Цитокины и матриксные металлопротеиназы при некротическом энтероколите у недоношенных детей

Смирнов Иван Евгеньевич; Шишкина Татьяна Николаевна; Кучеренко Алла Георгиевна; Кучеров Юрий Иванович

8. Kaganov B.S., Zaynudinov Z.M., Strokova T.V., Gotye S.V., Zirul-nikova O.M. Diagnostic criteria and clinical course of liver cirrhosis in children. Infektsionnye bolezni. 2008; 6(3): 14—21.

9. Dvoryakovskaya G.M., Ivleva S.A., Dvoryakovskiy I.V., Polyakova S.I. Advanced technology ultrasound of the liver parenchyma in children with tyrosinemia 1 type. Rossiyskiy zhurnal gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2015, 25(6), 25—30. (in Russian)

10. Dvoryakovskaya G.V., Zhurkova N.V., Silnova I.V., Dvoryakovskiy I.V., Ivanov A.P. Ultrasound diagnostics in assessing the status of internal organs in children with mucopolysacharidosis. Ultrazvukovaya i funktionalnaya diagnostika. 2010; 3: 34—42. (in Russian)

11. Dvoryakovskaya G.M., Gundobina O.S., Dvoryakovskiy I.V., Egoro-va M.V., Basistova A.A. Evaluation of the effectiveness of treatment of Gaucher disease in children according to ultrasound diagnostics. Ultrazvukovaya i funktionalnaya diagnostika. 2006; 3: 33—41. (in Russian)

12. Dvoryakovskaya G.M., Ivleva S.A., Dvoryakovsky I.V., Potapov A.S., Chetkina T.S., Smirnov I.E. Ultrasonic methods of quantitative assessment of the structure of the liver parenchyma in healthy children. Ros. pediatr. zhurn. 2013; 1: 31—7. (in Russian)

13. Dvoryakovskiy I.V., Ivleva S.A., Dvoryakovskaya G.M., Surkov A.N., Potapov A.S., Smirnov I.E. Modern technologies of ultrasound diagnostics of cirrhosis in chronic liver diseases in children. Ros. pediatr zhurn. 2016; 19(4): 202—8. (in Russian)

14. Volynets G.V., Evlyuchina N.N., Filin A.V., Potapov A.S., Dvoryakovskiy I.V., Dvoryakovskaya G.M. et al. Structure and function of the liver and their disorders in chronic diseases of the hepatobiliary system in children. Vestnik RAMN. 2015; 70(2): 203—13. (in Russian)

15. Child C., Turcotte J.G. The liver and portal hypertension. Philadelphia: WE Saunders; 1964.

16. Kasapkara Q.S., Cinasal Demir G., Hasanoglu A., Tümer L. Continuous glucose monitoring in children with glycogen storage disease type I. Eur. J. Clin. Nutr. 2014; 68(1): 101—5.

17. Surkov A.N., Potapov A.S., Lozovator A.L., Tumanova E.L. Peculiarities of morphological changes of the liver in children with glycogen storage disease. Voprosy sovremennoy pediatrii. 2013; 12(6): 24—8. (in Russian)

ORIGINAL ARTICLE

18. Surkov A.N., Potapov A.S., Tumanova E.L. The results of morphological examination of the liver in children with glycogen storage. Gastro-enterologiya Sankt-Peterburga. 2009; 2—3, 76—7. (in Russian)

19. Bijarnia S, Puri RD, Ruel J, Gray GF, Jenkinson L, Verma 1С. Tyrosinemia type I-diagnostic issues and prenatal diagnosis. Indian J. Pediatr. 2006; 73(2): 163—5.

20. Dvoryakovskiy I.V. (Ed.) Ultrasonic anatomy of a healthy child: a Practical guide. [Ultrazvukovaya anatomiya zdorovogo rebenka]. M.: Strom; 2009. (in Russian)

21. Sturm E., Piersma F.E., Tanner M.S., Socha P., Roberts E.A., Sh-neider B.L. Controversies and Variation in Diagnosing and Treating Children With Wilson Disease: Results of an International Survey. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2016; 63(1): 82—7.

22. Pietrangelo A. Hereditary hemochromatosis: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. Gastroenterology. 2010; 139: 393—408.

23. Ponomarev V.V. Wilson's disease - Konovalov: «The Great chameleon». Mezhdunarodniy nevrologicheskiyzhurnal. 2010; 3: 117—22. (in Russian)

24. Sherlock W., J. Dooley. Diseases of the liver and biliary tract. [Boleznypecheni izhelchnychputey]. M.: GEOTAR Medicine;1999. (in Russian)

Поступила 07.09.2016 Принята к печати 19.10.2016

Сведения об авторах:

Ивлева Светлана Анатольевна, врач отдела ультразвуковой диагностики ФГАУ НЦЗД МЗ РФ, e-mail: IvlevaSv@gmail.com;

Дворяковская Галина Михайловна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. отдела ультразвуковой диагностики ФГАУ НЦЗД МЗ РФ, e-mail: dvoryakovskaya@nczd.ru;

Потапов Александр Сергеевич, доктор мед. наук, проф., зав. гастроэнтерологическим отделением с гепатологической группой ФГАУ НЦЗД МЗ РФ, e-mail: e-mail:apotap@mail.ru;

Волынец Галина Васильевна, доктор мед. наук, гл. науч. сотр. ФГАУ «Научный центр здоровья детей» МЗ РФ, e-mail: apotap@ mail.ru;

Смирнов Иван Евгеньевич, доктор мед. наук, проф., гл. науч. сотр. ФГАУ НЦЗД МЗ РФ, e-mail: smirnov@nczd.ru

УДК 616.348-002.4-053.32-092:612.015]-078.33

Смирнов И.Е., Шишкина Т.Н., Кучеренко А.Г., Кучеров Ю.И.

