопия, цитокипы, факторы внешней среды.
Введение
В настоящее время предпринимаются попытки уточнить характер функционирования цитокиновой системы, которая позволяет представить особенности регуляции функций иммунной системы млекопитающих [7,131. Первый этап иммунной защиты обеспечивается такими клетками, как фагоциты (MF),aHTnren-специфические Т-клетки (несущие Т-клеточный рецептор, TCR), естественные киллеры (NK), тучные клетки (MC), клетки Лангерганса (LC), эозинофилы, а также факторами гуморального иммунитета, к которым относятся антитела, компоненты комплемента и также играющие немаловажную роль провоспалитель-ные цнтокины, такие, как интерферон (IFN), интерлейкины (IL-1, -6, -12 и т.д.) и фактор некроза опухоли (TNF-a). Кроме того, понимание многоплановой роли цытокиновых рецепторов, многообразия механизмов передачи сигнала при взаимодействии рецепторов с лигандами позволяет объяснить некоторые особенности функционирования такой системы. Появление высокоточных методов в молекулярной биологии, таких, как PCR и RT-PCR, которыми в настоящее время располагает любая современная лаборатория, также способствовало получению новых сведений о распределении в организме молекул и клеток иммунной системы, а также о внутриклеточной регуляции биосинтеза белка. В вопросе изучения иммунотоксикологи-ческих аспектов воздействия на организм химических соединений природного и промышленного происхождения особенный интерес представляют нарушения в структуре генов, воздействие на гены-промоторы и мутации в ДНК [ 1].
В настоящей статье внимание уделяется изучению влияния воздействия атопических и неатопн-ческих ответов па определенные химические вещества на функционирование и экспрессию цитокинов.
Адрес для переписки:
Prof. Dr. Friedhelm Diel, Head of Biochemistry, Dept, of Nutrition, University of Applied Sciences FH Fulda D-36039 Fulda - Germany.
E-mail: friedhelm.diel@he.fh-fulda.de.
Tel/Fax ++ 49-661-9640353/399.
Парадигма Th1/Th2 при аллергическом заболевании
Существуют доказательства того, что симптомы аллергии возникают в результате развития иммунного ответа через Th2 [13]. Клетки типа Th2 являются подтипом CDТ-лимфоцитов, которые накапливаются у пациентов с аллергией при усилении перехода ТхО в Th2 и подавлении ТЫ. В сыворотке больных с аллергическими заболеваниями обнаруживается экспрессия CD30+ на циркулирующих Th2 лимфоцитах, а сами CD30+ лимфоциты обнаруживаются в поврежденном участке кожи у больных с атопическим дерматитом [13]. Как видно из рис. 1, активация Th2 клеток означает стимуляцию выработки IL-4/IL-13, равно как и IL-10, который ингибирует функции ТЫ клеток. Патологическое преобладание IL-4-зависимых ответов при атопии обусловлено по меньшей мере пятью моментами:
1. Активацией наивных Th 0 клеток через стимулирующий сигнал.
2. Влиянием других CD4+ клеток в ходе диффе-ренцировки наивных ThO в ТЬ2 клетки.
3. Усилением пролиферации В-клеток и их переключением на синтез IgE.
4. Повышением секреции IL-4 в ходе дегрануляции МС.
5. Снижением экспрессии растворимого рецептора IL-4 (siL-4 R) [12].
С другой стороны, стимуляция ТЫ обеспечивает действие таких факторов супрессии Th2, как IFN, чему также могут способствовать натуральные киллеры, СГ)8+ и антиген-презентирующие клетки (АРС). Секретируемый АРС и МС итггерлейкин-12 стимулирует ТЫ и одновременно снижает активность Th2. Его эффекты близки к действию IL-18 (IGIF), который индуцирует секреторный ответ ТЫ.
С учетом того, что МНСП-зависнмая презентация антигена инициирует дифференцировку Т-хел-перов, остается открытым вопрос, какие химические функции влияют на специфическую патогенную индукцию активности Th2.
Рис. 1. Цитокины и регуляция ТМ ДИ2 лимфоцитов (мо-диф. Яотадпаш 1996). Химические вещества окружающей среды влияют на баланс 11.-4/1РМ-у (пояснения в тексте).
Механизмы развития Th2
Van Neerven [15] показал, что низкая концентрация растворимого антигена может индуцировать особую дифференцировку Т-клеток, сравнимую с действием высокой концентрации корпускулярных аллергенов, вступающих в контакт со слизистой оболочкой воздухоносных путей и гастроинтестинального тракта. После стимуляции АРС Т-клетки продуцируют преимущественно IL-2. При этом еще не ясно, каким образом происходит переключение развития с ТЫ на Th2 и наоборот. ТЫ клетки в большей степени специализированы для развития клеточного иммунитета, в то время как Th2 клетки обычно обеспечивают превращение В-клеток в антителопродуцирующие клетки. Присутствие IL-4 в момент примирования Т-клетки направляет ее дифференцировку по Th2 типу, тогда как IL-12 способствует диф-ференцировке по типу ТЫ. Кроме того, чувствительность клеток к этому цитокину зависит от регуляции экспрессии рецепторов. оф-TCR на клеточной поверхности отвечает за специфичность связывания. Как уже было отмечено ранее, даже растворимые ци-токиновые рецепторы, например растворимый рецептор IL-4 (sIL-4R), играют важную роль в иммунопатогенезе аллергических заболеваний и действии лекарственных веществ [12]. Их влияние основано на феномене ограничения продукции или доступности IL-4 для своего рецептора на поверхности клеток-мишеней. Показано, что добавление анти-sIL-
4И-антител приводит к подавлению опосредованных IL-4 функций Т- и В- клеток [2].
