CC BY
24
УДК 619: 616. 99: 576. 895: 619: 615
Соболта А.Г., к. вет. н., старший викладач © Лъв\всъкий нацюналънийутеерситет ветеринарногмедицини та бютехнологш iмет С.З.Гжицъкого
ВПЛИВ ФАСЦЮЛОЦИД1В НА МЕЙОЗ FASCIOLA HEPATICA IN VITRO
Выявлено, що бронтел 10 % та комбтрем in vitro впливаютъ на cmameei хромосомы мейотичного циклу Fasciola hepatica, що проявляетъся у них морфогенетичними змгнами.
Ключое1 слова: фасщолъоз, меиоз, антигелъмттики, резистентшстъ, гаметогенез, морфогенетичт змши, клтини.
Втуп. Мейоз - один Í3 найбшьш важливих та складно оргашзованих кл1тинних процеав, яю протжають в живих оргашзмах, в тому числ1 i у фасцюл. Його можна охарактеризувати, як спещальний тип подшу статевих кл1тин, яю диференцшються. В результат! особливостей цього типу подшу забезпечуеться редукщя кшькоси хромосом, необхщна для здшснення статевого процесу.
На нашу думку, було доцшьно визначити, яю цитоструктури бшьш чутлив1 до дп фасцюлоцид1в, яю бшьш стшю до пошкоджуючо! ди, до визначення класу антигельмштиюв, адже з гаметогенезом та ценогенезом фасцюл пов'язана резистентшсть [8] i, це може мати певне значения, так як дозволяе визначити загальну резистентшсть фасцюл до цитотоксично! i мутагенно!, допустимо! i порогово! дози для проявления нею цитопатичного, мутагенного та шших ефекив i розробити заходи проти лшоотрностг
За спостереженнями деяких вчених [1], бшя 30 % гамет в зитонет! -naxiTeHi мають порушення кон'югаци (з'еднання), яка виражаеться в аномал1ях синапнонемного комплексу - структури, специф1чно! для мейотичних хромосом стади вщ зиготени до диплотени i зумовлюючо! кон'югацш гомолопчних батьювських хромосом. За останш роки накопичилися даш про те, що виникаюч! в гаметах аномалп можуть проявлятись морфолопчно i функцюнально не вщразу, а як пролонгований ефект пошкодження при заплщненш на перших етапах розвитку зиготи. Очевидно, що порушення ДНК м1тохондрш, особливо в ооцитах, не може пройти безслщно для гамет i зигот, яю розвиваються. Однак, такого роду дослщження в л1тератур1 не вщображеш. У зв'язку з наростанням виявлення резистентност! паразит1в, зокрема фасцюл до антигельмштиюв, стае актуальною проблема мехашзм1в виникнення i виявлення впливу антигельмштиюв на гамети, особливо на хромосомш абераци.
Матер1али та методика. Для вивчення мутагенно! дй' фасцюлоцидних препарата на репродуктивну систему, статевозрших паразита теля ввдбору з
© Соболта А.Г., 2013
298
жовчних ход1в, вщ забитих на бойш тварин, помщали у термос, в лабораторп промивали в розчиш Хедон-Флейга декшька раз1в та помщали по 20 фасцюл на 0,5 л. розчину у стерильш посудини з розчинами р1зних концентрацш комб1трему та бронтелу 10 % на 24 години. Розчиняли препарата i вносили у розчин Хедон-Флейга у вщповщност! до терапевтичних доз [16] та наближених piBHiB у кров!. Комбпрем розводили у концентрациях 0,1; 0,05; 0,025; 0,012; 0,006; 0,003; 0,0015 мг/см3; бронтел 10 % вщповщно - 1,2; 0,6; 0,3; 0,1; 0,07, 0,03 i 0,017 мг/см3. Нерозчинний у вод! фасцюлоцид - комб1трем розводили етиловим спиртом: до 10-ти мг препарату додавали 0,16 мл етилового спирту [3]. Одна посудина з паразитами без антигельмштиюв служила контролем. Пкля чого, гшотошзацш, фжсацш та виготовлення тимчасових тиснених тотальних препарата проводили згщно загальноприйнятих методик [1, 7, 12,
14, 15].