ЦИТОКИНЫ И МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ ПРИ НЕКРОТИЧЕСКОМ ЭНТЕРОКОЛИТЕ У НЕДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ

ФГАУ «Научный центр здоровья детей» Минздрава России, 119991, г Москва, Ломоносовский просп., д. 2, стр. 1

Некротический энтероколит (НЭК) является главной причиной заболеваемости и высокой смертности недоношенных детей. Иммуноферментным методом определяли концентрации цитокинов — трансформирующего фактора роста бета (TGFв), макрофагального воспалительного протеина (М1Р-1в), матриксныхметаллопротеиназ (ММР-2, -3, -8, -9) и тканевого ингибитора матриксной металлопротеиназы-1 (ПМР-1) у маловесных недоношенных детей с НЭК. Обследованы 68 детей с консервативной и хирургической стадиями НЭК. У всех пациентов при поступлении, на 3-и и 7-е сутки лечения определяли концентрации указанных соединений в сыворотке крови и в тканях поврежденных отделов подвздошной и толстой кишки. Установлены разнонаправленные изменения содержания TGFв (уменьшение в 1,9—3 раза) и М1Р-1@ (увеличение в 1,3—1,5 раза) в сыворотке крови по сравнению с контролем. Более выраженные изменения концентраций этих биомаркеров в крови больных с хирургической стадией НЭК, обусловленные уменьшением содержания TGFfi, существенным увеличением концентраций М1Р-1@, ММР-8, Т1МР-1 и отсутствием снижения их содержания в процессе лечения, ассоциируются с тяжелым течением НЭК у маловесных недоношенных детей и являются показателями неблагоприятного течения НЭК, что требует своевременного пересмотра тактики и оптимизации лечения таких больных.

Ключевые слова: некротический энтероколит; диагностика; маловесные недоношенные дети; цитоки-ны; трансформирующий фактор роста бета; макрофагальный воспалительный протеин; матриксные метал-лопротеиназы; тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы-1.

Для цитирования: Смирнов И.Е., Шишкина Т.Н., Кучеренко А.Г., Кучеров Ю.И. Цитокины и матриксные металло-протеиназы при некротическом энтероколите у недоношенных детей. Российский педиатрический журнал. 2016; 19(6): 343-350. Б01: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2016-19(6)-343-350

Для корреспонденции: Смирнов Иван Евгеньевич, доктор мед. наук, проф., гл. науч. сотр. ФГАУ НЦЗД Минздрава России, e-mail: smirnov@ nczd.ru

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

SmirnovI.E., Shishkina T.N., Kucherenko A.G., Kucherov Yu.I.

CYTOKINES AND MATRIX METALLOPROTEINASES IN PREMATURE INFANTS WITH NECROTIZING ENTEROCOLITIS

Scientific Centre of Children Health, 2, bld. 2, Lomonosov avenue, Moscow, 119991, Russian Federation

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a major cause of the morbidity and high mortality in preterm infants. With the ELISA method there were determined cytokine concentrations of the transforming growth factor-fi (TGF-fi), macrophage inflammatory proteinic (MIP-1fi), matrix metalloproteinases (MMP-2, -3, -8, -9) and tissue inhibitor of matrix metallo-proteinase-1 (TIMP-1) in low birthweight (LBW) premature infants with NEC. There were examined 68 infants at the conservative and surgical stages of NEC. In all patients on admission at 3rd and 7th day of the treatment the concentration of these compounds was determined in blood serum and tissues from damaged ileum and colon. There were established divergent differences in TGF-fi content (reduction by 1,9—3 times) andMIP-1fi (1.3—1.5 fold increase) in serum as compared with the control. More pronounced changes in the blood concentrations of these biomarkers in patients at the surgical stage of the NEC due to a decrease in TGF-fi content, a significant increase in MIP-1fi concentrations, MMP-8, TIMP-1 and the lack of the decrease in their content in the course of treatment, are associated with the severe course of NEC in LBW premature infants and prove to be indices of the unfavorable course of NEC, which requires to revise and optimize the therapeutic approach timely in such patients.

Keywords: necrotizing enterocolitis, diagnostics, low birthweight preterm infants, cytokines, transforming growth factor-fi, macrophage inflammatory protein, matrix metalloproteinases, tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, blood content

For citation: Smirnov I.E., Shishkina T.N., Kucherenko A.G., Kucherov Yu.I. Cytokines and matrix metalloproteinases in premature infants with necrotizing enterocolitis. Rossiiskiy Pediatricheskiy Zhurnal (Russian Pediatric Journal). 2016; 19(6): 343-350. (In Russian). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1560-9561-2016-19(6)-343-350

For correspondence: Ivan E. Smirnov, MD, PhD, DSci., professor, chief researcher of the Laboratory of Neurobiology of the Scientific Center of Children's Health, 2, building 2, Lomonosov avenue, Moscow, 119991, Russian Federation. E-mail: smirnov@nczd.ru

Information about authors:

Smirnov I.E., https://orcid.org/0000-0002-4679-0533

х-у /"*екротический энтероколит (НЭК) является я—ш тяжелой формой острой хирургической паЛ- тологии со сложным многофакторным патогенезом, формирующейся преимущественно у маловесных недоношенных детей. Как нозологическая форма НЭК определяется с 1964 г. (код по МКБ-Р 77) [1—6]. Хотя этиология НЭК все еще недостаточно изучена, возникновение и острое течение этой патологии связывают с гипоксически-ишемическим повреждением различных отделов кишечника, которое в постнатальном периоде персистирует с развитием локального ишемически-реперфузионного процесса, образованием язв и некрозом кишечной стенки [7—10]. Лишь в последние годы показано, что ведущую роль в патогенезе НЭК у маловесных недоношенных детей играют медиаторы воспаления [11— 15]. При этом развитие НЭК ассоциируется с изменениями эндогенной продукции ряда острофазовых белков, провоспалительных цитокинов и хемокинов. К их числу относят интерлейкин-6 и интерлейкин-8, фактор некроза опухоли альфа (ТОТа), макрофагаль-ный воспалительный протеин-1в (М1Р-1в), фактор роста семейства TGFв (трансформирующий фактор роста в) и др. [16—19].