В итоге, связь продукции IgE с регуляторными участками на хромосоме 5q31.1 должна рассматриваться исключительно с точки зрения активации генов IL-4 в Th2 и/или МС.
Процессы, индуцированные аллергеном
Выраженность аллергической реакции зависит от аллергенных качеств молекулярной структуры и химических функций антигена, процессированного АРС. Mr более 2000 D и эпитопы, состоящие как минимум из 6-12 аминокислот (например структура петли типа “hairpin” , заколки для волос), имму-ногенная часть цепей, равно как и неспецифическое стимулирующее действие адъюванта, являются необходимыми условиями иммуногенности и/или запуска аллергических реакций. С другой стороны, АРС при помощи молекул МНС (у человека - HLA) презентируют Т-клеточному рецептору только частъ пептидов поступившего в клетку антигена. Связывание молекул В7 и CD28 является дополнительно необходимым. Предпочтительное развитие аллер-ген-специфического ответа но типу Th2 как CD4+, так и CD8+ Т-клетками определяется природой и интенсивностью сигналов от TCR при взаимодействии с аллергеном пептидной природы. Вероятно, это регулируется на генном уровне. Существуют доказательства, что у пациентов с атопией имеет место нарушение регуляции на уровне IL-4, происходящего из Th-клеток [3].
1. Пациенты с атопией продуцируют IL-4 и IL-5 во время ответа на бактериальную инвазию, тогда как у пациентов без атопии иммунный ответ развивается но типу ТЫ, что выражается, например, в продукции IFN-y.
2. У доноров с атопией показан более высокий уровень Т-клеток, продуцирующих IL-4, чем у контрольных доноров.
3. Уровень IL-4 в пуповинной крови новорожденных от родителей с атопией выше, чем у детей от родителей без атопии.
4. Клоны Т-клеток у доноров с высоким уровнем IgE содержат большое количество IL-4 и малое количество IFN-y, а у доноров с низким уровнем IgE -наоборот.
Клеточные ядерные факторы
В современных работах роль молекул II класса МНС широко изучается как с использованием генетических, так и молекулярно-биологических подходов. Если предполагать, что молекулы МНС II класса играют главную роль в связывании аллергенных пептидов на АРС, то другие гены, неассоциирован-пые с МНС, имеют большее значение в реализации
всех ^Е-связанных иммунных реакций: преобладающий ответ по типу ТЬ2; например, предоминантный ген 1Ь-4 содержит промотор с функционально значимыми участками связывания для некоторых факторов транскрипции. Можно предположить, что химические вещества в окружающей среде, если они обладают способностью проникать сквозь вне- и внутриклеточные мембраны, воздействуют на факторы транскрипции и их функции. Если говорить точнее, то химические вещества и лекарственные соединения влияют на действие ядерных факторов (№), таких, как №"-АТ, протеин связывающий последова-
тельность ССААТ, ОсС1, НМС1(У), АР-ЬтетЬегя, ЫР-кВ и др. Более поздние исследования показали, что протоонкоген - с-ша{"- способен контролировать тканеспецифическую экспрессию 1Ь-4. Еще один кандидат на эту роль - это фактор, передающий сигнал и активирующий транскрипцию (ЯТАТ). В частности, БТАТб, протеин, связывающий ДНК-последователь-ности, был обнаружен в промоторах генов, кодирующих 1Ь-4 [3]. У мышей линии В 1(Ш2 изучалась возможность участия хромосом 11 в стимуляции синтеза ^Е. Ген, кодирующий П.-4, содержит 10 локусов для ядерных факторов транскрипции, которые тесно связаны с 1Ь-13, 1Е-5 и другими провоспалительны-ми цитокинами своей группы [13]. Таким образом, вероятно, что такие факторы окружающей среды, как липофильные агенты, способны индуцировать нарушение регуляции на уровне транскрипции, что затрагивает не один, а все соседние локусы ДНК в одном и том же интерлейкиновом кластере.
Неспецифические ответы
Иммунотоксические свойства веществ зависят от характера липофильности молекулы. После проникновения через клеточную поверхность и ядерную мембрану иммунотоксические соединения могут воздействовать как на процессы репликации, так и транскрипции и трансляции. В зависимости от размера молекулы изменяется степень специфичности ее действия. В работах особенно много внимания уделяется производственным вредностям, вопросу изучения действия многих загрязняющих факторов на производственных площадях. Второе по значению место имеет вопрос о мутагенных эффектах, оказываемых на диплоидные макромолекулы ДНК. Таким образом, должен возникнуть вопрос о вредных воздействиях на одноцепочечную РНК и какова специфичность такого воздействия. Так, например, тетрах-лоро-дифенил-диохин (ТХДД) и канцерогенфорбо-ловые эфиры взаимодействуют с ДНК, но также активны в отношении одноцепочечных нуклеотидов [14]. Кроме того, использование ИТ-РСЯ позволило выявить, что определенные химические вещества в окружающей среде способны приобретать имму-номодуляторные свойства на уровне транскрипции.
