CC BY
28
УДК 575.16:57.085:591.16:636
Остаповець Л.1., ® кандидат бюлопчних наук, (ostlara@online.ua) 1нститут розведення i генетики тварин, с. Чубинське, Бористльський район, Кигвська обл.
ЦИТОГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ООЦИТ1В СВИНЕЙ ПРИ ОТРИМАНН1 ПАРТЕНОГЕНЕТИЧНИХ ЕМБРЮНШ П1СЛЯ 1НГ1БУВАННЯ РЕДУКЦ1ЙНОГО Д1ЛЕННЯ МЕЙОЗУ IN VITRO
Показано можливкть партеногенетичного розвитку тсля iнгiбування видыення першого полярного тыьця в ооцитах свиней та гх наступног активаци етанолом, принаймi, до 16-клтинног стадп in vitro
Ключовi слова: ооцит, мейоз, in vitro, дозрiвання, партеногенетична активащя, ембрюн, культивування, цитохалазин, свит
Вступ. Досягнення сучасно! бюлоги та генетики розвитку тварин свщчать про те, що без розумшня закономiрностей оогенезу та раншх стадш ембрюнального розвитку ссавщв неможливо широко застосовувати методи репродуктивно! бютехнологи [5, 7].
Партеногенез - здатшсть жшочих статевих кл^ин розвиватися без участi сперматозо1дов. Першi спроби з активаци яйцеклiтин ссавщв до партеногенетичного розвитку зроблеш Г. Пшкусом у 30-х роках ХХ ст., але тiльки починаючи з 80-х роюв дослiдження з одержання партеногенетичних ембрюшв набули бiльш широкого розвитку [2, 9]. Залежно вщ того, на якiй стади мейозу (метаф^ I або метафазi II) вщбуваеться партеногенетична активацiя ооцитiв, фактору активаци та iнших чинникiв, подальший розвиток активованих гамет може призводити до отримання рiзних типiв партеногенетичних ембрюшв. До основних таких титв належать генетично однорщш, неоднорiднi та мозашш гапло!ди, гетерозиготнi дипло!ди, амейотичш гетерозиготнi дипло!ди [6].
В останнш час особливо! актуальностi набули дослщження з активаци яйцеклiтин до партеногенетичного розвитку на раншх стадiях мейозу, наприклад на метафазi I. Це може сприяти отриманню нових рiзновидiв дипло!дного мейотичного партеногенезу i наблизити виршення питання про амейотичний партеногенез у ссавщв. На думку вчених, застосування даного методу дасть можливкть отримувати нащадюв, якi за сво!м походженням i генетичними характеристиками будуть являти собою материнсью клони. А. К. Голубевым та ш. показано, що активащя ооцитiв корiв на стади метафази I мейозу in vitro холодовим шоком призводить до формування 2-4-кл^инних амейотичних партеногенетичних ембрюшв [3]. При активаци ооциив свиней на метафазi I комбшащею етанолу з циклогексамщом отриманi 2-6-клiтиннi амейотичш партеногенетичш ембрiони свиней in vitro [4]. Проте, Д. Кубяк iз ствавторами запропонував iнший спосiб отримання амейотичних
® Остаповець Л.!., 2010
225
партеногеношв ссавщв in vitro [10]. Суть якого полягала у пригшченш першого редукцшного дшення мейозу ооцитiв мишей з використанням цитохалазину D та послiдуючою активащею таких гамет до амейотичного партеногенезу. Застосування цитохалазину D обумовлено його здатшстю шпбувати полiмеризацiю актинових мжрофшаменив, що призводить до пригнiчення видшення першого полярного тiльця пiд час редукцшного дшення мейозу. Тобто шпбуе процес цитокшезу, але в той же час не впливае на карюкшез (рух хромосом в анафазi I мейозу), внаслщок чого вщбуваеться формування тетраплощних ооцитiв, якi тсля активаци, завершення 2-го мейотичного дшення та видшення полярного тшьця мютили диплощний набiр хромосом. Генотип таких партеногенетичних ембрюшв вiдрiзнявся вiд генотипу матерi лише внаслiдок мiнливостi, обумовлено! кросинговером. Таю партеногенетичш ембрiони розвивалися до стади бластоцисти, але трансплантащя реципiентам таких ембрiонiв не призвела до народження нащадюв, 1х розвиток зупинився на 9-10 день [10]. Застосування I. Б. Кузнецовою та ш. такого тдходу дало можливють одержати амейотичнi партеногенетичнi ембрiони корiв на стади ранньо! морули [8].
Виходячи з актуальной даного питання було дослщжено динамiку дозрiвання ооцитав свиней до стади метафази I мейозу in vitro з метою !х послщуючо! активаци до партеногенезу при умовi iнгiбування екструзи першого полярного тшьця.