Макрофагальный воспалительный протеин-1 (М1Р-1Р) относится к группе цистеин-цистеин (С-С) хемокинов, также называемых в-хемокинами. Как и большинство хемокинов этого класса, М1Р-1в обладает перекрывающимся действием, стимулирует привлечение лейкоцитов в очаг воспаления и контролирует нормальную миграцию клеток через различные ткани [20—23].

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Received 29.09.2016 Accepted 19.10.2016

TGFp также является полифункциональным ци-токином, разнонаправленно действующим практически на все типы клеток и играющим ключевую роль в процессах клеточной дифференцировки, эмбрио- и канцерогенеза [24—28]. Семейство TGFp включает большую группу гомологичных гетеродимерных белков TGFpi, -Р2, -Р3, -Р4. Основной изоформой TGFp, секретируемой клетками иммунной системы, является TGFpi [29]. Этот цитокин синтезируется как предшественник и секретируется в латентной форме. Активный TGFp опосредует свои биологические функции путем связывания с рецепторами, которые представляют собой серин-треониновые протеин-киназы, активирующие различные сигнальные пути клетки, такие как SMAD2, регулирующий несколько клеточных процессов [30]. Оказалось, что TGFp блокирует активацию лимфоцитов и макрофагов. TGFp через белок Foxp3 влияет на регуляторные Т-клетки и T-хелперы-П. Показано, что изоформа TGFP2 су-прессирует продукцию макрофагальных провоспа-лительных цитокинов, защищая слизистую оболочку кишечника от воспаления [25, 30, 31].

Вместе с тем патогенетически значимым фактором, определяющим активность воспаления и выраженность повреждений кишки у недоношенных детей, является нарушение баланса между синтезом и разрушением белков внеклеточного матрикса (ВКМ) [32—36]. Этот динамичный процесс контролируют ферменты — матриксные металлопротеиназы (MMPs), активность которых подавляется их тканевыми ингибиторами (TIMP). MMPs принадлежат к многочисленному семейству матриксинов — Zn2+- и

Са2+-содержащих эндопептидаз, секретируемых различными типами клеток, разрушающих все протеиновые и протеогликановые компоненты ВКМ, включающие фибриллярный и нефибриллярный коллаген, эластин, желатин, ламинин, фибронектин, глико-протеины базальной мембраны и др. [37]. Известно более 20 MMPs, разделяемых в зависимости от их субстратной специфичности на интерстициальные коллагеназы, стромелизины, желатиназы, эластазы и металлопротеиназы мембранного типа (MT-MMP) [37—39].

Критическим событием для генерализации процессов повреждения кишечной стенки при НЭК является проникновение MMPs через базальную мембрану [40—43]. Хотя деструкцию этих биомембран осуществляет целый ряд протеолитичсских ферментов, желатиназы играют ключевую роль в этом процессе: они специфически гидролизуют коллаген IV типа — основной компонент базальных мембран.

MMP-2 (желатиназа А, КФ 3.4.24.24) и MMP-9 (желатиназа B, КФ 3.4.24.35), а также MMP-3 (стро-мелизин, КФ 3.4.24.17) относятся к семейству ма-триксных металлопротеиназ, функции которых связаны с обменом соединительнотканного матрикса в норме и при патологии. Большинство MMPs, включая MMP-8 и MMP-9, относятся к индуцируемым секретируемым ферментам, в то время как MMP-2 конститутивно экспрессируется многими клетками. Обнаружено, что уровень и активность MMPs регулируется на транскрипционном и посттрансляционном уровнях [42—46].

MMP-8 (нейтрофильная коллагеназа, коллагеназа 2 (КФ 3.4.24.34) содержится в виде неактивного профермента в специфических гранулах полиморфноя-дерных лейкоцитов, которые определяют активность фагоцитоза и обладают высокой способностью к инфильтрации соединительной ткани. MMP-8 расщепляет коллагены I—III, V, VII, VIII и X типов, а также фибронектин, хрящевой аггрекан и серпины [47].

Регуляция активности MMPs в физиологических условиях осуществляется с помощью эндогенных активаторов и ингибиторов. Основными эндогенными ингибиторами MMPs являются четыре типа тканевых ингибиторов — TIMPs, которые обладают определенной избирательной специфичностью — TIMP-1—4 [41—43].

Вместе с тем отмечено, что один биомаркер в сыворотке крови не является показателем активности воспаления или повреждения кишечной стенки при НЭК, и предлагается одновременно исследовать несколько функционально различных биологически активных цитокинов или хемокинов. К ним относятся прежде всего TGFß 1, MIP-1 ß, а также MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 и TIMP-1 [48—51]. При формировании НЭК особое значение имеют взаимодействия различных типов MMPs (желатиназ, стромелизинов, коллагеназ) в области поврежденной стенки кишки, активность которых определяет скорость деградации ВКМ ее соединительнотканного каркаса. Как жела-тиназы MMP-2 и MMP-9 участвуют в реконструкции ВКМ в тканях, гидролизуют его основные структурные белки, участвуют в деградации коллагена IV, V,

ORIGINAL ARTicLE

VII, X типов как основных компонентов базальной мембраны, разрушение которой способствует развитию перфораций кишечной стенки [42—44].

Учитывая многообразие эффектов компонентов системы MMPs и TIMP в тканях, их изучение в качестве факторов прогноза и течения НЭК у детей представляется актуальным. Нужно отметить также, что все еще недостаточно изучены изменения содержания цитокинов и MMPs в тканях различных отделов кишечника при формировании НЭК у новорожденных, и пока не ясно их патогенетическое значение [52—54]. Поэтому изучение динамики продукции этих соединений на разных стадиях НЭК у недоношенных детей представляется важным для диагностики и прогнозирования течения этих форм патологии.

Вместе с тем следует учитывать, что пациенты с хирургической стадией НЭК — это недоношенные дети с текущим перитонитом и стойким парезом кишечника, поэтому количественный анализ содержания цитокинов и MMPs в сыворотке крови таких больных представляется доступным и необходимым для диагностики и оценки течения НЭК. В связи с изложенным нами были определены изменения содержания указанных цитокинов и MMPs в сыворотке крови и гомогенате тканей стенки кишки недоношенных детей с различными стадиями НЭК.