Аллергическая бронхиальная астма
Аллергическая астма характеризуется перемежающимися, обратимыми затруднениями прохождения воздуха по воздухоносным путям. Определяются высокие уровни IgE, а симптомы зависят от сезонных и региональных контактов с аллергеном. Методы гибридизации in situ позволяют определить мРНК для Th2-, но не для Thl -, лимфокинов в брон-хоальвелярном лаваже (БАЛ) у пациентов с атопической астмой. Многие эксперименты подтверждают, что, как и основные аллергические заболевания, атопическая астма проявляется в нарушении регуляции баланса между 1L-4 и IFN-y. В любом случае повышение уровня продукции IL-5 и GM-CSF у астматиков не является обязательным признаком для дифференцирования атопических и неатопических процессов. Необходимо принять во внимание, что продукция IL-4 и IL-5 происходит не только от клеток Th2, но они могут секретироваться также и тучными клетками слизистой оболочки, базофилами и эозинофилами. Функции этих клеток также участвуют в формировании общего воспалительного процесса так называемого эндогенного типа астматических заболеваний.
Химические вещества окружающей среды
Было показано, что липофильные химические агенты, как пиретроидные инсектициды, обладают иммуносупрессивным действием [3,4]. Этот эффект значительно усиливается при использовании клеток крови, стимулированных РНА, взятых у доноров с атопией, по сравнению с клетками от доноров без атопии. Эффективные концентрации пиретроидов (например перметрина) в 3-дневных культурах стимулированных РНА клеток - периферических мо-нонуклеаров - находятся в диапазоне Ю'°М. Однако другие агенты, как рицин, являются более токсичными и проявляют иммуносупрессивные свойства даже при концентрации около 10 |3М [11]. Однако необходимо учитывать, что высокая липофильность таких пиретроидов, как пирметин, способствует неспецифическому взаимодействию этих молекул в бис.лое мембран при их хроническом воздействии [10]. В этом случае локально активные молекулы пиретроидов концентрируются в более значительной степени на клеточном уровне, чем при медленном постоянном поступлении, например, из воздуха в помещении. Таким образом, самая сильная токсичность ожидается при концентрации свыше 10 5М; при этой же концентрации приобретает смысл изучение дозозависимости. Это справедливо для оценки иммунотоксичности липофильных химических веществ в окружающей среде, как пиретроидные инсектициды.
Иммуносупрессия, вызванная пиретроидными инсектицидами
Задачей нашего исследования явилось изучения влияния in vitro пиретроидов на человеческие лимфоциты и оценка основных факторов Thl - IFN-у и Th2 - IL-4 соответственно. Более того, в связи с тем, что пиретроиды способны оказывать прямое действие на выведение цитокинов из других клеток, например тучных клеток (МС) и базофилов (ВР), мы также изучали эффект высвобождения гистамина.
Кроме того, необходимо принимать во внимание синергические эффекты. Широко используемый си-нергист пиперонил-бутоксид (РВО) может усиливать токсичность инсектицидов, но одновременно повышает иммунотоксичность для млекопитающих.
Группы пораженных и непораженных пиретрои-дом добровольцев изучались в клинике и были разделены на подгруппы имевших и не имевших аллергических проявлений. Культивирование стимулированных РНА периферических мононуклеаров, равно как и определение IL-4 и IFN-y, проводили по описанным ранее методикам [4]. Через 4 часа после начала культивирования добавляли пиретроиды -перметрин, S-биоаллетрин и цифлутрие в концентрации от 4 х 10'7М до 2,5 х 10‘5М. Те же концентрации использовались для 30-минутной инкубации при оценке ГЗТ и кожных проб на предплечье, согласно соответствующим методикам [6].
Было обнаружено, что эти исследованные пиретроиды ингибировали стимулированную РНА пролиферацию Т-лимфоцитов, и этот эффект был сильнее выражен в группах с поражением пиретроидами (Р <0,01, по парному критерию Вилкоксона для 6 совпавших пар). Пороговые концентрации находятся в диапазоне около 10‘6М. Интересно, что добавление синергиста РВО (10'5М) уменьшало лимфостатический эффект пиретроидов в 3-дневных клеточных
культурах. В любом случае комбинация S-биоаллет-рина и РВО уменьшала продукцию IL-4, синтезированного Th2 (35%), как это отражено в табл. 1. Продукция IFN-y Т-хелперами 1 типа (38%) также уменьшалась в культуре клеток пациентов без атопии. Этот эффект не был столь значительным, как в группе с атопией (IL-4 : 42%, р = 0,025; IFN-y : 64%, р = 0,053). Основываясь на этих данных, можно предположить, что ингибирование пролиферации не так эффективно в случае использования комбинации пиретроидов и РВО. Принимая во внимания, что баланс IL-4/IFN-y нарушен: ответ усилен у пациентов без атопии, тогда как чувствительность повышена у пациентов с атопией. У 3 из пораженных с атопией при измерении кожных проявлений через 20 минут после нанесения на кожу перметрина и S-био-аллетрина наблюдалась зависимость ответа от дозы. Все остальные тесты в непораженных и неатопических группах были отрицательны. Пиретроиды также приводили к выбросу гистамина. Но это происходило на низком уровне ответа (двойные значения нормальных величин) и было значительным только на базофилах пациентов с атопией (р < 0,01).
