CC BY
8УДК 633.1:631.526.32:632.754
ЦИТОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ СОРТОВ ПШЕНИЦЫ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ВРЕДНОЙ ЧЕРЕПАШКИ
Л.И. Нефедова, А.В. Капусткина
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Представлены результаты исследования цитофизиологической реактивности разных сортов пшеницы на воздействие вредной черепашки. В качестве цитофизиологического маркера потенциальной (скрытой) вредоносности клопов предложены показатели, характеризующие относительную долю распределения клеток, находящихся в интерфазе и на разных фазах митоза в клетках меристемы зародышевых органов проростков. Опосредованные сложные взаимодействия между вредной черепашкой и пшеницей на тканевом уровне могут приводить к существенным отклонениям морфофизиологического состояния растений, и в дальнейшем сказываться на изменении посевных качеств зерна и потенциальной продуктивности растений.
Ключевые слова: пшеница, зерновка, меристема зародыша, гидролазы вредной черепашки, митотиче-ский цикл, цитофизиологическая реактивность.
Вредная черепашка большую часть онтогенеза связана с кормовыми растениями и относится к группе насекомых, у которых пищеварительные процессы проходят не только в полости кишечника, но за его пределами и частично осуществляются внекишечно непосредственно пищеварительными ферментами слюнных желез. Множественность ферментов, выявленных в слюнных железах, служит доказательством комплексного воздействия клопов на растительные ткани, что имеет принципиальное значение в понимании характера их вредоносности (Вилкова, 1980; Павлюшин и др., 2013). Эта особенность ферментных ансамблей находится в соответствии как со спецификой биохимического состава растительных тканей, большой удельный вес в которых составляют углеводы, так и со спецификой метаболизма фитофагов, как организмов высоко требовательных к энергетическому обеспечению в связи с высокой локомоторной подвижностью и плодовитостью.
Реактивность - одна из основных форм связи и взаимодействия организма с внешней средой как единой системы; реактивность растений - это способность определенным образом реагировать на воздействие различного рода стрессовых факторов, в частности вредителей. Характер воздействия этих факторов служит пусковым механизмом в тканевых преобразованиях, имеющим в большинстве случаев компенсаторно-приспо-собительный смысл. Под реактивностью тканей с гистоге-
нетических позиций следует понимать изменение закономерностей пролиферации, диф-ференцировки, интеграции клеток, межклеточных взаимодействий, процессов гистогенеза, происходящих под воздействием внешних факторов в ответ на повреждение. Установлено, что наиболее реактивными тканями у растений являются меристема, паренхима, клетки эпидермы и трихом, обладающие проспективной потенцией. При самых разнообразных воздействиях меристема реагирует, прежде всего, понижением или повышением степени пролиферации клеток. В связи с этим изучение реактивности зародышевых тканей у разных сортов пшеницы при воздействии вредной черепашки имеет важное иммунологическое значение в выявлении механизмов и их маркеров на клеточном уровне, определяющих ее потенциальную вредоносность.
Следует сказать, что изучение реактивности тканей зародыша на воздействие вредной черепашки - это проявление опосредованного действия пищеварительных ферментов вредителя, сохранившихся в зрелой зерновке.
Детальный анализ нарушений, происходящих в зрелых зерновках пшеницы при их повреждении вредной черепашкой, показал, что вредоносность клопов затрагивает глубинные процессы формирования не только эндосперма, но и органов зародыша (Капусткина, 2009; Павлюшин и др., 2013.)
Исходя из этого основной задачей наших исследований было изучение характера цито-
физиологической реактивности тканей зародыша зерновок разных сортов пшеницы на воздействие вредной черепашки с целью выявления особенностей проявления ее скрытой вредоносности на клеточном и тканевом уровнях, которые в дальнейшем определяют формирование уклонений от нормы, распространяющихся на органный и организменный уровни растений.