Препарата оцшювали методом пор1вняння, кожш 6, 12 та 24 години, нормальних та патолопчних кл1тин мейотичного циклу у кожно! фасцюли, змши у яких були викликаш д1ею фасцюлоцид!в. При вивченш мейозу, скористалися методикамиМюнцингаА., 1967, Баранова B.C. 1968, Рамайя Л.К., 1969, Дибана А.П., 1969, Вельша У., 1976, Мамаева H.H. 1980, Гетза П., 1980, Курила Л.Ф., 1980, 1989, Паушевог З.П., 1988. Критер1ем для пор1вняння слугували кл1тини оброблених та необроблених фасцюлоцидами гельм1нт1в у стади профази 1 та метафази 1 мейозу: лептотени, зиготени, пах1тени та диплотени [2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13]. Змши полягали у морфолог1чно змшених статевих кл1тин мейозу що проявлялось ix набуханиям та розходженням хромосом, порушенням нормально! структури кл1тин.
Кл1тини вивчали i фотографували за допомогою св1тлового м1кроскопу "Jenamed - 2" (х400) та цифрово! фотокамери "Sony W5"
Результати досл1джень. 1з проведених нами досл1джень за дй фасцюлоцидних препарат1в, вдалося виявити деяк1 вщмшност1 в морфолог11 статевих кл1тин мейотичного циклу, у пор1внянш i3 кл1тинами необроблених гельм1нт1в згаданими вище препаратами.
Так вже через 6 годин пщ д1ею бронтелу 10 % у доз1 0,3 мг/см3, як це видно з рис. 1 а, б, були виявлеш змши на стад1ях лептотени та зиготени профази 1 мейозу. 3 лептотени (рис. 1, в), починаеться профаза 1 мейозу, коли видно, що кожна хромосома, змшивши свою штерфазну конформацш, переходить у конденсовану форму, утворюючи довге, тонке волокно з б1лковою осьовою ниткою. Кожна хромосома обома к1нцями прикр1плена до ядерно! мембрани за допомогою спец1ал1зовано1 структури, звано! прикршним диском. Хоча кожна хромосома вже реплжувалась i складаеться з двох сестринських хроматид, щ хроматиди дуже т!сно зближен!, i тому кожна хромосома здаеться одиночною (окрем! хроматиди непом!тн! аж до тзньо! профази □ до стади диплотени чи диак!незу, стад!! спарювання хромосом).
Моментом переходу лептотени в зиготену вважають початок синапсису -- TicHo! кон'югац!! двох гомолопв. Через 12 годин, також за дози 0,3 мг/см3 бронтелу 10 %, вщбулися зм!ни у стади пах!тени (рис. 1, г).
299
а 1 ■ Ш . - \ * * о 6
Б • т
Рис. 1. а) вплив бронтелу 10 % (6 годин), порушення у структур! клггин леитотеии; б) вплив бронтелу 10 % (6 годин), набухания хромосом в зиготеш; в) кл1тина на стадй' лептотени (норма); г) вплив бронтелу 10 % (12 годин), порушення структури пах1тени. Фарбування ацетокармшом, зб. 10x100.
Пах1тена це - стад1я профази 1 мейозу, на якш завершуеться спарювання гомолопв. Хромосоми виглядають бшьш товстими, шж у лептотеш I зиготеш. Як тшьки завершуеться синапсис по всш довжиш хромосом, кл1тини вступають у стадш пах1тени, в якш вони можуть залишатися кшька д1б. На цш стадп в повздовжнш щшиш синаптонемного комплексу з'являються велик1 рекомбшацшш вузлики, як1 вщ1грають важливу роль в обмш1 дшянками м1ж хромосомами. Так1 обмши призводять до перехрещень м1ж двома несестринськими хроматидами: в обмшах бере участь по однш хроматид1 з двох спарених хромосом. В пах1теш перехрещення ще не видно, але тзшше вЫ вони виявляються у вигляд1 х1азм. Синапсис завершуеться, коли синаптонемш комплекси зв'язують
300
попарно вс1 гомолопчш аутосоми. Х- I У- хромосоми кон'югують не цшком. Мгж хроматидами вщбуваеться кросинговер.