Поскольку RT-PCR является чувствительной методикой, позволяющей определять как мРНК IL-4, так и мРНК IFN-y, первые измерения на 3-хдневных PH А-стимулированных культурах периферических мононуклеаров были успешны. РНА является поликлональным митогеном Т-клеток, а РНК извлекалась при помощи набора прямой экстракции (Quiagen, Germany). Обогащенная мРНК была превращена в сДНК при помощи метода олигоТ и амплифицирована с использованием методики Taqman (PerkinElmer, USA).
IL-4-специфические праймеры :
Sense AACACMCTGAGAAGGAMCCTCCTGC Anti-sense CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTC IFN-g-specific primers:
Табл.1. И-4 И ^-у ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В МОНОНУКЛЕАРАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ БЕЗ АТОПИИ (N1) И АТОПИИ (А)
N А
%
IL-4 IFN-y IL-4 IFN-y
(РНА)* 100 100 160 80
ПИР**
4 х 10 7М 100 95 120 97
2 х 10'6М 60 80 110 78
ПИР + РВО
2 х 10-* +
2 х 10'5М 35 СО СО 42 64
- 3-дневные культуры, стимулированные РНА
- ПИР = S - биоаллетрин (детали в тексте)
Sense ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT Anti-sense GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT
РНК и ДНК визуализировались методом специального окрашивания (McMaster/Carmichael 1977).
Первые результаты показали, что образцы от пациентов с атопией при сравнении с образцами от пациентов без атопии имели более значительное нарушение регуляции экспрессии интерлейкинов. В соответствии с фенотипической продукцией пиретроиды нарушали экспрессию как IL-4, так и IFN-y.
Таким образом, можно сделать вывод, что пиретроиды относятся к тем химическим веществам окружающей среды, которые действуют на определенных клеточных уровнях. Одним из таких уровней может быть воздействие на транскрипцию в цито-киновых генах в иммунокомпетентных клетках, таких как лимфоциты крови.
Заключение
Получено доказательство, что ТЫ и Th2 клетки играют важную роль в патофизиологических условиях. Происходящие в основном из Thl - IFN-y и из Th2 - IL-4, соответственно, являются индикаторами генотипических и фенотипических проявлений таких аллергических заболеваний, как атопическая астма. После распознавания антигена наивными клетками Th на поверхности APC, IL-4 индуцирует дифференцировку Т-клеток в Th2, которые самостоятельно продуцируют IL-4 для В-клсточной активации и переключают на продукцию антител класса IgE. Развитие этого процесса поддерживается IL-4 и другими факторами медиаторных клеток, таких, как тучные клетки и базофилы. В любом случае, АРС также индуцируют антагонистическое действие натуральных киллеров и CD8f посредством IL-12. Тогда как IL-10 ингибирует развитие ТЫ. Применение методики RT-PCR позволяет продемонстрировать, что экспрессия и продукция мРНК цитокипов и ци-токиповых рецепторов являются ключевыми звеньями в регуляции аллергических реакций.
Химические вещества окружающей среды липо-фильной природы, такие, как иммуносуирессивные пиретроиды, могут действовать на уровне транскрипции в лимфоцитах, воздействуя даже на кластеры цитокипов, индуцирующих аллергию в пятой человеческой хромосоме.
Первые результаты ясно показывают сдвиг баланса IL-4/IFN-y после введения химических ве-
ществ в культуры Т-клеток, стимулированных РНА. Этот эффект усиливается у пациентов с атопией при применении комбинации агентов: пиретроидов с синергистом пиперонил-бутоксидом (РВО).
Сокращения
АР-1 - активатор протеин I
АРС - антигенпрезентирующая клетка
В7 - рецептор 7 клеточной поверхности
CD - кластер дифференциации
CMaf- фактор активации макрофагов
HLT - тест либерации гистамина
HMG - протеин группы высокой изменчивости
IFN - интерферон
IGIF - фактор, индуцирующий интерферон
гамма = IL-18
IL - интерлейкин
LC - клетки Лангерганса
MF - макрофаги
MC - тучные клетки
МНС - главный комплекс гистосовместимости
Mr - молекулярный вес
NF - ядерные факторы
NF-АТ - ядерные факторы активированных
Т-клеток
NFkappaB -
НК - натуральный киллер Oct - октамер
PBMNC - мононуклеары периферической крови
РВО - пиперонил-бутоксид
PCR - полимеразная цепная реакция
РНА - фитогемагглютинин
RT-PCR - ретротранскриптная PCR
SIL-4R - растворимый рецептор IL-4
STAT - проводники сигнала и активаторы
транскрипции
Благодарности
Автор хочет выразить благодарность Stiftung Verum (Мюнхен), Bayer AG (Леверкусин) за финансовую помощь и Hanna Borck, Bianca Horr и Regina O’Sullivan за помощь.