Материалы и методы

Обследованы 68 недоношенных детей с массой тела от 500 до 2500 г (1150 ± 245 г) и сроками ге-стации менее 32 нед (29 ± 1,1 нед), находившихся в отделении хирургии и реанимации новорожденных и имевших различные клинические проявления НЭК. Для определения стадий течения НЭК использована классификация J.M. Bell и соавт. (1978 г.) в модификации M.C. Walsh и R.M. Kliegman [55, 56]. Учитывая хирургический профиль отделения, пациенты поступали начиная с IB стадии с уже подтвержденным диагнозом НЭК. Дети с IA стадией НЭК наблюдались в отделении патологии новорожденных и в исследование не включены. В соответствии с указанной классификацией больные были распределены на две группы в зависимости от стадии заболевания и методов лечения. Дети с IB, IIA, IIB стадиями НЭК составили консервативную группу (n = 40), пациенты с IIIA, IIIB стадиями были объединены в хирургическую группу (n = 28). Среди пациентов, составивших консервативную группу, на стадии IB обследованы 7 детей, на стадии IIA — 11 детей, на стадии IIB — 22 ребенка. У пациентов хирургической группы стадия IIIA была определена у 9 детей, а стадия IIIB — у 19 детей. Референтную группу составили 15 недоношенных детей без хирургической патологии, имевших аналогичные сроки гестации и массу тела при рождении.

В образцах сыворотки крови, полученных в день поступления пациентов в стационар, а также на 3-и и 7-е сутки лечения, определяли концентрации TGFß, MIP-1ß, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 и TIMP-1 иммуноферментным методом с помощью наборов

оригинальная статья

Bender MedSystems (Австрия) для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) на полуавтоматическом ИФА-анализаторе АИФР-01 УНИПЛАН («Пикон», Россия).

У всех детей с хирургической стадией НЭК во время операции проводили полнослойную биопсию стенки кишки в месте перфорации (преимущественно в терминальном отделе подвздошной кишки и в области селезеночного угла ободочной кишки) и в пределах здоровых тканей вдали от очага поражения. Затем ткани гомогенизировали в физиологическом растворе, центрифугировали и в супернатанте определяли содержание указанных выше цитокинов, MMP-3, MMP-8 и TIMP-1ß иммуноферментным методом. Для адекватного сопоставления содержания искомых соединений в тканях кишки в аликвотах супернатанта определяли белок по методу Лоури с последующим пересчетом тканевых концентраций вещества на 1 мг белка, которые выражали в нг/мл/мг белка [57].

Все полученные данные обработаны статистически с использованием пакета Statistica 6.0 StatSoft. Inc. (США). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Содержание TGFß в сыворотке крови больных при поступлении уменьшилось в 3 раза при хирургической стадии и в 1,9 раза при консервативной стадии НЭК по сравнению с его уровнем у детей референтной группы. При дальнейшем наблюдении зависимые от стадии НЭК изменения концентраций TGFß в сыворотке крови больных сохранялись (табл. 1).

У всех детей с хирургической стадией НЭК концентрации TGFß в ткани кишки в области ее перфорации (1,4 ± 0,03 нг/мл/мг белка) оказались в 1,9 раза меньше по сравнению со здоровыми тканями (2,69 ± 0,07 нг/мл/мг белка; p

Изменения концентраций MIP-1ß в сыворотке крови недоношенных детей с НЭК имели противоположную направленность: содержание MIP-1ß в сыворотке крови больных при поступлении было в 1,5 раза выше при хирургической стадии и в 1,3 раза — при консервативной стадии НЭК по сравнению с концентрациями у детей референтной группы. В дальнейшем уровни концентраций MIP-1ß в сыворотке крови больных были повышены в 1,2 раза к 7-м суткам наблюдения и не зависели от стадии НЭК (табл. 2).

При этом у всех детей с хирургической стадией НЭК выявлены аналогичные изменения содержания MIP-1ß в гомогенате стенки кишки: в очаге поражения концентрации MIP-1ß составили 148,6 ± 23,45 нг/мл/мг белка, что более чем в 2 раза превышало его уровень в группе контроля (78,7 ± 18,32 пг/мл/ мг белка; p < 0,05).

Динамика содержания MMPs и TIMP-1 (нг/мл) в сыворотке крови недоношенных детей с НЭК ха-растеризовалась разнонаправленными изменениями, которые были особенно выражены при поступлении у больных с хирургической стадией НЭК

Таблица 1

Динамика содержания трансформирующего фактора роста р в сыворотке крови недоношенных детей с НЭК (нг/мл)

Этапы исследования Стадия НЭК Референсная группа

консервативная хирургическая

При поступлении 2,34 ± 0,75* (n = 40) 1,43 ± 0,17* (n = 28) 4,60 ± 0,31 (n = 15)

3-и сутки 2,15 ± 0,27* (n = 40) 1,52 ± 0,23* (n = 21) 4,60 ± 0,31 (n = 15)

7-е сутки 2,6 ± 0,22* (n = 40) 1,91 ± 0,25* (n = 16) 4,6 ± 0,31 (n = 15)

Примечание. * — здесь в других таблицах — статистически значимые различия по сравнению с референтной группой (р < 0,05).

(табл. 3). При этом содержание желатиназ (ММР-2 и ММР-9) в сыворотке крови было существенно ниже по сравнению с их уровнем у детей референтной группы, уровни стромелизина-1 (ММР-3) практически не отличались, а концентрации коллагеназы-1 (ММР-8) и Т1МР-1 значительно увеличивались по сравнению с контролем (р < 0,05). Содержание Т1МР-1 в сыворотке крови больных зависело от стадии НЭК и было повышено более чем в 1,2 раза у больных с хирургической стадией НЭК, в то же время концентрации ММР-8 в крови не зависели от стадии НЭК и были увеличены в 2,5 раза по сравнению с уровнем у детей референтной группы (р < 0,05). Следует отметить, что в течение 7 сут наблюдения установленные закономерности сохранялись, хотя амплитуда изменений незначительно уменьшалась.