Клеточный цикл представляет собой совокупность последовательных и взаимосвязанных процессов в период подготовки клетки к делению (интерфаза) и период ее деления (митоз). Интерфаза подразделяется на 3 периода: пресинтетический (в1), синтетический (8) и постсинтетический (в2). В пресинтетический и синтетический периоды в клетке усиленно происходит синтез РНК, белков и активных ферментов, участвующих в синтезе ДНК, и удвоение ДНК хромосом. Постсинтетический период завершается подготовкой к митозу: накапливается АТФ, синтезируются белки аппарата клеточного деления, масса клетки увеличивается вдвое по сравнению с первоначальной. Подготовительные процессы к митозу протекают как параллельно, так и последовательно по принципу "параллельных путей" (Мэзия, 1963).
Методика
Анализ митотического режима клеток меристемы зародышевых корней при различной степени поврежденности зерновок вредной черепашкой был проведен на 7 сортах пшеницы, репродуцированных в Краснодарском крае, Ростовской и Саратовской областях. Отбор проб для анализа поврежденности зерна клопами (5 проб по 100 зерновок в каждой) производился в соответствии с ГОСТ 13586.4-83 "Зерно. Методы определения зараженности и поврежденности вредителями". Диагностику и определение степени поврежденности зерновок проводили по 5-балльной шкале, разработанной в лаборатории энтомологии и иммунитета растении к вредителям ВИЗР (Вилкова и др., 1976). Для проведения исследований по каждому сорту было выделено 3 фракции зерновок: 1- зерновки, не имеющие повреждений клопами (контроль); 2- зерновки, поврежденные по 1-2 баллам; 3- зерновки, поврежденные по 3-4 баллам. В каждой фракции содержалось 100 зерновок (2 повторности по 50 зерновок). Проращивание зерновок проводили в термостате ТПС-3 при 20°С. Зародышевые корни длиной 5 -10 мм одновременно фиксировали в измененном Карнуа (спирт этиловый - ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1). После фиксации материал отмывали 70% этиловым спиртом и оставляли для хране-
Вестник защиты растений, 2, 2014 В ходе митоза условно выделяют два контрольных периода: 1 - от начала профазы до анафазы; 2 - от анафазы до телофазы. Каждый из периодов начинается с прохождения контрольной точки. Точки контроля клеточного цикла представляют собой механизмы, предохраняющие клетку от летальных митозов. Первая контрольная точка - это переход из постсинтетического периода интерфазы в митоз. Для преодоления этой точки главным условием является завершенная репликация ДНК. В этот период старт митотического деления может быть блокирован при повреждении или неоконченной репликации ДНК. Вторая контрольная точка служит разделительным барьером на границе метафаза - анафаза. При этом критическим показателем является состояние веретена деления - вступление в анафазу блокируется в случае нарушения его целостности.
Поскольку вредитель предъявляет высокие требования к энергетическому обеспечению и обладает множественностью ферментов гидролиза субстрата, которые, присутствуя в поврежденной зерновке, являются важными факторами для раскрытия причинно -следственных связей во взаимодействиях вредной черепашки с кормовыми растениями.
исследований
ния в спирте той же концентрации. Препараты окрашивали 5% раствором ацетокармина (55 мл дистиллированной воды, 45 мл ледяной уксусной кислоты, 5 г кармина), приготовленного на водяной бане. Изготовление (10-15 препаратов по каждому варианту опыта) и их анализ (10 полей зрения на каждом препарате) проводили под микроскопом Carl Zeiss Jena при увеличении 40х1.5х10 (Фурст, 1979; Паушева, 1988). Описание патологических митозов проводили согласно работам И.А.Алова (1965); Н.Н.Ильинских и др. (2003), О.С.Машкиной и др. (2009). Всего было проанализировано более 80 тыс. клеток меристемы зародышевых корней. Продолжительность и сопряженность периодов митотического цикла в меристеме зародыша разных сортов пшеницы определяли в соответствии с общепринятым цитогенетическом показателем - относительной частотой (долей) распределения клеток, находящихся в интерфазе (И) и на разных фазах митоза (М).
