CC BY
41
ID: 2016-09-4353-R-9375 Обзор
Полуконова Н.В.
Цитогенетические и молекулярно-генетические методы в реализации комплексного подхода к решению проблем систематики и эволюции комаров-звонцов подсемейства Chironominae
ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, кафедра общей биологии, фармакогнозии и ботаники, г. Саратов, Россия
Polukonova N.V.
Cytogenetic and molecular genetic methods in the implementation of the comprehensive approach to the problems of systematics and evolution of chironomids subfamily Chironominae
Ключевые слова: комары-звонцы, Chironominae, Chironomini, Chironomus, проблемы систематики, эволюция, дезимагинизация, кариотипы, COI, COII, филогения, молекулярные реконструкции, время дивергенции
Keywords: Chironominae, Chironomini, Chironomus, problems of systematics, evolution, dezimaginizatsiya, karyotypes, COI, COII, phylogeny, molecular reconstruction, time of divergence
Chironominae: проблемы систематики, эволюции и филогении
Комары-звонцы, или хирономиды подсемейства Chironominae (Chironomidae, Diptera, Nematocera) относятся к насекомым с полным метаморфозом и дезимагинизацией, крылатая стадия большинства из которых стала афагом. У насекомых с дезимагинизацией наибольшие изменения в филогенезе протекают на преимагинальных стадиях, следуя по пути совершенствования, а имаго меняются слабо, обладая более древними признаками. Поэтому при исследовании систематического положения и эволюции таксонов подсемейства Chironominae использование морфологических признаков особенно только одной стадии развития не может дать достоверных и однозначных результатов. Кроме того, сложность морфологического строения комаров-звонцов, чрезвычайное видовое разнообразие и различие в экологии видов порождают элемент предвзятости в оценке эволюционной значимости одних морфологических преобразований перед другими, и, как следствие, субъективное представление о филогении таксонов. Неизбежен комплексный подход с использованием цито- и молекулярно-генетических методов.
Подсемейство Chironominae одно из девяти подсемейств Chironomidae и второе, после Orthocladiinae, по разнообразию таксонов (Маркарченко, Макарченко, 1999). Представители этого подсемейства населяют все зоогеографические области, исключая Антарктиду (Маркарченко, Макарченко, 1999). К настоящему времени по существующим сводкам (Coffman, Ferrington, 1996;Макарченко, Макарченко, 2006;Cranston, Martin, 2007; www.eol.org;www.animaldiversity.ummz.umich.edu; www.insects.ummz.lsa.umich.edu;www.boldsystems.org;www.faunaeur.org;www.taxonomy.nl) подсемейство Chironominae представлено тремя трибами - Chironomini, Tanytarsini и Pseudochironomini, включающими свыше 90 родов. К трибе Chironomini относится не менее 69 родов, к Tanytarsini - не менее 16, к Pseudochironomini - не менее пяти.
Реконструированная нами схема (рис. 1) эволюции нуклеотидной и аминокислотной последовательностей первой субъединицы цитохром С оксидазы Chironominae показала существование четырех эволюционных линий гена COI, три из которых соответствуют трибам Tanytarsini (=Tanytarsini), Pseudochironomini (=Pseudochironomini - Riethia+ Endochironomus+ Synendotendipes+Polypedilum+Sergentia) и Chironomini (= Chironomini - Stenochironomus-Endochironomus-Synendotendipes-Sergentia-Polypedilum+Riethia).
Четвертая линия, соответствующая Stenochironomus, значительно обособлена от трех остальных и возможно представляет собой линию отдельного подсемейства, что позволило скорректировать систематическое положение ряда таксонов внутри семейства в целом (Демин, 2011; Демин и др., 2011; Полуконова и др., 2013). Однако постоянно описывающиеся новые виды и рода могут изменить статус уже известных крупных таксонов.
Наличие в клетках слюнных желез личинок комаров-звонцов политенных хромосом (ПХ) не только сделало их излюбленным цитогенетическим объектом для изучения функционирования интерфазных хромосом эукариот (Кикнадзе, 1972; Жимулев, 1992), но и способствовало лучшему пониманию путей эволюции кариотипа этой группы насекомых на самом высоком уровне - уровне дзета-кариологии (White, 1978), а также наметило определенный этап в совершенствовании комплексного подхода -сопоставлению хромосомной и морфологической дивергенции видов в ходе их эволюции (Шобанов, 1990, 2000, 2002; Полуконова, 2005).Для представителей подсемейства Chironominae трибы Chironomini круг цитогенетических показателей, которые можно было использовать в систематике, расширился за счет возможности анализа дисковой структуры ПХ и на этой основе идентификации хромосомных плеч (Keyl, 1962; Белянина, 1983; Петрова, 1993; Кикнадзе и др., 1991, 1996; 2004; Шобанов, 1994 а, б; Гундерина, 2001; Дурнова, 1998, 2010;Полуконова, 2005; Durnovaetal., 2015 и др.).
Самым крупным родом трибы Chironomini является Chironomus, он насчитывает более 120 видов обитающих ныне на всех материках кроме Антарктиды (Шобанов др., 1996). Существуют разные точки зрения на подродовой состав Chironomus: зарубежные исследователи только на основании сходства рисунка дисков ПХ выделяют четыре подрода: Chironomuss. str., Camptochironomus, Lobochironomus, Chaetolabis(Cranstonetal., 1989). В то время, как российские исследователи считают Camptochironomusотдельным родом, учитывая серьезные отличия в морфологии и этологии имагинальной стадии (Шобанов др., 1996; Полуконова, 2005). В результате с учетом нового подрода Нalochironomus(Сhironomus), включающего виды Chironomus группы albidus из Каспийского моря (Полуконова и др, 2005; Белянина и др., 2005), Chironomus, с нашей точки зрения, представлен четырьмя подродами - Chironomuss. str., Нalochironomus, Lobochironomus, Chaetolabis.
Г<
4
Chironomini Pseu doch irono m í n i
Tanytarsíni
□ RT HGCLAD1INAE
0
1
PO
о
> m
Stenochvonamut ïlbbus Tortrshhi Cuta*« tlícum.c^tüi AF 0692-8 с ERA ТО ROGON IDA E
■ Cul*0M63 imite I* AF079975 -ÇkjMnlos bflsílis 0Q6J1991 lACftOCEKIDAÊ)
Рисунок 1. Эволюционные линии гена COI подсемейства Chironominae (Демин, 2011; Демин и др., 2011)
Рода, наиболее близкие к Chironomus - Baeotendipes, Einfeldia, Сатр^сЫгопот^и Benthalia, в совокупности представлены примерно 18 видами. Chironomus являетсяодним из наиболее эволюционно молодых родов бентосных хирономид (Соколова, 1983; Кикнадзе и др., 1991; Шобанов, 2000). Его виды находятся на разных этапах эколого-морфологической и хромосомной дифференциации (Гундерина, Кикнадзе, 2000; Полуконова, 2005), в связи с чем, представляют собой удобную модель для исследования начальных этапов не только дифференциации внутри групп близкородственных видов, но и эволюции в целом.
Внутриродовая дифференциация Chironomus очень сложна, и создает массу трудностей для систематиков. Так, согласно гидробиологической классификации личинки Chironomus различаются наличием и степенью развития латеральных и вентральных отростков VII и VIII брюшных сегментов; выделяют три личиночных типа: salinarius, tummi, plumosus (Липина, 1928) не имеющих таксономического статуса. Кариотипическая классификация, основанная на межвидовой изменчивости последовательностей дисков в гомологичных плечах ПХ и комбинации хромосомных плеч, привела к выделению 17 цитологических комплексов (Keyl, 1962; Wülker, Klötzli, 1973; Martinetal., 1974), не имеющих таксономического статуса. Кроме того, выделяют еще близкородственные виды и ассоциации видов-двойников, объединяющиеся в т. н. группы видов (Devaietal., 1983; Ryseretal., 1983; Шобанов, 1989 и др.). Группа видов - также нетаксономическая (или квазитаксономическая категория), объединяющая эволюционно близкие виды, сходные по морфологии и кариотипу (Шобанов и др., 1996). При этом часто для групп видов отсутствуют четкие диагностические критерии, объединение осуществляется по принципу относительного сходства. Все представители группы - морфологические двойники, надежно различающиеся только по хромосомным показателям, как по ряду последовательностей дисков ПХ, так и по размерам прицентромерного гетерохроматина.