Матер1ал i методи. Об'ектом експериментальних дослщжень були ооцит-кумулюснi комплеси свиней породи велика бша. Вiдбiр яечник1в свиней проводили на бойш в1д забитих тварин. Вилучення ооцит-кумулюсних комплексiв ооцитiв свиней проводили шляхом розрiзання (надрiзу) скальпелем стшок видимих антральних фолiкулiв. Вадбраш за морфологiчними ознаками ооцити переносили в середовище 199 („Sigma") для дозрiвання з додаванням 20% еструсно! сироватки кровi корiв та клггин гранульози в концентрацil 3-5х10б клггин на 1 мл середовища. З метою пригшчення екструзil першого полярного тшьця ооцити переносили через 12 годин вщ початку культивування у середовище 199, яке мютило 5 мкг/мл цитохалазину D („Sigma"), де !х культивували протягом 5 або 8 годин. Пюля чого вщмивали у середовищi 199 i переносили в культуральне середовище (загальна тривалють культивування ооцит-кумулюсних комплексiв складала 44 години). Ооцит-кумулюснi комплекси культивували при температурi +38,8°С та 4% СО2 в повiтрi.
Партеногенетичну активацiю яйцеклггин свиней проводили 7%-вим розчином етилового спирту протягом 7 хвилин. Пюля активацil гамети культивували в середовищi NCSU-23 при температурi +38,8°С та 4% СО2 в повiтрi.
Для дослщження стану мейотичних хромосом тд час дозрiвання ооцитiв поза оргашзмом готували сухоповiтрянi препарати за модифжованим нами методом A. K. Тарковського [11]. Ооцити свиней переносили на 10 хвилин у краплю 0,26%-го гшотошчного розчину цитрату натрш з подальшою фжсащею сумiшшю метанол-оцтово! кислоти в сшввщношенш 2:1. Фарбування препаратiв проводили 2,0%-вим розчином барвника Гiмзи.
226
Результати дослщження. При отриманш партеногенетичних ембрюшв свиней за умови шпбування першого мейотичного подшу одним i3 eTaniB е вивчення хронологи змш стaдiй мейозу в ооцитах тд час дозрiвaння in vitro.
Проведено цитогенетичний aнaлiз ооциив свиней, якi культивували in vitro протягом 10, 12, 14, 16, 18 годин. Встановлено, що через 10 годин дозрiвaння переважна бшьшють ооцитав була на стади диплотени i тiльки у 23,8 % гамет спостер^али вiдновлeння мейозу i вони перебували на стади дiaкiнeзу та метафази I (таблиця). Шсля 12 годин культивування виявлено достовiрно бiльшу кiлькiсть ооцитiв на мeтaфaзi I, порiвняно з 10 годинами дозрiвaння (40,4 % проти 14,3 %, р<0,05) (рис. 1). Через 14 годин спостер^али достовiрнe збшьшення кiлькостi ооцитiв на стади метафази I, порiвняно iз 10 та 12 годинами дозрiвaння (р<0,05), а також однакову кшьккть гамет (9,5 %) на стади анафази I та телофази I.
Таблиця
Динамжа доз|Мвання in vitro ооцитiв свиней до стадi'l' метафази I
Ооцити на стади
Тривал1сть дозр1вання, годин диплотени, n (%) е) И o^ (й я 'ч метафази I, n (%) анафази I, n (%) телофази I, n (%) метафази II, n (%) Ооцити 1з дегенеращею хромосом , n (%)
10 (n = 21) 16a (76,2) 2 (9,5) 3f (14,3) 0 0 0 0
12 (n = 47) 24b (51,1) 4 (8,5) 19g (40,4) 0 0 0 0
14 (n = 21) 5c (23,8) 1 (4,8) 11g (52,4) 2 (9,5) 2h (9,5) 0 1 (4,8)
16 (n = 40) 7d (17,5) 0 20g (50,0) 4 (10,0) 9 (22,5) 0 1 (2,5)
18 (n = 34) 1de (2,9) 0 15g (44,2) 2 (5,9) 131 (38,2) 3 (8,8) 1 (2,9)
Примггки:
1. a:b, c:e, f:g; h:i - p<0,05; a:c, b:d - p<0,01; a:d, b:e - p<0,001.
2. n - к1льк1сть проанал1зованих гамет.
3. - % ввд загально! кшькосп оощгпв. _
* 1 4
Рис. 1. Стадiя метафази I мейозу ооциту свнш, зб. х 900 раз1в
227
Видшення першого полярного тшьця в ооцитах спостер^али шсля 18 годин дозрiвання (8,8 %). Пщ час проведення цитогенетичного аналiзу ооцитiв виявленi дегенеративнi змiни ядерного матерiалу: злипання хроматину або хромосом та ïx деконденсацiю. Не виявлено ооцитав з ознаками дегенерацiï на 10, 12 годину культивування, хоча на 14, 16, 18 годину спостер^али дегенеративш змши ядерного матерiалу, але не на високому рiвнi.