Степень достоверности различий между вариантами определяли через сравнение пределов, в которых лежит их среднеарифметическое значение. Нормированное отклонение разности (td) оценивали в сравнении со стандартной величиной отклонений (по Стьюденту) при доверительной вероятности 0.05 и 0.001.
Результаты
Для сравнительного анализа продолжительности и сопряженности прохождения периодов митотического цикла в клетках меристемы зародышевых корней по соотношению доли клеток, находящихся в интерфазе (И) и на разных фазах митоза (М), выраженному в относительных единицах, исследуемые сорта в контрольных вариантах были разделены на 3 группы (рис.). 1 группа - Юка, Краснодарская 38 - сорта, характеризующиеся относительно короткой интерфазой, с показателем соотношения интерфазы к митозу И:М = 1.2-1.5; 2 группа - Августа, Сила, Коллега - со средней интерфазой И:М = 2.3-2.5; 3 группа - Саратовская 55, Джангаль с относительно длинной
т
1 2 1 2 1 2 3 4 5 3 4 5 3 4 5 6 7 6 7 6 7 Кон- 1-2 3-4 Кон- 1-2 3-4 Кон- 1-2 3-4 троль балла троль балла троль балла
I группа II группа III группа интерфазой И:М = 5-7.5.
Рис. Показатель соотношения интерфазы к митозу (И:М) в клетках меристемы зародыша у групп сортов пшеницы при повреждении вредной черепашкой
1- Юка, 2- Краснодарская 38, 3- Августа, 4- Сила, 5- Коллега, 6- Саратовская 55, 7- Джангаль
Выявлено, что у сортов 2 группы наблюдается снижение доли клеток в интерфазе, которое в зависимости от степени поврежденности зерновок клопами составляет у сорта Августа от 5.0 до 5.5%, сорта Сила - от 5.6 до 6.7% и сорта Коллега - от 8.6 до 9.4%. У сорта Юка, характеризующегося относительно короткой интерфазой (И:М=1.5), значения этого показателя при повреждении зерновок по 1 -2 баллам не отличаются от контроля; при повреждении зерновок по 3-4 баллам происходит незначительное снижение (на 3.5%) доли клеток в интерфазе. Сорт Краснодарская 38, также отно-
исследовании
сящийся к 1 группе, наоборот, характеризуется увеличением (на 13.4% по отношению к контролю) доли клеток в интерфазе у зерновок, поврежденных как по 1 -2 баллам, так и по 3-4 баллам.
Наиболее сильные изменения в сопряженности и продолжительности периодов мито-тического цикла отмечены у сортов 3 группы, характеризующихся длинной интерфазой (И:М= 5-7.5). Так, у сорта Саратовская 55 в меристеме зародышевых корней поврежденных зерновок в 1.2-1.4 раза снижается доля клеток, вступающих в митоз, по отношению к контролю. У сорта Джангаль в варианте с по-врежденностью зерновок по 1 -2 баллам отмечено снижение этого показателя в 1.3 раза, а в варианте с поврежденностью зерновок по 3-4 баллам происходит увеличение в 1.2 раза доли клеток, вступающих в митоз, по отношению к контролю.
На наш взгляд, старт митотического деления клеток меристемы зародыша при воздействии пищеварительных ферментов клопов может быть блокирован проявлением гипоре-активности вступления клеток в митоз в результате изменения его регуляторных функций, определяющих интенсивность пролиферации клеток. Проявление митодепрессии наиболее характерно для сортов Саратовская 55 и Джангаль.
Таким образом, наблюдаемые изменения в продолжительности и сопряженности периодов интерфазы и митоза, проявляющиеся в различной реактивности клеток меристемы зародыша на воздействие вредной черепашки, определяются морфофизиологическими особенностями сорта пшеницы.