У всех больных с хирургической стадией НЭК содержание желатиназы А (ММР-2) в гомогенате стенки кишки в очаге поражения составило 27,9 ± 1,37 нг/мл/мг белка и существенно не отличалось от контроля (26,9 ± 2,92 нг/мл/ мг белка), а концентрации желатиназы В (ММР-9) увеличивались более чем в 6,5 раза (64,8 ± 0,78 нг/мл/мг белка) по сравнению с контролем (10,5 ± 3,4 нг/мл/мг белка; р< 0,05).

Таблица 2

Динамика содержания макрофагального воспалительного протеина-1р в сыворотке крови недоношенных детей с НЭК (нг/мл)

Этапы исследования Стадия НЭК Референтная группа

консервативная хирургическая

При поступлении 149,80 ± 9,25* (n = 40) 179,50 ± 23,42* (n = 28) 120,60 ± 16,71 (n = 15)

3-и сутки 155,60 ± 12,27* (n = 40) 152,40 ± 18,63* (n = 21) 120,60 ±16,71 (n = 15)

7-е сутки 143,20 ± 12,34* (n = 40) 138,30 ± 14,85* (n = 16) 120,60 ± 16,71 (n = 15)

Таблица 3

Динамика содержания матриксных металлопротеиназ и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 в сыворотке крови недоношенных детей с

НЭК (нг/мл)

Изученные соединения Референтная группа (n = 15) Период наблюдений

при поступлении (n = 40) 3-и сутки (П = 21) 7-е сутки (n = 16)

MMP-2: 94,60 ± 5,12

консерв. ст. 71,70 ± 4,83*# 84,60 ± 4,21 91,80 ± 3,54

хирургич. ст. 45,90 ± 2,44*# 57,20 ± 5,34*# 68,70 ± 3,47*#

MMP-3: 5,60 ± 1,14

консерв. ст. 7,20 ± 0,81 6,20 ± 0,35 6,20 ± 0,46

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

хирургич. ст. 7,20 ± 0,64 6,60 ± 0,28 5,70 ± 0,67

MMP-8: 11,80 ± 1,15

консерв. ст. 28,70 ± 2,33* 24,60 ± 2,04* 18,40 ± 2,26*

хирургич. ст. 30,60 ± 2,40* 29,80 ± 2,19* 22,40 ± 2,17*

MMP-9: 277,80 ± 34,13

консерв. ст. 196,70 ± 16,4* 182,30 ± 12,73* 175,70 ± 11,45*

хирургич. ст. 73,20 ± 8,41*# 75,70 ± 9,64*# 80,60 ± 7,72*#

TTMP-1: 307,40 ± 12,86

консерв. ст. 386,60 ± 14,52* 362,40 ± 12,60* 341,20 ± 7,64*

хирургич. ст. 465,8 ± 12,36*# 430,20 ± 13,72*# 424,40 ± 14,87*#

Примечание. * - статистически значимые различия по сравнению с референтной группой (р < 0,05); # — статистически значимые различия при сравнении показателей больных с консервативной и хирургической стадией НЭК (р < 0,05).

Содержание ММР-3 (стромелизин-1) у этих больных увеличивалось в гомогенате стенки кишки в очаге поражения и составило 55,2 ± 2,91 нг/мл/мг белка, что было в 2,3 раза выше по сравнению с контролем (23,7 ± 1,7 2 нг/мл/ мг белка; р < 0,05).

У больных с хирургической стадией НЭК концентрации ММР-8 в ткани кишки в области перфорации увеличивались в 2,6 раза (53,6 ± 0,62 нг/мл/мг белка) по сравнению с контролем (20,4 ± 1,87 нг/мл/ мг белка; р < 0,05). При этом содержание Т1МР-1 увеличивалось в 2,4 раза (3836,6 ± 180,52 нг/мл/мг белка) по сравнению с контролем (1609,7 ± 245,6 нг/мл/мг белка; р < 0,05).

Таким образом, очевидно, что в области перфорации кишечной стенки у больных с хирургической стадией НЭК нарушается баланс желатиназ и существенно повышается содержание стромелизина-1, коллагеназы-1 и Т1МР-1, которые вовлечены в формирование повреждений стенки кишки у маловесных недоношенных детей.

О бсужде ние

Проведенные исследования выявили закономерности изменений содержания цитокинов и MMPs в сыворотке крови и гомогенате тканей кишечной стенки у маловесных недоношенных детей с НЭК, зависимые прежде всего от стадии заболевания.

ORIGINAL ARTicLE

При поступлении у больных с консервативной стадией НЭК содержание указанных соединений в крови было, как правило, менее значительным по сравнению с их уровнем у детей с хирургической стадией. Выявленные закономерности изменений экспрессии изученных нами цитокинов и MMPs свидетельствуют в первую очередь о том, что эти биологически активные соединения непосредственно вовлечены в процессы формирования НЭК как формы острой хирургической патологии и отражают высокую активность воспалительного процесса, более выраженную у недоношенных с хирургической стадией НЭК даже на 7-е сутки после начала активной терапии. Возможно, что такому течению НЭК у маловесных недоношенных детей способствует не только структурно-функциональная незрелость, но и выраженные изменения эндогенной продукции цитоки-нов, нарушающие их тканевый баланс. Установленное нами существенное уменьшение экспрессии TGFpi, обладающего противовоспалительным и им-муносупрессивным действием, может способствовать развитию инфекционных процессов (перитонит и сепсис) у маловесных недоношенных детей и обусловливать быстрое формирование хирургической стадии НЭК. Как было показано ранее, уменьшение экспрессии TGFP у недоношенных детей подавляет его локальный протективный эффект и всегда ассоциируется с тяжелым течением НЭК [25, 26].

При анализе изменений эндогенной продукции MMPs нужно учитывать, что модуляторами их экспрессии при воспалении могут быть эпидермальный и трансформирующий факторы роста (EGF, TGFpi), TNFa, IL-6 и IL-8, интерферон-у и др. соединения, которые изменяют активность универсального ядерного фактора транскрипции (NF-kB), контролирующего экспрессию генов иммунного ответа и клеточного цикла. NF-kB является уникальным среди всех транскрипционных регуляторных белков. Он играет роль внутриклеточного медиатора большого количества внешних воздействий в некоторых типах клеток [58].