Даже, несмотря на сложность, более или менее понятную картину внутриродовой группировки все-таки нарушают изредка встречающиеся исключения. Такие, как Chironomuspolonicus(=Ch. kabardensis(Кармоков, Полуконова 2012; Кармоков, 2013), который по строению личинки (в частности, неокрашенному ГС) и структуре кариотипа (сочетанию хромосомных плеч - AE, CD, BF)близок видам цитокомплекса pseudothuimmi, а по имаго, в частности, по строению верхних придатков ^о) гениталий самца С-типа - видам thummi-комплекса. В то время, как у имаго видов комплекса pseudothuimmiSVо формы «башмачка» (Strenzke, 1959). Другим примером исключения является представитель подрода Chironomuss. str. - Ch. novosibiricus (Кикнадзе, Истомина, 2000), по сочетанию хромосомных плеч^, CF, GED) относящийся к цитокомплексу modifiedcamptochironomus, более близкому видам Camptochironomus.
Особенности цитогенетического метода
Основными цитогенетическими критериями служат особенности организации ПХ из клеток слюнных желез личинок. При характеристике кариотипа используют такие показатели, как число хромосом (2n), сочетание хромосомных плеч, степень конъюгации гомологов, локализация и выраженность центромерных районов, количество прицентромерного гетерохромотина, число, локализация и степень развития активных районов ПХ - ядрышковых организаторов (ЯО), колец Бальбиани (КБ), крупных пуфов, а также последовательность дисков ПХ (Кикнадзе, 1972). Благодаря принципу эволюционной уникальности хромосомных перестроек их используют для реконструкции филогенетических отношений между видами (Wuelker, 1980; Шобанов, 2000; Шобанов, Зотов, 2001; Полуконова, 2003 б).
Среди комаров-звонцов представители подсемейства Chironominae лучше других изучены цитогенетически - кариотипы известны для 188 видов из 24 родов, из них 180 видов из 20 родов принадлежат самой большой по объему трибе Chironomini. Для большинства Chironominae характерен хромосомный полиморфизм инверсионного типа (Keyl, 1962; Кикнадзе и др., 1991 и др.), изучение которого важно для понимания микроэволюции этой группы насекомых. Инверсионные разломы в хромосомах, в основном, приходятся на строго определенные диски или междисковые районы - «горячие точки» в геноме (Стегний и др., 1976). На основании анализа структуры ПХ у комаров-звонцов был вскрыт принцип их эволюции - образование внутри цитокомплексов больших групп видов-двойников (Кикнадзе и др., 1991). Признаками, дифференцирующими эти виды-двойники, могли быть только специфические фиксированные комбинации хромосомных последовательностей, отличающиеся между собой одной или несколькими последовательными и параллельными инверсиями (Keyl, 1962; Kiknadze, 1987; Кикнадзе и др., 1996). В качестве интегрирующего признака кариотип выступает в тех случаях, когда он способствует объединению видов в роды, а родов - в систематические группы более высокого ранга и используется в решении проблем эволюции надвидовых таксонов. Особенности
рисунка дисков ПХ у комаров-звонцов пока возможно использовать только при анализе близких родов, таких, как Chironomus, Camptochironomus, Baeotendipes и др. (Шобанов и др., 1996).
Несмотря на значительный прогресс в изучении кариотипов комаров-звонцов, проследить пути их эволюции на основании подсчета инверсионных шагов возможно только для Chironomus, что связано с эволюционной молодостью этого рода и наличием у его видов гомологичных участков хромосом, отсутствующих у большинства других родов подсемейства Chironominae. Такая гомология могла быть утеряна за счет большого количества структурных хромосомных перестроек, произошедших между видами как внутри, так и между родами и более высокими таксонами (Кикнадзе и др., 1996).
Хромосомный анализ проводится обычно для выявления родственных связей слабо различающихся между собой по морфологии видов хирономид в пределах рода. Его преимуществом служит надежность при определении вида (Белянина и др., 1990; Белянина и др., 1992; Белянина, Логинова (Полуконова), 1993 а-в; Логинова (Полуконова), Белянина, 1994; Белянина и др., 2000; Истомина и др., 2000; Полуконова и др., 2003, 2005; Кармоков и др., 2014; Karmokov et al., 2015), а недостатком -трудоемкость, невозможность оценки родственных связей удаленных таксонов (хорошо дифференцированных родов, триб), что делает данный метод недоступным для использования в систематике подсемейства Chironominae.
Хромосомный полиморфизм, эволюция кариотипа и дифференциация видов
Особенности хромосомного полиморфизма видов с аллопатрическим и симпатрическим обитанием
Близкородственные виды хирономин с аллопатрическим распространением могут характеризоваться отсутствием инверсионного полиморфизма (Ch. bonusиCh. plumosus) или очень низким его уровнем (Ch. piger и Ch. riparius;Ch. curabilis и Ch. nuditarsis, Microtendipessp. из группы pedellus иMicrotendipespedellus), но в этом случае обычно различаются по количеству гетерохроматина (Полуконова, 2005). Близкородственные виды хирономид с симпатрическим распространением: Camptochironomus(Полуконова и др., 2005 а, б) и большинство Chironomus (Белянина и др.., 1992 Полуконова, 2004 а, б; 2005) обладают сравнительно высоким уровнем инверсионного полиморфизма, за исключением совместно обитающих Ch. dorsalis и Ch. sp. из группы dorsalis, которые хромосомно мономорфны (Белянина, Логинова (Полуконова, 1993 а).
Роль хромосомного полиморфизма в эволюции видов
Унифицированная нами типология последовательностей ПХ Chironomus группы plumosus (рис. 2) с четырьмя типами последовательностей ПХ (Полуконова, 2005), позволила оценить роль разных типов последовательностей в эволюции и адаптации видов.
I тип - межвидовые гомологичные последовательности (13.1% от общего числа последовательностей группы plumosus); преобладание которых у какого-то вида указывает на его наибольшее сходство с исходным в группе.II тип - внутривидовые базовые последовательности(12.4%), служат хромосомным «портретом» вида и составляют стабильную часть генома вида. Чем больше у вида последовательностей этого типа, тем дальше он удален от исходного в группе. III тип - редкие внутривидовые последовательности (31.4%), представляют варьирующую часть кариофонда вида, встречаются с низкой частотой (1-2%) и в гетерозиготном состоянии.^ тип - часто встречаемые внутривидовые последовательности(43.1%), присутствуют не в каждой популяции, усиливают межвидовую дифференциацию. Частота встречаемости личинок с этим типом последовательностейможет достигать 50% и более.
Уровень полиморфизма за счет последовательностей IV типа и наличие последовательностей III типа в популяциях Chironomus могут быть использованы при характеристике реакции генома хирономид на воздействие среды.
Исходным в группе plumosus обычно рассматривался Ch. plumosus (Кикнадзе и др., 1996; Шобанов, 2000). По нашим данным, о близости Ch. plumosusк исходному виду свидетельствует преобладание в кариофонде последовательностей! типа. Наличие у этого вида последовательностейШ типа, определяющее его приспособительные возможности на основе инверсионного полиморфизма, по-видимому, делает неспособным такой вид генерировать дочерние. Пути образования видов с идентичными последовательностями II типа - Ch. plumosus и Ch. bonusот исходного, вероятно, связаны с перераспределением гетерохроматина в геноме, что свойственно гомосеквентным видам (Стегний, 1991).
plu bai ent mur nud bon E2 ПДХI типа ^ПДХИтипа £3 ПДХ Ш типа Ш ПДХ IV типа
Рисунок 2. Доля последовательностей дисков хромосом (ПДХ) разных типов в кариофондах видов Chironomus группы plumosus
Эволюция кариотипа Ch. bonus, по-видимому, шла за счет аккумуляции гетерохроматина в В-хромосоме, а Ch. plumosus -распределения гетерохроматина по хромосомным плечам, способствуя включению «горячих точек» и переходу к полиморфному виду. Отсутствие у Ch. plumosus и Ch. bonus видоспецифичных базовых последовательностей подтверждает значимость гетерохроматина в эволюции кариотипа и указывает на возможность возникновения видов без изменения базовых последовательностей.