Так як 1 за ди фасцюлоцид1в на сперматогенез фасцюли, вщбувалися змши, пов'язаш ¿з часом перебування паразита у середовищах ¿з р1зним вмютом антигельмштиюв, так I у експериментах за впливу на мейоз ми виявили вщмшност1 за ди бронтелу 10 %, Яю вщбувалися повшьшше, за впливу комб1трему - вщповщно швидше. За дози комб1трему 0,025 мг/см3 статев1 кл1тини у стади лептотени були бшьш розпушеними (набряклими), ашж за наближеного розведення бронтелу 10 % через той самий час. Ц1 деструкци були очевидними I у шших стад1ях мейотичного под1лу: зиготеш, диплотеш, пах1теш.
За бшьших експозицш та за менших доз у розчинах з комб1тремом та бронтелом 10 % фасцюли отримували нижч1 концентраци препарата вщповщно, змши у чолов1чих статевих кл1тинах мейотичного подшу були менш виявленими.
За впливу комбпрему у доз1 0,006 мг/см3 упродовж 12 годин ми виявили порушення у стади лептотени (рис.2, а), а через 24 години у доз1 0,0015 мг/см3 у зиготеш (рис. 2, б) та за ще! ж дози у диплотеш, стади розб1жност1 хромосом, яю втратили свою нормальну структуру (рис. 2, в). На цш стади мейозу теля пах1тени \ перед д1аюнезом диплотенш гомолопчш хромосоми починають вщштовхуватися { залишаються зв'язаними тшьки в мюцях х1азм .
Стад1я диплотени в I профаз! мейозу починаеться з подшу кон'югованих хромосом. Синаптонемний комплекс розпадаеться, що дозволяе двом гомолопчним хромосомам б1валенту трохи вщсунутися однш вщ одно!. Однак вони усе ще зв'язаш одшею чи деюлькома х1азмами, тобто мюцями, де вщбувся кросинговер. В ооцитах диплотена може розтягтися на мкящ чи роки, тому що саме на цш стади хромосоми конденсуються \ синтезують РНК, забезпечуючи яйцекл1тину резервними речовинами. В особливих випадках диплотенш хромосоми стають винятково активними у вщношенш синтезу РНК, таю хромосоми, типу лампових щ1ток, знаходять в амф1бш \ деяких шших оргашзм1в. Перед руйнуванням бшкових ниток останш вщокремлюються одна вщ одно!, що означав заюнчення синапсису.
При подальшому цитогенетичному скриншгу у статевих кл1тинах фасцюли нам вдалося виявити кл1тини на стади телофази 1, як це показано на рис. 2, г але змш в оброблених трематодах, на жаль, ми не встановили.
301
Рис. 2. а) вплив комб1трему (12 годин), порушення цитоструктури лептотени; б) вплив комб1трему (24 години), порушення цитоструктури зиготени; в) вплив комб1трему (24 годин), розходження хромосом в диплотеш; г) стад1я телофази 1 (норма). Фарбування ацетокармшом, зб.10х100
Отже, з отриманих нами даних за впливу фасцюлоцид1в in vitro на мейоз Fasciola hepatica можна зробити висновок, що бронтел 10 % та комб1трем виливають на статев1 хромосоми мейотичного циклу, що ироявляеться у них морфогенетичними змшами.
Висновки.
Гаметогенез у фасц1ол - перший етап розвитку, на якому вщбуваеться найб1льш висока (для всьго онтогенезу) селекщя гамет (статевих кл1тин) через штенсивну загибель 61льшост1 з них на Bcix етапах ix розвитку внаслщок порушень в них теля ендогенних або екзогенних вплив1в.
Вплив фасцюлоцидних препарат1в може бути джерелом цитолог1чних та цитогенетичних зм1н у гаметах трематоди, як1 проявляються морфогенетичними змшами у статевих хромосомах мейотичного подшу, що важливо враховувати
302
при вивченш генетичних мехашзм1в виникнення у фасцюл резистентносп до фасцюлоцидних антигельмштиюв.
На нашу думку, пщ впливом фасцюлоцид1в, порушення розвиваються як в цитоплазматичних, так i в ядерних структурах, в тому числ1 в хромосомах, шдукуючи хромосомн1 i reHHi мутаци. Мутаци, що виникають у статевих кл1тинах, можуть передаватися наступним поколшням фасцюл. Анал1з мейотичних кл1тин дозволяе встановлювати мейотичш мутаци i тоню порушення структури мейотичних хромосом на стад1ях зиготени i пах1тени профази 1 мейозу, метафази 1 i 2 мейозу.