Характерной патогенетической особенностью изменений продукции цитокинов и MMPs у маловесных недоношенных детей является сочетание разнонаправленных изменений концентраций биологически активных соединений — значимого уменьшения концентрации TGFpi и существенного увеличения продукции MIP-ip и MMP-8 в сыворотке крови, особен-

оригинальная статья

но выраженного у больных с хирургической стадией НЭК, которое указывает на их дисбаланс, определяет тяжесть течения НЭК у этой группы детей и вполне согласуется с современной концепцией патогенеза НЭК [59]. Следует особенно отметить, что различные ци-токины стимулируют высвобождение из нейтрофилов MMP-8 как ключевого фермента, начинающего разрушение ВКМ кишки путем коллагенолиза, который является первым молекулярным этапом повреждения внеклеточного матрикса, что особенно значимо при воспалительных процессах, сопровождающих ише-мические повреждения [60]. При этом выявлено, что MMP-8 секретируется нейтрофилами только в процессе деструкции поврежденных тканей, способствует повышению бактериального клиренса при сепсисе и является критическим медиатором полимикробного перитонита [61, 62]. Нужно учитывать также, что лишь в последнее время установлена новая роль MMP-8 в дифференцировке и поляризации макрофагов и показано существенное значение MMP-8 как медиатора повреждений в процессах ишемии-реперфузии кишечной стенки. Выявлено увеличение концентраций MMP-8 в тканях поврежденных отделов кишечника и в сыворотке крови больных, связанное с увеличением инфильтрации кишечника нейтрофилами и макрофагами, повреждением кишечного эпителия и повышением его проницаемости преимущественно за счет потери клаудина-3 — белка плотного контакта при ишемии-реперфузии кишечной стенки. Их патогенетическая значимость подтверждена тем, что эти параметры улучшались при экспериментальном инги-бировании продукции MMP-8 не только при ишемии кишечника, но и при церебральных ишемических повреждениях [47, 63, 64].

Таким образом, существенное увеличение экспрессии изученных нами биологически активных соединений, зависимое от тяжести течения НЭК у маловесных недоношенных детей, позволяет считать их ранними биомаркерами, имеющими диагностическую и прогностическую значимость. Установленные нами выраженные изменения эндогенной продукции этих маркеров в сыворотке крови и в ткани поврежденной кишки у больных с хирургической стадией НЭК ассоциируются с тяжелым течением НЭК и являются значимыми критериями неблагоприятного течения НЭК, что требует своевременного пересмотра и адекватной оптимизации лечения таких больных.

Конфликт интересов. Авторы данной статьи подтвердили отсутствие финансовой поддержки/конфликта интересов, о которых необходимо сообщить.

ЛИТЕРАТУРА

1. Holman R.C., Stoll B.J., Curns A.T., Yorita K.L., Steiner C.A., Schönberger L.B. Necrotising enterocolitis hospitalisations among neonates in the United States. Paediatr. Perinat. Epidemiol. 2006; 20(6): 498—506.

2. Obladen M. Necrotizing enterocolitis — 150 years of fruitless search for the cause. Neonatology. 2009; 96(1): 203—10.

3. Parker L.A. Necrotizing enterocolitis: have we made any progress in reducing the risk? Adv. Neonat. Care. 2013; 13(5): 317—24.

4. Kelleher J., Mallick H., Soltau T.D., Harmon C.M., Dimmitt R.A. Mortality and intestinal failure in surgical necrotizing enterocolitis. J. Pediatr. Surg. 2013; 48(3): 568—72.

5. Hull M.A., Fisher J.G., Gutierrez I.M., Jones B.A., Kang K.H.,

Kenny M. et al. Mortality and management of surgical necrotizing enterocolitis in very low birth weight neonates: a prospective cohort study. J. Am. Coll. Surg. 2014; 218(6): 1148—55.

6. Stey A., Barnert E.S., Tseng C.H., Keeler E., Needleman J., Leng M.et al. Outcomes and costs of surgical treatments of necrotizing enterocolitis. Pediatrics. 2015; 135(5): 1190—7.

7. Mannoia K., Boskovic D.S., Slater L., Plank M.S., Angeles D.M., Gollin G. Necrotizing enterocolitis is associated with neonatal intestinal injury. J. Pediatr. Surg. 2011; 46(1): 81—5.

8. Young C.M., Kingma S.D., Neu J. Ischemia-reperfusion and neonatal intestinal injury. J. Pediatr. 2011; 158(2, Suppl.): 25—8.

9. Hackam D.J., Good M., Sodhi C.P. Mechanisms of gut barrier failure in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors throw the switch. Semin. Pediatr. Surg. 2013; 22(2): 76—82.

10. Yu Y., Klemann C., Feng X., Ginzel M., Vieten G., Lacher M. et al. Increased inflammatory reaction to intestinal ischemia-reperfusion in neonatal versus adult mice. Eur. J. Pediatr. Surg. 2015; 25(1): 46—50.

11. Frost B.L., Caplan M.S. Necrotizing enterocolitis: pathophysiology, platelet-activating factor, and probiotics. Semin. Pediatr. Surg. 2013; 22(2): 88—93.

12. Stewart C.J., Cummings S.P. Gut bacteria and necrotizing enterocolitis: cause or effect? Trends Microbiol. 2015; 23(6): 332—3.

13. Bracho-Blanchet E., Torrecilla-Navarrete M.E., Zalles-Vidal C., Ibarra-Ríos D., Fernández-Portilla E., Dávila-Pérez R. Prognostic factors related to mortality in newborns with necrotising enterocolitis. Cirug. y Ciruj. 2015; 83(4): 286—91.

14. Leach S.T., Lui K., Naing Z., Dowd S.E., Mitchell H.M., Day A.S. Multiple opportunistic pathogens, but not pre-existing inflammation, may be associated with necrotizing enterocolitis. Dig. Dis. Sci. 2015; 60(12): 3728—34.