Для Ch. balatonicus, Ch. entis, Ch. muratensis, Ch. nudiventris отмечены другие пути эволюции кариотипа. Общим для этих видов служит наличие в кариофондах последовательностей I типа, не превышающее числа хромосомных плеч, и обязательное присутствие базовых последовательностей II типа, число которых (3-5) показывает удаленность этих видов от исходного. Выделены комплексы базовых последовательностей II типа, на основе которых происходила эволюция их кариотипов; межвидовая дифференциация кариотипаов этих видов усиливалась за счет негомологичных последовательностей III и IV типов.
Регистрация микроэволюционных процессов в популяциях одного вида
Анализ инверсионного полиморфизма Ch. nuditarsis предгорных и горных популяций (Полуконова, Кармоков, 2013; Кармоков, 2013) позволил зарегистрировать микроэволюционные процессы. Было установлено, что с увеличением высоты расположения водоема н.у.м. снижаются частоты зиготического сочетания ndtB2.2 и возрастает частота ndtG2.2. Значения цитогенетической дистанции между горной и предгорными выборками больше среднего (0.138) и варьируют от 0.174 до 0.223. Фактором, ограничивающим панмиксию и препятствующим обмену генами между предгорными и горными популяциями, может служить низкая температура воды высокогорных водоемов. Длительное препятствие обмена генами между предгорными и горными популяциями может привести к образованию нового вида.
Молекулярно-генетические методы и их возможности
Молекулярно-генетические методы в систематике и филогенетике основаны на выявлении сходств и различий между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями исследуемых организмов. Использование такого подхода имеет ряд неоспоримых преимуществ перед традиционными - морфологическим и цитогенетическим. Во-первых, эволюционные изменения ДНК- и аминокислотных последовательностей протекают более плавно, чем изменения морфологических и цитогенетических признаков (Гурьев, 2002; Демин, 2011). Вследствие этого, степень сходства ДНК- и аминокислотных последовательностей напрямую зависит от эволюционной удаленности организмов, что позволяет проводить более точные реконструкции родственных связей (Жимулев, 1992). Во-вторых, при проведении молекулярной реконструкции обычно используются сотни и тысячи признаков, выраженные в изменчивости отдельных нуклеотидов или аминокислот сравниваемых последовательностей (Лухтанов, Кузнецова, 2009), в то время, как морфологические или цитогенетические методы реконструкций обычно оперируют несколькими десятками признаков (Павлинов, 2005). В-третьих, молекулярно-генетические данные проще морфологических и цитогенетических поддаются математической обработке, вследствие их сравнимости и воспроизводимости (Абрамсон, 2009). Для этих целей к настоящему моменту разработано множество программ использующих различные методы и алгоритмы оценки эволюционных связей ДНК- и аминокислотных последовательностей, позволяющих проводить молекулярно-генетические реконструкции в относительно короткие сроки, избегая излишнего субъективизма.
Основным способом отображения молекулярно-генетической информации служит графическая визуализация в виде дендрограмм, показывающих родственные связи ДНК или белков. При правильном выборе молекулярно-генетического маркера (гомологичного участка ДНК или белка, полиморфного у сравниваемых таксонов), полученная дендрограмма может отображать филогенетические взаимоотношения между организмами (Абрамсон, 2007).
Молекулярно-генетичекий подход включает в себя множество точных методов, ведущим из которых является секвенирование отдельных фрагментов генома или установление первичной нуклеотидной последовательности. При правильном выборе генетических маркеров, полученные данные легко сравниваются даже между отдаленными таксонами, что позволяет в максимальном приближении взглянуть на ход эволюции, сводя её к точечным мутациям и структурным перестройкам отдельных генов или сателлитной ДНК (Банникова, 2004).
Процесс секвенирования автоматизирован, и для обработки его результатов к данному моменту создано множество специализированных компьютерных программ, таких как CROMASPRO, PAUP, MEGA, ARLEQUINE, OLIGO, LASERGENE, GENETREE, DNASTAR, GENERUNNER и др. Однако самые точные сведения об эволюции видов дает расшифровка всей ДНК, но секвенирование полных геномов является пока малодоступным для массового применения в филогении. Поэтому в настоящее время при проведении филогенетических реконструкций, в том числе у комаров-звонцов, широкое применение получило использование отдельных маркерных фрагментов ДНК. Помимо секвенирования применяются и менее информативные молекулярно-генетические методы, позволяющие комплексно анализировать эволюцию всей ДНК или ее составных частей: RAPD, RFLP, ISSR, AFLP и др. Из них для анализа филогенетического родства в подсемействе Chironominae пока применялся только RAPD (Гундерина и др., 2009) и RFLP (Sharleyetal., 2004).
Быстрое накопление информации о структуре нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных организмов привело к необходимости создания молекулярно-генетичсеких баз данных. К настоящему моменту огромный пласт информации о последовательностях ДНК и аминокислот живых организмов, содержащийся в молекулярных базах данных, позволяет проводить самые разнообразные научные изыскания с привлечением информации, полученной независимыми группами исследователей со всего земного шара (Wilson, Goodman, 2008). Активные исследования молекулярной организации Chironomusначались с 1982 года, когда впервые была установлена частичная нуклеотидная последовательность гена КБ2 для C. pallidivittatus (Jackleetal., 1982). Получены молекулярные характеристики генов, отдельных их участков и структурно-функциональных зон ПХ - центромер, теломер, ЯО, КБ, экдизоновых и температурных пуфов (Кикнадзе и др., 1989). Открытие у хирономид мобильных генетических элементов (МГЭ), выявленных первоначально при клонировании фрагментов ДНК КБ Ch. riparius, послужило одним из важных результатов их молекулярно-цитологического исследования, так как МГЭ рассматриваются как важный фактор видообразования (Кикнадзе и др., 1989).
К настоящему времени у видов наиболее широко распространенных родов подсемейства Chironominae -Chironomus, Camptochironomus, Polypedilum, Tanytarsus, Paratanytarsus, Micropsectra - частично или полностью определена нуклеотидная структура более чем 50 генов, а также структура некоторых мобильных генетических элементов, тандемных повторов и некоторых других некодирующих участков генома (www.ncbi.nlm.nih.gov). У многих видов хирономид исследованы, в основном, митохондриальные гены - гены первой и второй субединиц цитохром C оксидазы - COI, COII и цитохрома b (СytB), а из ядерных - гены EF-1a, ssp160, гены кодирующие структуру гемоглобина - gb2b и gbIX, ген 18S рДНК и ген карбомаилфосфат синтетазы (CAD) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Нуклеотидные последовательности большинства других генов установлены для четырех видов - двух видов рода Chironomusm группы ^anus - Ch. riрarius, Ch. piger и двух видов Camptochironomus - С. tentans и C. pallidivittatus.
Применение гена COI мтДНК в молекулярной филогении
Среди множества возможных молекулярно-филогенетических маркеров одно из лидирующих мест, как по кругу решаемых задач, так и по объему проводимых исследований, принадлежит мтДНК. Митохондриальный геном многоклеточных животных имеет размер 15000-17000 пар нуклеотидов, что составляет приблизительно 1/10000 от наименьшего ядерного генома животных. Поэтому, по сравнению с ядерным геномом, получить чистые препараты мтДНК достаточно просто. Митохондриальные гены, как правило, уникальны, редко перекрываются и не содержат интронов. Структура митохондриального генома довольно стабильна: 13 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК, 22 гена тРНК и контрольный регион, содержащий сайты инициации, репликации и транскрипции (Сингер, Берг, 1998). Наследование мтДНК осуществляется по материнской линии. Эволюционные изменения происходят без участия рекомбинации связанных с кроссинговером, преимущественно, за счет точечных мутаций, инсерции и делеции сравнительно редки, что позволяет использовать гены мтДНК для оценки времени дивергенции таксонов с применением гипотезы молекулярных часов (Демин, 2011; Полуконова и др., 2013).