Л1тература
1. Астафьев Б.А. Экспериментальные модели паразитозов в биологии и медицине / Астафьев Б.А., Яроцкий Л.С., Лебедева М.Н. - М.: Наука, 1989. -259 с.
2.Баранов B.C. Анализ нарушений сперматогенеза и эмбриогенеза у мышей / В.С.Баранов, А.П. Дыбан // Генетика, 1968. - Т.4., № 12. - С. 70- 83.
3.Бенедиктов И.И. Пути биологического и энергетического обмена у гельминтов и биохимический механизм действия антгельминтиков: автореф. дис. на соиск наук, степени докт. биол. наук: 03.00.20 "Паразитология", 03.00.04 "Биохимия"/ И.И. Бенедиктов. - М, 1982. - 46 с.
4.Вельш У. Введение в цитологию и гистологию животных / У. Вельш, Ф. Шторх. - Москва: Мир, - 1976. - 271с.
5.Гетз П. Хромосомные аберрации, индуцированные циклофосфамидом в мейотических клетках самцов мышей / П. Гетз, A.M. Малашенко, НИ. Суркова // Цитология и генетика. - 1980. - T.XIV, №4. - С. 29-35.
6.Дубинин Н.П. Цитологический анализ естественного мутационного процеса / Н.П. Дубинин, В.К. Щербаков, Л.Г. Дубинина, Г.Н. Кеслер // Цитология, - М., 1965. - №1(72). - С.23-28.
7. Дыбан А.П. Метод приготовления препаратов мейотических и митотических хромосом из семеников млекопитающих / А.П. Дыбан // Цитология. - М., 1969. - Т.12. - №5. - С.687-689.
8.Курило Л.Ф. Цитогенетические и цитологические подходы к виявлению нарушений гамет / Л.Ф. Курило // Лабораторное дело. - М.: Медицина, - 1989. - С. 4-8.
9.Мамаев Н.Н. Изучение активности ядрышкообразующих районов хромосом нормальных, лейкозных и опухолевых клеток человека с помощью окрашивания азотнокислым серебром / Н.Н. Мамаев, С.Е Мамаева, Д. Бенданадхайя, Н.В. Медведева // Цитология. - 1980. - Т.22, №2. - С. 161-165.
10. Мюнцинг А. Генетика общая и прикладная / Мюнцинг А. - М.: Мир, 1967. - 610 с.
11. Паушева З.П. Практикум по цитологи растений / Паушева З.П. -Москва: Агропомиздат, - 1988. - 271 с.
12. Пенькова Р.А. Изучение хромосом трихинелл / Р.А. Пенькова, Л.Н. Романенко // Труды всес. ин-та гельминтол., 1973. - Т. 20. - С. 133-142.
13. Рамайя Л.К. Цитогенетический эфект N-нитрозоэтилмочевины,
303
гидроксиламина и рентгеновых лучей на половые клетки самцов мышей /Л.К.Рамайя // Генетика, 1969. - Том V, № 2. - С.74-86.
14. Соболта А.Г. Цитогенетичш та цитолопчш дослщження сперматогенезу у Fasciola hepatica (Fasciolidae) / А.Г. Соболта // Наук. вкник Льв1всько! нацюнально! академи ветеринарно! медицини ¿м. С.З.Гжицького. -Льв1в, 2004. - Т. 6. Ч 1. - С. 90-93.
15. Терская Е.Р. Приготовление давленных препаратов из окрашенных ацетокармином яиц тутового шелкопряда / Терская Е.Р.// Методы биологии развития. - М. : Наука, - 1974. - 519 с.
16. Ханбегян Р.А. Изучение действия антгельминтиков на фасциол / Р.А. Ханбегян // Тр. Всес. ин- та гельминтологии. - М., 1975. - Т.22. - 177-184 с.
Summary Sobolta A.G.
Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology named after S.Z.Gzhytskyj INFLUENCE OF FASCIOLOCIDES ON MEIOSIS OF FASCIOLA HEPATICA IN VITRO
It was found that 10% brontel and kombitrem in vitro effect on the sex chromosomes of meyotyc cycle of Fasciola hepatica, which is manifested in of these morphogenetic changes.
Рецензент - д.вет.н., професор Стибель В.В.
304