15. Lim J.C., Golden J.M., Ford H.R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr. Surg. Int. 2015; 31(6): 509—18.

16. Zamora R., Grishin A., Wong C., Boyle P., Wang J., Hackam D. et al. High-mobility group box 1 protein is an inflammatory mediator in necrotizing enterocolitis: protective effect of the macrophage deactivator semapimod. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2005; 289(4): 643—52.

17. Johnson A.R., Qin Y., Cozzo A.J., Freemerman A.J., Huang M.J., Zhao L. et al. Metabolic reprogramming through fatty acid transport protein 1 (FATP1) regulates macrophage inflammatory potential and adipose inflammation. Mol. Metab. 2016; 5(7): 506—26.

18. Hackam D.J., Good M., Sodhi C.P. Mechanisms of gut barrier failure in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Toll-like receptors throw the switch. Semin. Pediatr. Surg. 2013; 22(2): 76—82.

19. Maheshwari A., Schelonka R.L., Dimmitt R.A., Carlo W.A., Munoz-Hernandez B., Das A. et al. Cytokines associated with necrotizing enterocolitis in extremely-low-birth-weight infants. Pediatr. Res. 2014; 76(1): 100—8.

20. Harris M.C., Costarino A.T. Jr, Sullivan J.S., Dulkerian S., McCawley L., Corcoran L. et al. Cytokine elevations in critically ill infants with sepsis and necrotizing enterocolitis. J. Pediatr. 1994; 124(1): 105—11.

21. Edelson M.B., Bagwell C.E., Rozycki H.J. Circulating pro- and counterinflammatory cytokine levels and severity in necrotizing enterocolitis. Pediatrics. 1999; 103(4, Pt 1): 766—71.

22. KapellosT.S., IqbalA.J. Epigenetic control ofmacrophage polarisation and soluble mediator gene expression during inflammation. Mediators Inflamm.2016; 2016: 6591703. doi: 10.1155/2016/6591703.

23. de Torre-Minguela C., Barberá-Cremades M., Gómez A.I., Martín-Sánchez F., Pelegrín P. Macrophage activation and polarization modify P2X7 receptor secretome influencing the inflammatory process. Sci. Rep. 2016; 6: 22586. doi: 10.1038/srep22586

24. Rowland K.J., Choi P.M., Warner B.W. The role of growth factors in intestinal regeneration and repair in necrotizing enterocolitis. Semin. Pediatr. Surg. 2013; 22(2): 101—11.

25. Maheshwari A., Kelly D.R., Nicola T., Ambalavanan N., Jain S.K., Murphy-Ullrich J. et al. TGF-ß2 suppresses macrophage cytokine production and mucosal inflammatory responses in the developing intestine. Gastroenterology. 2011; 140(1): 242—53.

26. Sands B.E. Biomarkers of inflammation in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2015; 149(5): 1275—85.

27. Fadok V.A., Bratton D.L., Konowal A., Freed P.W., Westcott J.Y., Henson P.M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF. J. Clin. Invest. 1998; 101(4): 890—8.

28. Namachivayam K., Coffing H.P., Sankaranarayanan N.V., Jin Y., MohanKumar K., Frost B.L. et al. Transforming growth factor-ß2 is sequestered in preterm human milk by chondroitin sulfate proteo-glycans. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2015; 309(3): 171—80.

ORIGINAL ARTicLE

29. Wahl S.M. Transforming growth factor-beta: innately bipolar. Curr. Opin. Immunol. 2007; 19(1): 55—62.

30. Sheng-Ru Shiou, Yueyue Yu., Yuee Guo, Westerhoff M., Lei Lu, Petrof E.O. et al. Oral administration of transforming growth factor-P1 (TGF-P1) protects the immature gut from injury via smad protein-dependent suppression of epithelial nuclear factor kB (NF-kB) signaling and proinflammatory cytokine production. J. Biol. Chem. 2013; 288(48): 34757—66.

31. Nguyen D.N., Sangild P.T., Ostergaard M.V., Bering S.B., Chatterton D.E. Transforming growth factor-02 and endotoxin interact to regulate homeostasis via interleukin-8 levels in the immature intestine. Am. J. Physiol. Gastrointest. liver Physiol. 2014; 307(7): 689—99.

32. Lodha A., Asztalos E., Moore A.M. Cytokine levels in neonatal ne-crotizing enterocolitis and long-term growth and neurodevelopment. ActaPediatr. 2010; 99(3): 338—43.

33. Benkoe T.M., Mechtler T.P., Weninger M., Pones M., Rebhandl W., Kasper D.C. Serum levels of interleukin-8 and gut-associated bio-markers in diagnosing necrotizing enterocolitis in preterm infants. J. Pediatr. Surg._2014; 49(10): 1446—51.

34. Thuijls G., Derikx J.P., van Wijck K., Zimmermann L.J., Degraeuwe P.L., Mulder T.L. et al. Non-invasive markers for early diagnosis and determination of the severity of necrotizing enterocolitis. Ann. Surg. 2010; 251(6): 1174—80.

35. De Plaen I.G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clin. Perinatal. 2013; 40(1): 109—24.

36. Maheshwari A. Immunologic and hematological abnormalities in ne-crotizing enterocolitis. Clin. Perinatol. 2015; 42(3): 567—85.

37. Jiang W., Bond J.S. Families of metalloendopeptidases and their relationships. FEBS lett. 1992; 312(2—3): 110—4.

38. Hooper N.M. Families of zinc metalloproteases. FEBS lett. 1994; 354(1): 1—6.

39. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of metallopepti-dases. Meth. EnzymoL 1995; 248: 183—228.

40. Medina C., Radomski M.W. Role of matrix metalloproteinases in intestinal inflammation. J^_Pharmacol. Exp. Ther._2006; 318(3): 933—8.

41. Bein A., Lubetzky R., Mandel D., Schwartz B. TIMP-1 inhibition of occludin degradation in Caco-2 intestinal cells: a potential protective role in necrotizing enterocolitis. Pediatr. Res. 2015; 77(5): 649—55.