У большинства позвоночных животных при проведении молекулярно-генетических реконструкций в качестве маркера наиболее часто используется ген CytB мтДНК (Банникова, 2004; Полуконова и др., 2013 а, б), благодаря тому, что подбор праймеров, обеспечивающих его ПЦР-амплификацию, не представляет сложности. Проблема поиска универсальных праймеров для беспозвоночных животных долгое время оставалась сдерживающим фактором широкого применения молекулярно-филогенетического подхода в изучении их эволюции до тех пор, пока не были разработаны универсальные праймеры для фрагмента генаСOI(Folmeretal., 1994). Ген СО1 считается одним из наиболее эволюционно консервативных в митохондриальном геноме (Wolstenholme, Clary, 1985), что позволяет проводить изучение филогении далеких таксонов. В то же время, наблюдаемое количество синонимичных замен достаточно для проведения исследований на межвидовом и популяционном уровнях (Folmeretal., 1994; Полуконова и др., 2013 а, б; Дурнова и др., 2014). Число эволюционных работ по беспозвоночным животным с использованием последовательностей гена СО1 в последние годы стремительно возрастает, следовательно, этот маркер можно рассматривать как наиболее перспективный для филогенетических исследований.
Крупнейшая из баз - GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) содержит сведения более 1900 нуклеотидных последовательностях, принадлежащих 1255 видам Chironomidae. Из них на долю самого изученного гена семейства - COIмитохондриальной ДНК, приходится 2/9 части от общего числа последовательностей, установленные для 215 видов. Возросший в последнее время интерес к изучению этого гена связан не только с уникальными особенностями его наследования и эволюции (Huangetal., 2008), но и с началом реализации проекта «BarcodingOfLife», предполагающего ДНК-штрихкодирование всех живых организмов на основе последовательности гена COI. В созданной для реализации этого проекта базе данных - Bold-system (www.boldsystems.org) на настоящий момент находится информация о более чем 3200 последовательностях гена COI, принадлежащих 300 видам подсемейства Chironominae. Совокупность изложенных данных делает ген COI самым привлекательным молекулярным маркером для эволюционных исследований в подсемействе Chironominae.
Нами выявлены особенности эволюционной изменчивости 5'-концевого фрагмента гена CO1в подсемействе Chironominae (Демин, 2011; Демин, Полуконова, 2014). Показано, что в 97% вариабельных нуклеотидных сайтов этого гена наблюдаются эволюционно нейтральные замены. Установлено (Демин и др., 2011), что уровень аминокислотной изменчивости лучше нуклеотидной отображает молекулярные границы рода, трибы и подсемейства. Показано, что использование аминокислотной последовательности позволяет точнее нуклеотидной дифференцировать друг от друга виды разных родов и определять положение таксонов надродового уровня.
Применение гипотезы молекулярных часов для расчета времени дивергенции хирономид
Одной из трудноразрешимых задач при исследовании эволюции комаров-звонцов является датировка эволюционных событий. Палеонтологические исследования затруднены сложностью родовой (не говоря уж о видовой) идентификации хирономид, и, как известно, носят единичный характер. Решением данной проблемы на молекулярно-генетическом уровне может стать применение гипотезы молекулярных часов (Zuckercandl, Pauling, 1965), согласно которой для любой макромолекулы (ДНК или белка) скорость накопления замен постоянна во всех эволюционных линиях. Такое предположение получило объяснение в рамках теории нейтральности молекулярной эволюции (Kimura, 1968). По данной теории большинство изменений на молекулярном уровне определяется не отбором, а селективно нейтральными или почти нейтральными случайными процессами мутации и дрейфа генов.
Важнейшее практическое приложение гипотезы молекулярных часов состоит в возможности получения временных оценок дивергенции организмов, исходя из анализа молекулярных данных. Несмотря на существующие противоречия, гипотеза молекулярных часов принята многими эволюционистами и используется для оценки времен дивергенции различных таксонов. Для проверки предположения о существовании молекулярных часов разработано несколько статистических тестов. Так, тест на относительные скорости эволюции - «relativeratetest» (Tajima, 1993), нацелен на проверку предположения о равенстве скоростей эволюции у двух родственных таксонов в сравнении с внешней группой. Подобный ему метод сравнения длин ветвей - «branch-lengthtest» (Takezakietal., 2004), выявляет отклонения длины отдельных ветвей от средней длины для всего древа.
Для применения гипотезы молекулярных часов наилучшим образом подходит мтДНК, так как изменение входящих в ее состав генов хорошо согласуется с теорией нейтральности (Knowltonetal., 1993). Калибровке хода молекулярных часов в генах мтДНК различных организмов посвящено множество работ (Knowltonetal., 1993; Papouchevaetal., 2003 и др.). Основными генами, используемыми для калибровки молекулярных часов у насекомых, являются: CytB, COII, COI и ген NADH4, кодирующий четвертую субъединицу НАДН-дегидрогеназы.
Большинство современных исследователей указывают рамки скоростей дивергенции последовательности гена COI у насекомых в интервале от 1.5% до 2.3% в 1 млн. л. (Jamnongluketal., 2003; Marketal., 2006 и др.). Следовательно, скорость эволюции ДНК составляет от 0.0075 до 0.0115 замен на сайт за 1 млн. л. Данные о скорости дивергенции генов в различных эволюционных линиях часто получают, используя палеонтологических останков родоначальников исследуемых эволюционных линий (Wheat et al., 2007). Большие перспективы при калибровке молекулярных часов в подсемействе Chironominae имеет использование палеонтологических датировок ископаемых останков первых представителей семейства Chironominae и, в частности,Aennetriassica, обитавшего210 млн. л.н. (Krzeminski, Jarzembowski,1999).
На основе анализа эволюционной изменчивости аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI, определена датировка эволюционных событий и получена хронограмма подсемейства Chironominae(Демин, Полуконова, 2008; Демин, 2011; Демин и др., 2011; Полуконова и др., 2013). Показано, что дивергенция хирономиды Stenochironomusgibbus происходила вместе с предковой формой Chironominae и Orthocladiinae приблизительно 135 млн. л.н. в начале мелового периода; время дивергенции трибы Tanytarsini от Chironomini и Pseudochironomini составляет около 85 млн. л.н., а трибы Chironomini от Pseudochironomini -около 66 млн. л.н.
Эволюционно значимые структурные изменения гена COI у комаров-звонцов подсемейства Chironominae
Для комаров-звонцов подсемейства Chironominae нами на основе поиска нуклеотидных сайтов, в которых несинонимичные замены были бы уникальны для каждой или нескольких эволюционных линий гена COI этого подсемейства, выявлены эволюционно значимые структурные изменения гена ОТ^Демин, 2011; Демин, Полуконова, 2014). Отобранные 17 аллельных вариантов последовательности COI были использованы для построения схемы эволюции гена COI (рис. 3), отражающей преобразование последовательности COI только в вариабельных сайтах 9 выявленных триплетов (всего 27 сайтов, из них 11 вариабельных).
Из 11 рассмотренных нуклеотидных сайтов только в 7 наблюдаемые несинонимичные замены приводят к изменению класса аминокислоты и, соответственно, способны повлиять на пространственную ориентацию пептидной цепи. Такие изменения затрагивают всего 5 триплетов из 9 отобранных и из 178 рассматривающихся первоначально:
1. 125 позиция - замена нуклеотида С на G (пролин - аланин) могла способствовать обособлению ветви Orthocladiinae от остальных хирономид;
2. 398, 399 позиции - замена нуклеотидов АА на GG (аспарагин - глицин) могла способствовать обособлению Orthocladiinae от общего с Chironominae предка. Замена нуклеотидов АА на GС (аспарагин - аланин) могла способствовать обособлению Stenochironomus от общего с остальными Chironominae предка. Позднее в эволюционной ветви Chironominae эта же замена или замена AG - GC (серин - аланин) могла привести к обособлению Chironomini от Pseudochironomini и Tanytarsini;
3. 410, 411 позиции - замена нуклеотидов GC на AG (аланин - серин) могла способствовать обособлению общего предка Stenochironomus и Chironominae от остальных от остальных хирономид;
4. 491 позиция - замена нуклеотида А на G (серин - аланин) могла привести к обособлению Stenochironomus от остальных хирономид;
569 позиция - замена нуклеотида A на G (треонин - аланин) могла привести к обособлению общего предка Chironominae и Stenochironomus от Orthocladiinae.