Научный перевод - Саватеева A.B. (НИИЭМ РАМН, отдел иммунологии).
Med. Immunol.
2001, vol. З, № l, pp 21-25 ©2001, СПб PO РА АКИ
CYTOKINES IN ATOPICS AND NON-ATOPICS - INFLUENCES OF ENVIRONMENTAL CHEMICALS?
Friedhelm Diel
Institute of Environment and Health (IUG) and University of Applied Sciences FH Fulda, Germany
Introduction
In recent work attempts were made to elucidate a cytokine network which describes the regulation of immune functions in mammals. (ROMAGNANI 1996, DY et al. 1999) The first line of immunological defense is provided by cells like phagocytic cells (Ma), T cell receptor (TCR) T cells, natural killer (NK) cells, mast cells (MC), Langerhans’ cells (LC), eosinophils as well as humoral factors like antibodies, complement components and last not least pro-inflammatory cytokines, such as interferons (IFNs), interieukins (IL-1, -6, -12 etc.) and tumor necrosis factor (TNF-a). Furthermore the understanding of the multimeric nature of cytokine receptors as well as the mechanisms of signal transduction after ligand receptor interaction provided some explanations for these properties. The development of certain molecular biology methods like PCR and RT-PCR, which are available for every laboratory today, were another approach to receive a better knowledge of immune factor expansion and infra-cellular regulation of protein biosynthesis. Gene-targeted disruptions, pro-moter-gene influences and DNA-mutation seemed to be predominantly interesting in respect to the (immuno-)toxical characterization of environmental and occupational chemicals (BASKETTER et al. 1995).
In the following article atopic and non-atopic responses of certain chemicals on cytokine function and expression are focused.
The Thl/Th2 paradigm in allergic disease
Evidence support the concept that atopy symptoms are initiated by a Th2-type response (ROMAGNANI 1996) Th2-like cells are subsets ofCD4 T lymphocytes which are accumulated in atopic subjects and preferentially expand Th2 and suppress Thl-like cells. Th2 expressing of circulating CD30 can be detected in the allergic serum and CD30+ T cells are present in the le-sional skin of atopic dermatitis patients. (ROMAGNANI 1996) As it is demonstrated in Figure 1 activation of Th2 cells means upregulation oflL-4/IL-13, but
also IL-10 which inhibits Thl function. The pathological rebundance ofIL-4 dependent responses in atopy is at least 5-fold:
1. Activation of naive Th cells via positive induction.
2. Support ofCD4+ cells to activate naive Th cell differentiation to Th2 cells.
3. Increase of B-cell proliferation and switch to JgE-production.
4. Increase ofIL-4 secretion after anaphylactic reaction of MC.
5. Decrease of the expression of soluble IL-4-recep-tor (S JL-4 R) (RENZ 1999).
On the other hand upregulation of Thl supports the Th2 suppressing factors like IFNs which can be also contributed by other cells like NK, CD8+ and antigen presenting cells (APC). Especially IL-12 from APC and Ma stimulates Thl but decreases Th2 activity. This is similar to IL-18 (IGIF) which induces the Thl secretory responses. As MHCII dependent presenting antigen initiates the development ofTh differentiation the question remains open what are the chemical functions, which influence the specific pathogenic induction of Th2 development.
Mechanisms of Th2 development
VAN NEERVEN et al. (1996) have reported that low concentration of soluble antigen may induce distinct T cell differentiation compared with high concentration of corpuscular allergens which are contacted upon the mucose tissue of inhalative and digestive organs. After APC stimulation T cells produce predominantly IL-2. However it is still unclear how does the switch look like predicting Thi or Th2 development. Th 1 cells are more suited for the enhancement of cellular immunity, while Th2 cells are better qualified in helping B-cells to develop into antibody-producing cells. The presence of IL-4 at the time of T-cell priming drives differentiation towards the Th2 type, while IL-12 favors Thl differentiation. Furthermore the sensitivity of cells to given cytokine is dependent on the regulated expres-
Figure 1. Cytokines and the regulation of Th^h2 lymphocytes
(mod. Romagnani 1996). Environmental Chemicals influence the IL-4/ IFN-y-balance (For furtherexplanations see text).
sion of receptors, a- and 3-chains a the cell surface provide for specifity of binding. Even soluble cytokine receptors, such as the soluble IL-4-receptor (sIL-4R) are of certain importance in the immunopathogenesis of allergic disease and drug management as it has already mentioned above. (RENZ 1999) This is based on the intriguing concept to limit the production or the accessibility ofIL-4 to its receptor. The addition of anti sIL-4R antibodies have recently be shown to suppress JL-4 mediated T- and B-cell functions (BECKMANN et al. 1992).
Finally a linkage of overall IgE to markers in chromosome 5q31.1 must be considered especially to the Th2 and/or MC derived IL-4 gene.