42. Cockle J.V., Gopichandran N., Walker J.J., Levene M.I., Orsi N.M. Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in preterm perinatal complications. Reprod Sci.2007; 14(7): 629—45.

43. Moore C.S., Crocker S.J. An alternate perspective on the roles of TIMPs and MMPs in pathology. Am. J. Pathol. 2012; 180(1): 12—6.

44. Хворостов И.Н., Дамиров О.Н., Смирнов И.Е., Кучеренко А.Г., Петрашева Е.С., Шрамко В.Н. и др. Кальпротектин и матриксные металлопротеиназы при язвенно-некротическом энтероколите у новорожденных детей. Рос. педиатр. журн. 2013; (6): 37—44.

45. Bister V., Salmela M.T., Heikkila P., Anttila A., Rintala R., Isaka K. et al. Matrilysins-1 and -2 (MMP-7 and -26) and metalloelastase (MMP-12), unlike MMP-19, are up-regulated in necrotizing enterocolitis. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2005; 40(1): 60—6.

46. Pender S.L., Braegger C., Gunther U., Monteleone G., Meuli M., Schuppan D, et al. Matrix metalloproteinases in necrotising enterocolitis. Pediatr. Res. 2003; 54(2): 160—4.

47. Wen G., Zhang C., Chen Q., Luong le A., Mustafa A., Ye S. et al. A novel role of matrix metalloproteinase-8 in macrophage differentiation and polarization. J. Biol. Chem. 2015; 290 (31): 19158—72.

48. Ng P.C., Chan K.Y., Poon T.C. Biomarkers for prediction and diagnosis of necrotizing enterocolitis. Clin. Perinatol. 2013; 40(1): 149—59.

49. Хворостов И.Н., Смирнов И.Е., Дамиров О.Н., Кучеренко А.Г., Шрамко В.Н., Синицын А.Г. и др. Прогнозирование течения и исходов язвенно-некротического энтероколита у новорожденных. Рос. педиатр. журн. 2014; (2): 10—14.

50. Stewart C.J., Nelson A., Treumann A., Skeath T., Cummings S.P., Embleton N.D. et al. Metabolomic and proteomic analysis of serum from preterm infants with necrotising entercolitis and late-onset sepsis. Pediatr. Res. 2016; 79(3): 425—31.

51. Wilcock A., Begley P., Stevens A., Whatmore A., Victor S. The metabolomics of necrotising enterocolitis in preterm babies: an exploratory study. J. Matern. Fetal. Neonatal. Med. 2016; 29(5): 758—62.

52. Neu J. Necrotizing enterocolitis: the mystery goes on. Neonatology. 2014; 106(4): 289—95.

53. Lim J.C., Golden J.M., Ford H.R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatr. Surg. Int. 2015; 31(6): 509—18.

54. Moore J.E. Newer monitoring techniques to determine the risk of necrotizing enterocolitis. Clin. Perinatol. 2013; 40(1): 125—34.

55. Bell M.J., Ternberg J.L., Feigin R.D., Keating J.P., Marshall R., Barton

L. et al. Neonatal necrotizing enterocolitis. Therapeutic decisions based upon clinical staging. Ann. Surg. 1978; 187(1): 1—7.

56. Walsh M.C., Kliegman R.M. Necrotizing enterocolitis: treatment based on staging criteria. Pediatr. Clin. N. Am. 1986; 33(1): 179—201.

57. Stoscheck C.M. Quantitation of protein. Methods Enzymol._ 1990; 182: 50—68.

58. Kawai T., Akira S. Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol. Med. 2007; 13(11): 460—9.

59. Tanner S.M., Berryhill T.F., Ellenburg J.L., Jilling T., Cleveland D.S., Lorenz R.G. et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. Am. J. Pathol. 2015; 185(1): 4—16.

60. Fields G.B. Interstitial collagen catabolism. J. Biol. Chem. 2013; 288(13): 8785—93.

61. Atkinson S.J., Varisco B.M., Sandquist M., Daly M.N., Klingbeil L., Kuethe J.W. et al. Matrix metalloproteinase-8 augments bacterial clearance in a juvenile sepsis model. Mol Med. 2016;22. doi: 10.2119/ molmed.2016.00058.

62. Atkinson S.J., Nolan M., Klingbeil L., Harmon K., Lahni P., Zingarelli B. et al. Intestine-derived matrix metalloproteinase-8 is a critical mediator of polymicrobial peritonitis. Crit. Care Med. 2016; 44(4): 200—6.

63. Daly M.C., Atkinson S.J., Varisco B.M., Klingbeil L., Hake P., Lahni P. et al. Role of matrix metalloproteinase-8 as a mediator of injury in intestinal ischemia and reperfusion. FASEB J. 2016; 30(10): 3453—60.

64. Han J.E., Lee E.J., Moon E., Ryu J.H., choi J.W., Kim H.S. Matrix metalloproteinase-8 is a novel pathogenetic factor in focal cerebral ischemia. Mol. Neurobiol. 2016; 53(1): 231—9.

REFERENCES

1. Holman R.C., Stoll B.J., Curns A.T., Yorita K.L., Steiner C.A., Schonberger L.B. Necrotising enterocolitis hospitalisations among neonates in the United States. Paediatr. Perinat. Epidemiol. 2006; 20(6): 498—506.

2. Obladen M. Necrotizing enterocolitis — 150 years of fruitless search for the cause. Neonatology. 2009; 96(1): 203—10.

3. Parker L.A. Necrotizing enterocolitis: have we made any progress in reducing the risk? Adv. Neonat. Care. 2013; 13(5): 317—24.

4. Kelleher J., Mallick H., Soltau T.D., Harmon C.M., Dimmitt R.A. Mortality and intestinal failure in surgical necrotizing enterocolitis. J. Pediatr. Surg. 2013; 48(3): 568—72.

5. Hull M.A., Fisher J.G., Gutierrez I.M., Jones B.A., Kang K.H., Kenny M. et al. Mortality and management of surgical necrotizing enterocolitis in very low birth weight neonates: a prospective cohort study. J. Am. Coll. Surg. 2014; 218(6): 1148—55.