Рисунок 3. Схема эволюции гена COI, основанная на сайтах содержащих несинонемичные замены уникальные для эволюционных линий комаров-звонцов подсемейства Chironominae (Демин, Полуконова, 2014). Построение проводилось с использованием метода ME и эволюционной модели MCL. Цифрами указаны положения нуклеотидных сайтов отностительно старт-кодона гена COI, латинскими буквами в
скобках - соответствующие сайту нуклеотиды.
По-видимому, именно перечисленные сайты на участке 5'-концевого фрагмента последовательности гена COI с 100 по 634 п.н. могут потенциально являться эволюционно значимыми, изменения в них, возможно, не только маркируют эволюцию хирономид, но и способны привести к изменению структурных и функциональных особенностей COI. В пределах рассматриваемого фрагмента гена COI как синонимичные, так и несинонимичные нуклеотидные замены в 97% вариабельных сайтов потенциально имеют эволюционно нейтральный характер.
Пример комплексного - цито- и молекулярно-генетического подхода к решению вопроса о видообразовании Ch. usenicus
На основе сравнительного анализа рисунка дисков ПХ Ch. usenicus, Ch. plumosus, Ch. behningi было выдвинуто предположение о новом для данной группы способе видообразования - на основе межвидовой гибридизации (Полуконова, Белянина, 2002; Полуконова, 2003а, б; Полуконова, 2005), до этого времени межвидовые гибриды считались единичными (Голыгина и др., 1997). Ch. usenicus возник, по нашему мнению, в результате гибридизации Ch. plumosus и Ch. behningi.B кариофонде Ch. ^ете^в консервативном у видов Chironomus плече G (хромосома IV) существует три комбинации последовательностей - одна гомозиготная комбинация useG1(=pluG1) и две гетерозиготные - useG1(=pluG1)/ useG2 (=behG1) и useG1(=pluG1)/ useG3. Большинство особей Ch. ^еп/'с^обладают комбинацией useG1(=pluG1)/ useG2 (=behG1). Анализ последовательностей ПХ в плечах Ch. usenicusпокaзaл, что 75% участков ПХ в его кариотипе общие с Ch. plumosus, 12.5% - общие с Ch. behningi и 12.5% -специфичные для Ch. usenicus.
Рассматриваемая модель видообразования может выглядеть следующим образом: Ch. plumosus + Ch. behningi = Ch. usenicus, Ch. plumosus, Ch. Behningi.
На юге Саратовской области, где совместно обитают Ch. plumosus и Ch. usenicus (в соотношении 2: 1), Ch. behningiне обнаружен. Отсутствие Ch. behningiв зоне интрогрессии и уменьшение числа гомологичных с ним последовательностей в кариофонде вида гибридного происхождения (у Ch. usenicusиз 16 последовательностей - шесть идентичны последовательностей Ch. plumosus и три идентичны последовательности^. behningi) указывают на поглотительный характер интрогрессивной гибридизации.
Исследованные особи Ch. usenicus одной популяции могли отличаться между собой синонимичными заменами (транзициями) в 183 позиции (G/A), 297 (G/А) и 342 (G/A), находящимися во всех случаях в третьем нуклеотиде кодона. Выявленный нуклеотидный полиморфизм в популяции^. usenicus связан с его эволюционной нестабильностью в зоне интрогрессии (Полуконова, 2003а; Полуконова и др., 2009).
Дендрограмма видов группы plumosus, построенная по гену COI (Полуконова и др., 2009), показывают, что Ch. usenicus входит в группу plumosus, образуя единый кластер с видами Ch. curabilis, Ch. plumosus,Ch. entis.
Уровень различий по гену COI у Ch. usenicus из оз. Калач и у Ch. plumosus из Германии, р. Рейн (данные GenBank) не превышает внутривидового, а при симпатрическом обитании этих видов в оз. Калач - даже внутрипопуляционного уровня, что можно объяснить двумя гипотезами.
Согласно первой гипотезе, молодой вид гибридного происхождения^. usenicus унаследовал мтДНК от Ch. plumosus (как одного из родительских видов). Согласно второй, - Ch.usenicus имеет древнюю историю, и наличие мтДНК «плюмозусного» типа можно объяснить гибридизацией этих видов в зоне вторичного контакта. Первую гипотезу демонстрирует реконструкция образования сообщества Ch. plumosus - Ch. usenicusсубaридной территории Прикаспийской низменности - оз. Калач (Полуконова, 2003а).
Вторая гипотеза, объясняющая сходство гена мтДНК Ch. usenicus и Ch. plumosus,может проистекать из возможности горизонтального переноса мтДНК, что могло произойти при вторичной встрече Ch. plumosusиCh. usenicus на субаридной территории Прикаспийской низменности. Объяснением может служить возникновение межвидовой гибридизации с последующими возвратными скрещиваниями, в результате которых у потомков появляется мтДНК одного из родительских видов. При этом даже её незначительное селективное преимущество способно привести к быстрой фиксации нового гаплотипа в популяции (Полуконова и др., 2009).
Наиболее вероятным объяснением сходства гена COICh. plumosusи Ch. usenicus представляется наследование мтДНК Ch. usenicusот Ch. plumosus (как одного из родительских видов) в процессе асимметричной гибридизации Ch. plumosus и Ch. behningi. В настоящее время гибридных форм Ch. usenicus х Ch. plumosus в оз. Калач не было обнаружено, из чего следует, что гибридизация происходила в прошлом. По-видимому, Ch. usenicus, настолько молод в филогенетическом отношении вид, что его мтДНК и мтДНК одного из родительских видов - Ch. plumosus недостаточно дивергировали друг от друга. Наличие у Ch. plumosusи Ch. usenicus общего митохондриального гаплотипа «плюмозусного» типа, в то время, как по хромосомным показателям виды достаточно четко дифференцированы, отражает, по-видимому, разную скорость их дивергенции в ходе эволюции - хромосомная дифференциация видов происходит наиболее быстро и опережает как молекулярную дивергенцию гена COI, так и морфологическую.
Литература
1. Абрамсон Н.И. Филогеография: итоги, проблемы, перспективы // Вестник ВОГиС. 2007. Vol. 11, № 2. С. 307-331.
2. Абрамсон Н.И. Молекулярные маркеры, филогения и поиск критерия разграничения
3. видов // Труды Зоологического института РАН. Приложение № 1. 2009. С. 185-198.
4. Банникова А.А. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитющих // Журнал общей биологии. 2004. Т. 65, № 4. С. 278305.
5. Белянина С.И. Кариотипический анализ хирономид (Chironomidae, Díptera) фауны СССР // Автореф. дисс. докт. биол. наук. М. 1983. 39 с.
6. Белянина С.И., Логинова Н.В. (Полуконова), Сигарева Л.Е.. Морфологическая характеристика вида Chironomusentis (Chironomidae, Díptera) и его кариофонд из разных географических зон // Зоол. журн. 1992. Т. 71, №8. С. 32-38.
7. Белянина С.И., Логинова Н.В. (Полуконова). Кариотипическая дифференциация двух близких видов Chironomus цитокомплекса pseudothummi // Кариосистематика беспозвоночных животных. II. СПб., 1993а. С. 58-61.
8. Белянина С.И., Логинова Н.В. (Полуконова). Кадастр порядков дисков в политенных хромосомах видов Chironomus группы plumosus. I. Кариофонд Chironomusbalatonicus // Цитология. 1993б. Т. 35, №4. С. 87-92.
9. Белянина С.И., Логинова Н.В. (Полуконова). Кадастр порядков дисков в политенных хромосомах видов Chironomus группы plumosus. II. Кариофонд Chironomus plumosus// Цитология. 1993в. Т. 35, № 8. С. 65-70.
10. Белянина С.И., Кикнадзе И.И., Полуконова Н.В., Истомина А.Г., Сиирин М.Т. Кариотип комара-звонца ChironomusheterodentatusKonstantinov из группы obtusidens (Diptera, Chironomidae) // Цитология. 2000. Т. 42, N 6.С. 593-601.