Allergen induced
The severity of allergic response depends on the allergenic potency of the molecular structure and chemical functions of the APC-recognized antigen. Mr > 2000 and epitopes of at least 6-12 amino acid (e.g. hairpin loop structure) immunogenic side chains as well as unspecific adjuvant stimulus are necessary for optimal immuno-genicity and/or allergic reactions. On the other hand APCs present only a part of the total antigen coming into cell to cell contact with TCR-T-cells via MHC (HLA in humans)-receptors. And B7 and CD28 recognition is necessary additionally. But this depends on species specific regulation. The preferential development
of allergen-specific Th2-like responses is determined by the nature and the intensity of TCR signalling of the allergen peptide ligand on both CD4+ and CD8+T-cells. And this is probably controlled at genetic level. There is some evidence that in atopic patients exist dysregula-tion at the level ofTh-cell-drived IL-4: (MAGGI et al. 1999)
1) Atopic individuals produce IL-4 and IL-5 in response to bacterial challenge, non-atopic controls Thl-like responses like IFN-y-production.
2) Atopic donors show higher IL-4-producingT-cells than normal controls.
3) IL-4 in cord blood is higher in newborns of atopic than of non-atopic parents.
4) T-cell clones from high-IgE-donors show high amounts of JL-4/low IFN-y; low-IgE-donors vice versa...
Cell nuclear factors
In recent work the role of MHC class II molecules has been extensively investigated by both genetic and molecular approaches. Suggesting that the class II molecules can play a permissive role in the binding of allergen peptides on APC, other non-MHC-associated genes are more important in the overall IgE immune response: prevalent Th2-type-response; e.g. the predominant IL-4-gene contains a promoter with functionally important binding sides for several transcription factors. The speculation must be allowed to suggest that environmental chemicals, if they are able to penetrate extra- and intracellu-lare membranes, influence the transcription factors and its responses. More concretely, chemicals and drugs influence the action of nuclear factors (NF) like NF-AT, CCAAT box binding protein NF-Y, Octi, HMGI(Y), AP-1-members, NF-kB etc.. More recently the proto-onco-gene, c-maf, has also be shown to control tissue-specific expression of IL-4. Another candidate in this sense is the signal transducing and activator of transcription (ST AT). Particular STAT 6 a protein that binds to DN A-sequences were found in the promoters of IL-4 responsive genes. (MAGGI 1999) In B10.D2 mice the chromosome 11 -synetic with the above mentioned human chromosome 5 - has been studied to be responsable for upregulation of IgE synthesis. The IL-4-gene contains 10 loci for nuclear factors of transcription, which are closely connected to IL-13, IL-5 and other inflammatory interleukins in a common cluster. (ROMAGNANI 1996) Therefore it is likely that environmental factor like lipophilic agents are able to induce dysregulation at the transcription level affecting not only one but also neighbourhood DNA-loci in one and the same IL-cluster.
Unspecific responses
Immunotoxicity of agents corresponds to the lipophilic character of the molecule. Aftel penetrating cell surface and nucleus membrane immunotoxic compounds
can influence replication as well as transcription and translation. Depending on the seize of the molecule the effect is more or less unspecific. Especially in occupational health research a lot of work has been done to characterize the mutagenecity of certain hazards at the working place. Less interest can be stated in respect to other than mutagenic effects at the diploid DNA-mac-romolecules. So the questions has to be raised, what is about the interfering actions with the one-strained RNA-nucleotides and what is the specificity of the reaction? E.g. Tetrachloro-diphenyl-dioxin (TCDD) and the cancerogen phorbol esters has been demonstrated to be interactive with DNA but also reactive with one-strained nucleotides. (STERNER 1999) Furthermore RT-PCR-experiments indicated that certain environmental chemicals may obtain immunmodulatory potency on the transcription level. (DIEL et al. 1999a)
Human allergic asthma
Allergic asthma is charcterized by intermittent, reversible airway obstruction. Elevated IgE levels are observed and symptoms correlate with seasonal and regional allergen challenge. In situ hybridisation techniques show mRNA for Th2, but not for Thl, lymphokines in bronchoalveolar lavage (BAL) cells of patients with atopic asthma. (ROBINSON et al. 1992) Many experiments give evidence that in accordance to general allergy diseases atopic asthma results a dysregulation oflL-4/IFN-y-balance.
However elevated IL-5 and GM-CSF production in asthmatics is not essential indicating different characteristics between atopies and non-atopics. It must be taken in consideration that the interleukins IL-4 and IL-5 are not only originated to Th2 cells, but can also be secreted by mucose mast cells, basophils and eosinophils. The function of these cells is also integrated in the common inflammatory process of the so-called intrinsic type of asthmatic disorders.
Evironmental chemicals
It has been reported that lipophilic chemicals like pyrethroid insecticides obtain immunosuppresive potency. (DIEL et al. 1998a) This effect is significantly aggravated using PHA-stimulated blood cells from atopic in comparison with non-atopic donors. The effective pyrethroid (e.g. permethrin) concentrations were in the range 10'6M in 3 days PHA-stimulated PBMNC cultures. However other agents like ricin are more toxic and show iinmunesuppressive dysregulation even at concentrations in the range 1013M. (PAROMOV et al. 1999) But it must be taken into account that the elevated lipophilicity of pyrethroids like permethrin facilitates a non-specific interaction with cell membranes and causes a non-concentration-dependent accummulation of these molecules into the membrane bi-layers after chronic low-level exposure. (MOYA-QUILES et al. 1996) In this case the locally active pyrethroid molecules are higher concentrated on the cellular level than chronic low concentrated exposure e.g. in the indoor air. Therefore worst cas< toxicity must be considered and concentration-response analyses seem to be necessary in the range up to 10 5M. This is true for the immuno-toxicity assessment of lipophilic environmental chemicals like pyrethroid insecticides.