Таким чином, за результатами дослщжень динамiки дозрiвання in vitro ооциив свиней до стадiï метафази I встановлено, що оптимальним часом додавання цитохалазину D е 12 годин вщ початку дозрiвання. Хоча на цей час культивування була вiдмiчена менша кiлькiсть гамет на стади метафази I, порiвняно з 14, 16 та 18 годинами культивування, але не було виявлено ооциив на бшьш просунутих стадiяx мейозу.
Проведен дослiдження з партеногенетичноï активаци ооциив свиней при умовi шпбування екструзiï першого полярного тiльця in vitro. Встановлено, що тсля експозици ооциив свиней з цитохалазином D протягом 5 годин та наступнох' ïx активацiï на 44 годинi дозрiвання отримано партеногенетичних ембрiонiв на рiвнi 69,1 % (рис. 2). Серед яких 43,1 % партеногенетичних ембрюшв перебували на 2-4-клггиннш та 56,9 % на 6-16-кштиннш cтaдiяx розвитку.
%
Рис. 2. Амейотичш партеногенетнчш ембршни свиней на р1зни\ стад1я\ до1мплантацшного розвитку, зб. \ 80 pa3iB
Висновки. Таким чином, за результатами цитогенетичного аналiзу ооцитiв свиней встановлено, що 12 годин вщ початку дозрiвання ооцитав свиней е оптимальним часом додавання цитохалазину D. Шпбування екструзп першого полярного тшьця в ооцитах пщ час дозрiвання in vitro з використанням цитохалазину D та наступною активащею таких гамет дозволяе отримати амейотичш партеногенетичш ембрiони на рiвнi 69,1 %.
Лiтеpaтуpa
1.Дыбан А. П. Раннее развитие млекопитающих / А. П. Дыбан. - Л. : Наука, 1988. - 228 с.
228
2.Дыбан А. П. Партеногенетическое развитие овулировавших мышиных яйцеклеток под влиянием этилового спирта / А. П. Дыбан, Л. И. Хожай // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. - 1980. - Т. 139. - С. 487-489.
3.Цитогенетический анализ ооцитов коров при их стимуляции к партеногенезу / А. К. Голубев, И. В. Кудрявцев, В. Е. Кузнецов [и др.] // I Всес. конф. по цитогенетике сельхоз. животных : 10-13 ноября 1985 г. : тезисы докл. - М., 1985. - С. 13-14.
4.Щегельская Е. А. Раннее партеногенетическое развитие после активации ооцитов свиньи на метафазе I / Е. А. Щегельская // Теория и практика племенного дела в животноводстве : материалы междунар. науч.-практ. конф. - Х., 1996. - С. 74-75.
5.Эрнст Л. К. Фундаментальные и прикладные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии / Л. К. Эрнст // Вестник РАСХН. - 2006. -№ 1. - C. 9-11.
6. Эрнст Л. К. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных / Л. К. Эрнст, Н. И. Сергеев. - М. : ВО „Агропромиздат", 1989. - 302 с.
7.Кузнецов В. £. Бютехнолопя у твариннищв / В. £. Кузнецов // Генетика i селекщя в Укра1ш на межi тисячолт : у 4 т. / редкол. В. В. Моргун (голов. ред.) [та ш.]. - К. : Логос. - 2001. - Т. 4. - С. 31-57.
8.Кузнецова I. Б. Активащя ооциив корiв до партеногенетичного розвитку етанолом / I. Б. Кузнецова, В. £. Кузнецов, О. О. Лукашенко // Цитология и генетика. - 2000. - Т. 34, № 1. - С. 57-64.
9.Pincus G. The comparative behaviour of mammalian eggs in vivo and in vitro: I. 2. The activation of the tubal eegs of the rabbit / G. Pincus, E. V. Enzmann // Journal Experimental Zoology. - 1936. - Vol. 73, № 2. - P. 195-208.
10. Genetically identical parthenogenetic mouse embryos produced by inhibition of first meiotic cleavage with cytochalasin D / J. Kubiak, A. Paldi, M. Weber [et al.] // Development. - 1991. - Vol. 111, № 3. - P. 763-769.
11. Тarkowski A. K. An air-drying method for chromosome preparation from mouse eggs / A. K. Tarkowski // Cytogenetics. - 1966. - Vol. 5, № 3. - P. 394-400.
Summary Ostapovetz L.I.
Institute of animals breeding and genetics, v. Chubinsky, Boryspil District, Kyiv Region, Ukraine CYTOGENETICAL CHARACTERISTICS OF PORCINE OOCYTES THE PRODUCTION OF PARTHENOGENETIC EMBRYOS AFTER INHIBITION OF THE FIRST MEIOTIC CLEAVAGE IN VITRO
It was shown the possibility of parthenogenetic development in vitro of matured porcine oocytes after inhibition of the first meiotic division and treatment with ethanol at least to 16-cell stage embryos.
Стаття надшшла до редакцИ 19.03.2010
229