11. Белянина И., Полуконова Н.В., Зинченко Т.Д. Кариотип и морфология личинки комара-звонца рода Chironomus (Chironomidae, Diptera) из Каспийского моря Цитология. 2005. Т. 47. № 4. С. 331-337.
12. Белянина С.И., Сигарева Л.Е., Логинова Н.В.Новый видChironomuscurаbШs, sp. n. (Diptera, Chironomidae) //Зоологический журнал. 1990. Т. 69. № 5. С. 60.
13. Голыгина В. В., Истомина А. Г., Кикнадзе И. И. Межвидовые гибриды видов группы plumosus (Diptera, Chironomidae) в природной популяции // Место и роль двукрылых насекомых в экосистемах. Сб. науч. тр. У1 Всерос. диптерол. симп., посв. 100-летию со дня рожд. А. А Штакельберга. СПб. Зоол. ин-т РАН, 1997. С.38-39.
14. Гундерина Л.И. Генетическая изменчивость в эволюции хирономид (Diptera, Chironomidae) // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. д.б.н. Н. 2001. 33 с.
15. Гундерина Л.И., Кикнадзе И.И. Дивергенция кариофондов видов-двойников группы plumosus (Diptera, Chironomidae) // Генетика. 2000. Т. 36, № 3. С. 339-347.
16. Гундерина Л.И., Кикнадзе И.И., Истомина А.Г., Батлер М. Географическая дифференциация геномной ДНК Chironomus plumosus (Diptera, Chironomidae) в природных популяциях Голарктики // Генетика. 2009. Т. 45, № 1. С. 64-72.
17. Гурьев В.П. Молекулярная филогения рода Chironomus (Diptera, Nematocera): Автореф. дис... канд. биол. наук. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 2002. 17 с.
18. Демин А. Г. Анализ эволюционной изменчивости гена^/ и его использование дляфилогении и систематики таксонов с высоким видовым разнообразием на примере комаров-звонцов подсемейства Chironominae (Chironomidae, Diptera).// Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. М. 2011. 26 с.
19. Дёмин А.Г., Полуконова Н.В.Оценка времени дивергенции комаров-звонцов рода chironomus (Diptera) на основе гипотезы «молекулярных часов» // Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. 2008. № 7. С. 8-14.
20. Демин А.Г., Полуконова Н.В., Мюге Н.С. Молекулярная филогения и время дивергенции комаров-звонцов (Chironomidae, Nematocera, Diptera) на основе частичной последовательности гена первой субъединицы цитохром с оксидазы (CO/) // Генетика. 2011. Т.47, №10.С. 1315-1327. Demin A.G., Polukonova N.V., Mugue N.S. Molecular phylogeny and the time of divergence of minges (Chironomidae, Nematocera, Diptera) inferred from a partial nucleotide sequence of the cytochrome oxidase i gene (COI) Russian Journal of Genetics. 2011. Т. 47. № 10.С. 1168-1180.
21. Демин А.Г., Полуконова Н.В. Молекулярно-генетические маркеры эволюционных линий Chironominae и Orthocladiinae (Chironomidae: Diptera) в несинонимичных сайтах гена мтДНК COI // Труды Русского энтомологического общества. С.-Петербург, 2014. Т. 85(2): 8-18.
22. Дурнова Н.А.Хирономиды рода Glyptotendipes Kieffer (Diptera, Chironomidae): морфология, кариотипы и экологические особенности // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. Биол. наук / Санкт-Петербург, 1998. 16 с.
23. Дурнова Н.А.Хирономиды перифитона водоемов Саратовской области: экологические особенности, морфология, цитогенетика (Diptera, Chironomidae, Chironomini). Дисс. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук / Зоологический институт Российской академии наук. Санкт-Петербург, 2010. 492 с.
24. Дурнова Н.А., Демин А.Г., Полуконова Н.В., Мюге Н.С.Энтомологическое обозрение. 2014. Т. 93.Оценка времени возникновения способности к обрастанию и минированию погруженных субстратов у хирономид подсемейств ChironominaeMacquart, 1838 и OrthocladiinaeLenz, 1921 (Diptera, Chironomidae) на основании анализа митохондриальных генов CO/ и CO// // Энтомол. обозрение. 2014. Т. 94. № 2.С. 367-380.
25. Durnova N.A., Demin A.G., Polukonova N.V., Mugue N.S.The time of origin of the capacity to accrete and mine submerged substrates in the midge subfamilies Chironominae Macquart, 1838 and Orthocladiinae Lenz, 1921 (Diptera, Chironomidae): analysis of mitochondrial genes CO/ and CO// // Entomological Review. 2014. V. 94. № 7. S. 949-958.
26. ЖимулевИ.Ф. Политенныехромосомы: морфологияиструктура. Новосибирск: Наука, 1992. 479 с.
27. Истомина А.Г., Сиирин М.Т., Полуконова Н.В., Кикнадзе И.И.. Chironomus sokolovae sp. n. - новый вид группы obtusidens (Diptera, Chironomidae) // Зоол. журн. 2000. Т.79. N 8. С. 928-938.
28. Кармоков М.Х Роды ChironomusMeigen, 1803 и Camptochironomus Kieffer, 1918 (Diptera, Chironomidae) Центрального Кавказа и Предкавказья: систематика, распространение и хромосомный полиморфизм // Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. СПб., 2013. 20 с.
29. Кармоков М.Х. Белянина С.И., Жиров С.В., Петрова Н.А. Кариотип и морфология комара-звонца Stictochironomus // Энтомологическое обозрение. 2014. XCIII, №3. С. 555 - 563.
30. Кармоков, М.Х. Кариосистематика комаров-звонцов Chironomusи Camptochironomus(Diptera, Chironomidae) Центрального Кавказа и Предкавказья / М.Х. Кармоков, Н.В. Полуконова // Материалы IV Международной конференции "Горные экосистемы и их компоненты", посвященной 80-летию основателя ИЭГТ КБНЦ РАН чл.-корр. РАН А.К. Темботова и 80-летию Абхазского государственной университета. Нальчик: Издательство М. и В. Котляровых (ООО «Полиграфсервис и Т»), 2012. С. 148.
31. Кикнадзе И.И. Функциональная организация хромосом. Л.: Изд. Наука, 1972. - 211 с.
32. Кикнадзе И.И., Блинов А.Г., Колесников Н.Н. Молекулярно-цитологическая организация генома хирономид // Структурно-функциональная организация генома / Ред. В.К. Шумный. - Новосибирск: Наука, 1989. - С. 4-58.
33. Кикнадзе И.И., Голыгина В.В., Истомина А.Г., Гундерина Л.И. Закономерности хромосомного полиморфизма при дивергенции популяций и видов у хирономид (Chironomidae, Diptera) // Сибирский экологический журн. 2004. Т. 11, № 5. С. 635-651.
34. Кикнадзе И.И., Истомина А.Г. и др. Кариофонды хирономид криолитозоны Якутии: Триба Chironomini. Новосибирск: Наука, 1996. 166 с.
35. Кикнадзе И.И., Истомина А.Г. Кариотипы и хромосомный полиморфизм сибирских видов хирономид (Diptera, Chironomidae) // Сиб. экол. журн. 2000. №4. С. 445-460.
36. Кикнадзе И.И., Шилова А.И., Керкис И.Е., Шобанова Н.А., Зеленцов Н.И., Гребенюк Л.П., Истомина А.Г., Прасолов В.А. Кариотипы и морфология личинок трибы Chironomini. Атлас. Новосибирск: Наука, Сиб. от-е., 1991. 115 с.
37. Липина Н.Н. Личинки и куколки хирономид. Экология и систематика. М.: изд-во науч. ин-та рыб.хоз-ва, 1928. 179 с.
38. Логинова Н.В. (Полуконова), Белянина С.И. Chironomus usenicus sp. n., новый вид Chironomus группы plumosus (Chironomidae, Diptera) //Зоологический журнал. 1994. Т. 73. № 11. С. 93.
39. Лухтанов В.А., Кузнецова В.Г. Молекулярно-генетические и цитогенетические подходы к проблемам видовой диагностики, систематики и филогенетики // Журнал общей биологии. 2009. Т. 70, №5. С. 415-437.