Immune suppression caused by pyrethroid insecticides
The aim of our studies was to examine the in vitro effects of pyrethroids on human blood lymphocytes and to measure the predominant Thl factor IFN-y and Th2 factor IL 4 respectively. Furthermore, since pyrethroids may cause a direct release of Cytokines from mediator cells like mast cells (MC) and basophils (BC), the histamine-releasing effect was also tested.
Additionally synergistic effects must be taken in consideration. The widely used synergist piperonyl-butox-
Table 1. IL-4 AND IFN-y AFTER CHALLENGE OF ENVIRONMENTAL CHEMICALS OF NON-ATOPICS (N) AND ATOPICS (A)
PBMNC
N A
(%)
IL-4 IFN-y IL-4 IFN-y
(PHA)* 100 100 160 80
Pyr** 4x107 100 95 120 97
2x10'6M 60 80 110 78
Pyr + PBO
2x10'6+2x105M 35 38 42 64
- 3-days cultures PHA-stimulated; ** - Pyr = S-bioallethrin (for further details see text)
ide (PBO) may cause an aggravation of the insecticidal toxicity, but also increase immunotoxicity in mammals. Groups of pyrethroid exposed and non-exposed volunteers were examined clinically and divided in allergic and non-allergic subjects. PHA-stimulated PBMNC cultures as well as IL-4- and IFN-y-determination were performed as described previously. (DIEL et al. 1998b) 4 hours postplating the pyrethroids, permethrin, S-bioallethrin, and cyfluthrin, were added in the concentration range 4x10" 7M up to 2.5 xlO'5M. The same concentrations were used for the 30 min incubation ofHLT and scratch tests on the forearme as described elsewhere. (DIEL et al. 1999b) It could be demonstrated that the tested pyrethroids inhibited the PHA-stimulated T-lymphocyte proliferation and that this effect is significant in the pyrethroid exposed groups. (P <0.01, Wilcoxon 6 matched pairs) Threshold concentrations are in the range 10 GM. Suprisingly, addition of the synergist PBO (lO'^M) reduced the lymphos-tatic potency of the pyrethroid in the 3 day cell cultures. However combined agents of S-bioallethrin and PBO reduced the Th2-derived IL-4-production (35 %) as it is demonstrated in Table 1. The Thl-derived IFN-y-pro-duction (38 %) is also reduced in the cell cultures of the non-atopic subjects. This effect was not as significant as in the atopic group (IL-4:42 %, p = 0.025; IFN-y: 64 %, p = 0.053), From these data it can be suggested that the inhibition of proliferation is not as effective using the combined pyrethroids and PBO. Whereas the IL-4/IFN-y-balance is interfered: the response is increased in the non-atopic subjects, whereas susceptibility is increased in the atopies. In 3 of 6 exposed atopic patients a dose-response relation was observed measuring the skin wheels and flares 20 min after skin challenge with permethrin and S-bioallethrin. All other skin-tests in the non-exposed and non-atopic groups were negative. Pyrethroids also induced histamine release. But this was on a low response level (double of the spontaneous values) and only significant in the atopic basophil incubates (p<0.01).
As RT-PCR is a sensitive technique that makes it possible to determine IL-4-mRNA as well as IFN-y-mRNA-expression first assessments were successful using the 3 days PHA-stimulated PBMNC cultures. PH A is a polyclonal T-cell mitogen and the RNA was extracted by direct isolation kit (QUIAGEN, Germany). The enriched mRNA was converted into cDNA by the oli-godT method and amplified using the Taqman technique (PerkinElmer, USA).
IL-4-specific primers: Sense MCACMCTGAGMGGAAACCTCCTGC Anti-sense CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTC IFN-g-specific primers:
Sense ATGAAATATACAAGTTATATCTIGGCTTT Anti-sense GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT
RNA and DNA were visalized using the method of distinct colouring. (McMASTER/CARMICHAEL 1977)
First results indicated that the atopic samples have increased dysregulation of IL-expression compared with
non-atopics. In accordance with the phenotypic production pyrethroids influenced the expression of both IL-4 and IFN-y. Therefore it can be concluded that the pyrethroids are environmental chemicals which act on distinct cellular levels. One of these can be the interactions on the transcription at the cytokine genes in immune-competent cells like blood lymphocytes.
Summary
There is evidence that Th 1 and Th2 cells play an important role in pathophysiologic conditions. Mainly the Thl derived cytokine IFN-y and the Th2 derived IL-4 are indicators for genotypic and phenotypic development of allergic diseases like atopic asthma. After antigen recognition by naive Th cells at the APC surface IL-4 promotes T-cell differentiation to Th2 cells which themselve produce IL-4 for the B-cell activation and switch to the IgE antibody production. The upregula-tion of this process is supported by IL-4 and other factors from mediator cells like mast cells and basophils. However APC also induce antagonistic action of NK cells and CD8* via IL-12. Whereas IL-10 inhibits Thl development. Using the RT PCR-technique it can be shown that the expression and production of cytokine-mRNA and cytokine receptor mRNA are crucial for the regulation of the allergic reaction. Lipophilic environmental chemicals like the immunosuppressive pyrethroids may act at the transcription level of lymphocytes, even influencing allergy inducing cytokine clusters on the human chromosome 5. First assessments clearly demonstrate the shift ofIL-4/ IFN-y-balance after chemical challenge of PHA-stimulated blood lymphocyte T-cell cultures. This effect is aggravated in atopic patients using combined agents like pyrethroids and the synergist piperonyl-butoxide (PBO).
Literature
1. Basketter DA, Bremmer JN, Buckley P, Kammuller ME, Kawabata T, Kimber I, Loveless E, Magda S, Stringer DA, Vohr H-W Pathology considerations for, and subsequent risk assessment of, chemicals identified as immunosuppressive in routine toxicology // Fd Chem Tox - 1995 - vol.33, p.239-243.
2. Beckmann MP, Cosman D, Fanslow W, Maüszewski CR, Lyman SD The interleukin-4 receptor: structure, function and signal transduction // Chem Immun - 1992 - vol.51, p. 107-112.
3. Diel F, Detscher M, Schock B, Ennis M In vitro effects of the pyrethroid S-bioallethrin on lymphocytes and basophils from atopic and non-atopic subjects // Allergy - 1998 - vol.53, p.1052-1059.
4. Diel F, Detscher M, Borck H, Schrimpf D, Diel E, Hoppe HW Effects of permethrin on human basophils and lymphocytes in vitro // Inflamm Res - 1998 -Suppl.47, p.11-12.
5. Diel F, Horr B, Detscher M, Sosnovikova L, Borck H Pyrethroids and the synergist piperonyl-butoxide (PBO) affect T-cells and basophils // Inflamm Res -1999 - Suppl.48, p.15-16.
6. Diel F, Horr B, Borck H, Savtchenko H, Mitsche T, Diel E Pyrethroids and piperonyl-butoxide (PBO) affect human T-lymphocytes in vitro // Tox Letters -1999 -vol. 107, p.65-74.
7. Dy M, Vasquez A, Bertoglio J, ThezeJ General aspects of cytokine properties and functions. In THEZE J (Ed.) The cytokine network and immune functions. Oxford University Press (NY 1999) p.1-13.
8. Maggi E, Brugnolo F, Sampognaro S, Parronchi P Allergic responses and cytokines. In THEZEJ (Ed.) The cytokine network and immune functions. Oxford University Press (NY 1999) p.302-313.
9. McMaster GK, Carmichael GC Analysis of single-and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange / / ProcNatl Acad Sci USA - 1977 - vol.74, p.4835-4838.
10. Moya-Quiles MR, Munoz-Delgado E, Vidal CJ The pyrethroid insecticide deltamethrin modifies the thermotropic properties and lipid packing order of model membranes // Chem Phys Lipids - 1996 - vol.83, p.61-69.
11. Paromov VM, Bughlava S, Malakhova NV, Kiselevsky, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP Ricin at subpicomole concentrations induce cytolytic activity and stimulate lymphokine secrection by human peripheral blood mononuclear cells // Rus J Immunology - 1999 - vol.4, p.20-24.
12. Renz H Soluble interleukin-4 receptor (sIL-4R) in allergic disease // Inflamm Res - 1999 - vol.48, p.425-431.
13. Romagnani S The Thl/Th2 paradigm in disease. Springer (NY 1996) 241 p.
14. Sterner O Chemistry, Health and Environment. Wiley-VCH (Weinheim 1999) 267p.
15. Van Neerven RJJ, Ebner C, Yssel H, Kapsenberg ML, Lamb JR T-cell responses to allergens: epitope-
specificity and clinical relevance // Immunol Today -1996-vol.19, p.526-532.
Abbreviations
AP-l - Activator protein I APC - Antigen presenting cell B7 - Cell surface receptor 7 CD - Cluster determination CMaf - Macrophage activation factor HLT - Histamine liberation test HMG - High mobility group protein IFN - Interferon
IGIF - Interferon gamma inducing factor = IL-18 IL - Interleukin LC- Langerhans’cells Ma - Macrophages MC - Mast cells
MHC - Main histocompatibility complex Mr - Molecular weight NF - Nuclear factors
NF-AT - Nuclear factor of activated T-cells NfkappaB - Nfkappa enhancer binding protein NK - Natural killer Oct - Octamer
PBMNC - Peripheral blood mononuclear cells
PBO - Piperonyl-butoxide
PCR - Polymerase chain reaction
PHA - Phytohaemagglutinin
RT-PCR - Retrotranscriptive-PCR
SIL-4R - Soluble IL-4 receptor
ST AT - signal transducers and activators
of transcription
Acknowledgements
The author wishes to thank Stiftung VERUM (München) as well as Bayer AG (Leverkusen) for financial support and Hanne Borck, Bianca Horr and Regina O’Sullivan for skilful assistance.
поступила в редакцию 15.11.2000 принята к печати 20.01.2001