40. Макарченко Е.А., Макарченко М.А. Хирономиды. // Определитель насекомых Дальнего Востока России. Т. 6. Двукрылые и блохи. Ч. 4 / Под общ.ред. П. А. Лера. - Владивосток: Дальнаука, 2006. - 936 с.
41. Макарченко Е.А., Макарченко М.А. Хирономиды. // Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий. Т.4. Высшие насекомые. Двукрылые / Под ред. С.Я. Цалолихина. СПб.: Изд. зоол. инст., 1999. С. 210-295, 670-857.
42. Павлинов И.Я. «Новая филогенетика»: источники и составные части // Эволюционные факторы формирования разнообразия животного мира. М.: Т-во научных изданий КМК, 2005. С. 15-29.
43. Петрова НА Хромосомный полиморфизм и микроэволюция у хирономид и мошек // Кариосистематика беспозвоночных животных. II. СПб., 1993. С. 46-49.
44. Полуконова A^., Демин AT., Полуконова Н.В., Ермохин М.В., Табачишин В.Г.Молекулярно-генетическое исследование локальных популяций чесночницы обыкновенной Pelobates fuscus (Laurenti, 176S) долины р. Медведица (Саратовская область) по участку гена мтднк -CYTB // Современная герпетология. 2013а. Т. 13. № 3-4. С. 117-121.
45. Полуконова A^., Демин AT., Ермохин М.В., Табачишин В.Г. Новые гаплотипы чесночницы обыкновенной Pelobates fuscus (Laurenti, 176S) из популяций в долине реки медведица (Саратовская область) // В сборнике: Биология внутренних вод Материалы XV Школы-конференции молодых ученых. 2013 б. С. 304-308.
46. Полуконова Н.В. Реконструкция этапов формирования кариологической структуры популяций Chironomus plumosus и C. usenicus (Diptera, Chironomidae) субаридных территорий Прикаспийской низменности // Энтомологические и паразитологические исслед. в Поволжье. Вып. 2. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2003а. С. 29-43.
47. Полуконова Н.В. Филогенетические связи близкородственных видов Chironomus (Chironomidae, Diptera) // Тр. Рус.энтомол. об-ва. 2003б. Т. 74. СПб. С. 71-80.
48. Полуконова Н.В. Инверсионный полиморфизм комаров-звонцов Chironomus группы plumosus (Dipte^, Chironomidae). I. Структура кариофондов популяций шести видов фауны Нижнего Поволжья // Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. Вып. 3. Саратов. Изд-во Сарат. ун-та, 2004 а. С. 11-24.
49. Полуконова Н.В. Инверсионный полиморфизм комаров-звонцов Chironomus группы plumosus (Dipte^, Chironomidae). II. Типология последовательностей дисков политенных хромосом // Энтомологические и паразитологические исследования в Поволжье. Вып. 3. Саратов. Изд-во Сарат. ун-та, 2004 б. С. 25-31.
50. Полуконова Н.В. Морфологическая и хромосомная дифференциация комаров-звонцов (Chironomidae, Diptera) в процессе видообразования. Диссертация на соиск. ученой степени докт. Биол. наук / Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского. Саратов, 2005. 564 с.
51. Полуконова Н.В., Белянина С.И. О возможности гибридогенеза в видообразовании комара-звонца Chironomususenicus Loginova et Beljanina (Chironomidae, Diptera) // Генетика. 2002. Т. 3S, №12. С. 1635-1640.Polukonova N.V, Beljanina S.I. On the Possibility of Hybridogenesis in the Origin of Midge Chironomus usenicus Loginova et Beljanina (Chironomidae, Diptera) // General Genetics. 2002. 12. S. 13S5-1390.
52. Полуконова Н.В., Белянина С.И., Михайлова П.В., Голыгина В.В.Морфо-кариотипический подход к решению дискуссионных вопросов систематики на примере Chironomus curabilis Beljanina, Sigareva, Loginova, 1990 (Diptera, Chironomidae) // Проблемы эволюции. 2003. С. 207.
53. Полуконова Н.В., Белянина С.И., Зинченко Т.Д. Chironomus paraalbidus sp. n. (Chironomidae, Diptera) из Каспийского моря // Зоологический журнал. 2005. Т. S4. № S. С. 1017-1024.
54. Полуконова Н.В., Белянина С.И., Михайлова П.В., Голыгина В.В.Сравнительный анализ кариотипов и кариофондов комаров-звонцов Chironomus nuditarsis и Ch. curabilis (Chironomidae, Diptera)Зоологический журнал. 2005. Т. S4. № 2.С. 195-206.
55. Полуконова Н.В., Демин AT., Шайкевич Е.В., Мюге Н.С. Сравнение Chironomus usenicus и Ch. curabilis с видами группы plumosus(Diptera) по гену митохондриальной днк ОТ!и рисунку дисков политенных хромосом // Генетика. 2009. Т. 45, №S. С. 1-7. Polukonova N.V., Djomin A.G., Mugue N.S., Shaikevich E.V. Comparison of Chironomus usenicus and Chironomus curabilis with Species of the Group plumosus (Diptera) Inferred from the Mitochondrial DNA Gene COI and Polytene Chromosomes Banding Pattern // Russian Iournal of Genetics. 2009. Vol. 45, № S.P. S99-905.
56. Полуконова Н.В., Демин AT, Мюге Н.С. Молекулярные критерии в систематике насекомых: диапазон изменчивости штрихкодового гена COI как таксономический критерий рода, трибы и подсемейства, на примере комаров-звонцов Chironominae и Orthocladiinae (Chironomidae, Diptera) // Журнал общей биологии. 2013. Т. 74. № 1. С. 66-76.
57. Полуконова Н.В., Кармоков М.Х.Микроэволюционные изменения в популяциях Chironomus nuditarsis Str. (Keyl, 1962) (Chironomidae, Diptera) Центрального Кавказа// Генетика. 2013. Т. 49. № 2. С. 175-1S1. PolukonovaN.V., KarmokovM.K. Microevolutionary changes in populations of Chironomus nuditarsis Str. (Keyl, 1962) (Chironomidae, Diptera) from Central Caucasus //Russian Journal of Genetics. 2013. Т. 49. № 2. С. 151-157.
58. Полуконова Н.В., Кармоков М.Х., Шатерников A.Н.Инверсионный полиморфизм комара-звонца Camptochironomus pallidivittatus Edwards, 1929 (Diptera, Chironomidae) из популяций Нижнего Поволжья и Центрального Кавказа // Генетика. 2015б. Т. 51. № 2.С. 156-165. Polukonova N. V., Karmokov M. Kh., Shaternikov A. N. Inversion Polymorphism of the Non Biting Midges Camptochironomus pallidivittatus Edwards, 1929 (Diptera, Chironomidae) from populations of the Lower Volga Region and Central Caucasus // Russian Journal of Genetics, 2014, Vol. 50, No. 12, pp. 12551262.
59. Полуконова Н.В., Шатерников A.K, Кармоков М.Х. Инверсионный полиморфизм комара-звонца Camptochironomus tentans (Fabricius), 1S05 (Diptera, ^^nom^dae) из популяций Нижнего Поволжья и Центрального Кавказа // Генетика. 2015. Т. 51. № 1.С. 2S-3S. Polukonova N.V., Shaternikov A.N., Karmokov M.K.Inversion polymorphism of non-biting midges Camptochironomus tentans (Fabricius) 1S05 (Diptera, Chironomidae) from populations of the lower Volga region and Central Caucasus // Russian Journal of Genetics. 2015а. Т. 51. № 1. С. 22-32.
60. Сингер М., Берг П.. Гены и Геномы: в 2-х т. Т.2. М.: Мир, 199S. - 391 с.
61. Соколова Н.Ю.(ред.) Мотыль ChironomusplumosusL. (Diptera, Chironomidae). Систематика, морфология, экология, продукция. М. 19S3. 307 с.
62. Стегний В.Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск: Изд-во Томск.ун-та. 1991. 137 с.
63. Стегний В.Н., Кабанова В.М., Новиков Ю.М., Плешкова Г.Н. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anophelesmemesseae. I. Распространение инверсий по ареалу вида // Генетика. 1976. Т. 12, №4. С. 47-55.
64. Шобанов KA. Морфологическая дифференциация видов Chironomus группы plumosus (Diptera, Chironomidae). Личинки // Биология, систематика и функциональная морфология пресноводных животных. Л.: Наука, 19S9. С. 250-279.
65. Шобанов KA. Систематика и биология рода ChironomusMeig. Сестринские виды группы plumosus // Дисс. ... канд. биол. н. Л., 1990. 150 с.
66. Шобанов НА Кариофонд Chironomusplumosus (L.) (Diptera, Chironomidae) 1. Стандартизация дисков политенных хромосом в системе Максимовой // Цитология. 1994а. Т.36, №1. С.117-122.
67. Шобанов НА Кариофонд Chironomusplumosus (L.) (Diptera, Chironomidae). IV. Внутри- и межпопуляционный полиморфизм // Цитология 1994 б. Т. 36. №11. С. 1129-1145.
68. Шобанов НА Род ChironomusMeigen (Diptera, Chironomidae). Систематика, биология, эволюция // Aвтореф. дисс. ... докт. биол. наук. СПб., 2000. 52 с.
69. Шобанов НА Эволюция рода Chironomus. 1. Предковая форма и основные направления филогенеза // Зоол. журн. 2002. Т. S1, № 4. С. 463468.
70. Шобанов НА, Зотов С.Д. Цитогенетические аспекты филогении рода ChironomusMeigen (Diptera, Chironomidae) // Энтомол. обозр. 2001. Т. S0. №1. С. 1S0-193.
71. Шобанов НА, Шилова A.^, Белянина С.И. Объем и структура рода Chironomus(Diptera, Chironomidae): обзор мировой фауны // Экология, эволюция и систематика хирономид. Тольятти; Борок: Ин-т биологии внутр. вод РAН. Ин-т экологии волжск. Бассейна РAН; 1996.С. 24-27
72. Coffman W.P., Ferrington L.C. Chironomidae // In Merrit R.W., Cummins K.W. (eds.) An introduction to aquatic insects of North America, 3rd ed. Kendall/Hunt Publishing. Dubuque, Iowa, 1996. Р. 635-754.
73. Cranston P.S., Martin J. - Family Chironomidae: [Электронный документ]. - 2007. - Р. 252-274. (http://hbs.bishopmuseum.org/aocat/pdf/26chiro.pdf). Проверено 20.11.2010.
74. Cranston P. S., Dillon M. E., Pinder L. C. V. The adult males of Chironominae - Keys and diagnoses // Ent. Scand. 1989.Suppl. 34.
75. Devai Gy., Wuelker W., Scholl A.Revision der Gattung Chironomus Meigen (Diptera). IX. C. balatonicus sp.n. aus dem Flachsee Balaton (Ungarn) // Acta Zool. Acad. Sci. Hung. 1983. Vol. 29, №4. P. 357-374.
76. Durnova N., Sigareva L., SinichkinaO. Chromosome analysis of Endochironomus albipennis Meigen, 1830 and morphologically similar Endochironomus sp. (Diptera: Chironomidae) from water-bodies of the Saratov region (Russia) Comparative Cytogenetics. 2015. 9(4): 579-593.
77. Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R., Vrijenhoek R. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1994. Vol. 3, № 5. P. 294-299.
78. Huang D., Meier R., Todd P.A., Chou L.M. Slow Mitochondrial COI Sequence Evolution at the Base of the Metazoan Tree and Its Implica. // Molecular Evolution. 2008. Vol. 66, № 2. Р. 167-174.
79. Jackle H., Almeida J.C., Galler R. et al. Constant and variable parts in the Balbiani ring 2 repeat unit and the translation termination region // EMBO Journal. 1982. Vol. 1, № 7. P. 883-888.
80. Jamnongluk W., Baimai V., Kittayapong P. Molecular phylogeny of tephritid fruit flies in the Bactrocera tau complex using the mitochondrial COI sequences // Genome. 2003. Vol. 46. P. 112-118.
81. Karmokov M.K., Polukonova N.V., Sinichkina O.V. Karyotype characteristics and polymorphism peculiarities of Chironomus bernensis Wülker & Klötzli, 1973 (Diptera, Chironomidae) from the Central Caucasus and cis Caucasia // Comparative Cytogenetics. 2015. Т. 9. № 3.C. 281-297.
82. Keyl H.G. Chromosomenevolution bei Chironomus II. Chromosomenbauten und
83. phylogenetische Bezichungen der Arten // Chromosoma. 1962. Vol. 13, №4. S. 464-514.
84. Kimura M. Evolutionary rate at the molecular level // Nature. 1968. Т. 217. P. 624-626.
85. Kiknadze I.I. Chromosomal polymorphism in natural populations of plumosus species-group of West Siberia.Ent. Scand. (1987) 29: 113-121.
86. Knowlton N., Weigt L.A., Solorzano L.A. et al. Divergence in proteins, mitochondrial DNA, and reproductive compatibility across the Isthmus of Panama // Science. 1993. Vol. 260. - P. 1629-1632.
87. Krzeminski W., Jarzembowski, E. Anne triassica, n.sp., the oldest representative of Chironomidae // Polskie Pismo Entomologiczne. 1999. № 68. Р. 445-449.
88. Mark I., Stevens. Penelope Greenslade, Ian D. Hogg and Paul Sunnucks. Southern Hemisphere Springtails: Could Any Have Survived Glaciation of Antarctica? // Molecular Biology and Evolution. 2006. Vol. 23, № 5. P. 874-882.
89. Martin I., Wülker W., Sublette J. E. Evolutionary cytology in the genus Chironomus Meig. // Ent. Scand. Suppl. Lund. Sweden. 1974. Vol. 1, №12. P. 112.
90. Papoucheva E., Proviz V., Lambkin C.et al. Phylogeny of the endemic Baikalian Sergentia (Chironomidae, Diptera) // Molecular Phylogenetics and Evolution. 2003. Vol. 29. - P. 120-125.
91. Ryser H.M., Scholl A., Wuelker W. Revision der Gattung Chironomus Meigen (Diptera). VII. Ch. muratensis n. sp. und Ch. nudiventris sp. n.,Geschwisterarten aus derplumosus - Gruppe // Revue suisse Zool. 1983. Vol.90, f.2.P.299-316.
92. Sharley D.J., Pettigrove V., ParsonsY.M. Molecular identification of Chironomus spp. (Diptera) for biomonitoring of aquatic ecosystems //Australian Journal of Entomology. 2004. -№ 43. S. 359-365.
93. Tajima F. Simple methods for testing molecular clock hypothesis // Genetics. 1993. Vol. 135. P. 599-607.
94. Takezaki N., Rzhetsky A., Nei M. Phylogenetic test of the molecular clock and linearized trees // Molecular Biology and Evolution. 2004. Vol. 12. P. 823-833.
95. Wheat C.W., Vogel H., Wittstock U., Braby M.F., Underwood D., Mitchell-Olds T. The genetic basis of a plant-insect coevolutionary key innovation // PNAS. 2007. Vol. 104, № 51. Р. 20427-20431.
96. Wilson R.J., Goodman J.L., Strelets V.B. FlyBase: integration and improvements to query tools // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36. P. 588-593.
97. White M.J.D. Modes of speciation. San Francisco: Freeman, 1978. 455 p.
98. Wuelker W. Basic patterns in the chromosome evolution of the genus Chironomus (Diptera) // Z. zool. Syst. Evolut.-forsch. 1980. Bd.18, H. 2. S. 112123.
99. Wuelker W., Klötzli A.M. Revision der Gattung Chironomus Meig. IV. Arten des lacunarius- (commuttatus-) Komplexes // Arch. Hydrobiol. 1973. Vol. 72, N4. P. 474-489.
100. Zuckercandl E., Pauling L. Evolutionary divergence and convergence in proteins // In Evolving Genes and Proteins. 1965. Vol. 7. P. 97-165.
101. Zuckerkandl E., Pauling L. Evolutionary divergence and convergence in proteinsin // Evolving Genes and Proteins, edited by V. Bryson and H.J. Vogel. Academic Press, New York, 1965. Р. 97-166.