К критическим фазам клеточного цикла, в которых может происходить их временная остановка, относят переход клетки к собственно митозу. Анализ частоты встречаемости клеток, находящихся в различных фазах митоза, показал, что при поврежденности зерновок вредной черепашкой (как по 1-2, так и по 3-4 баллам) у сортов пшеницы с относительно короткой интерфазой - Юка, Краснодарская 38 и сорта Сила со средней продолжительностью интерфазы наблюдается снижение доли клеток в профазе от 2.9 до 10.7% и рост доли клеток, находящихся в анафазе и
7
6
5
4
телофазе, от 2.5 до 16.9% по отношению к контролю (табл.).
Таблица. Частота распределения клеток меристемы зародышевых корней в различные фазы митоза при повреждении зерновок пшеницы вред_ной черепашкой_
Сорта Вариант Профаза Мета-фаза Анафа-за+тело-фаза
Юка контроль 1-2 балл 2-4 балл 71.1 61.0** 61.4** 13.5 9.7** 12.5 15.4 32.3** 26.1**
Краснодарская 38 контроль 1-2 балл 3-4 балл 89.0 79.8** 78.3** 2.5 6.3** 7.2** 8.5 13.9** 14 5**
Августа контроль 1-2 балл 3-4 балл 70.0 78.5** 72.6** 8.0 6.0** 7.8** 12.0 15.5** 19.6**
Сила контроль 1-2 балл 3-4 балл 83.2 73.9** 80.3** 4.6 5.2** 4.0 12.2 20.9* 14.7*
Коллега контроль 1-2 балл 3-4 балл 80.2 85.**6 86.**5 8.7 6.5** 5.4** 11.1 7 9** 8.1**
Саратовская 55 контроль 1-2 балл 3-4 балл 72.2 76.**8 85**7 15.0 9.9** 7.5** 12.8 13.3* 6.8*
Джангаль контроль 1-2 балл 3-4 балл 80.4 77 5** 97.3** 11.3 9.8** 7.5** 8.3 12.7* 1 4**
tst= 3.29, р = 0.001 (по Стьюденту). *p= 0.05, p= 0.001.
У сорта Коллега отмечается рост доли клеток в профазе по отношению к контролю от 5.4 до 6.3% и снижение доли клеток в метафа-зе от 2.2 до 3.3% по отношению к контролю, анафазе и телофазе от 3.0 до 3.2% соответственно.
Сорта с длинной интерфазой - Саратовская 55 и Джангаль отличаются ростом доли клеток в профазе от 4.6 до 16.9%, снижением доли клеток в метафазе от 1.5 до 5.1%; при повреждении зерновок по 1-2 баллам происходит увеличение доли клеток от 0.5 до 4.4%; а при повреждении зерновок по 3-4 баллам - снижением доли клеток в анафазе и телофазе от 6.0 до 6.9% по сравнению с контролем.
Изменение продолжительности и сопряженности прохождения клетками профазы митоза может быть связано с активацией системы проверки целостности генетического материала действием механизмов checkpoint (Епифанова, 2003; Омельянчук и др., 2004;
Вестник защиты растений, 2, 2014 Машкина и др., 2009). Известно, что продукты checkpoint-генов считывают целостность ДНК и способствуют задержке клеточного цикла в случае обнаружения повреждений. Это позволяет рассматривать происходящие в период профазы изменения как синтаксические реакции механизма адаптации на воздействие вредной черепашки. Временная задержка клеток в профазе отмечена для сортов Августа, Коллега, Саратовская 55 и Джангаль, которая в большей мере может иметь репарационную направленность в виде проявления защитно-восстановительных реакций генотипа.
Переход клетки от метафазы к анафазе также сопровождается проверкой целостности генетического материала системой anaphase-checkpoint. В этой контрольной точке осуществляется проверка правильности сборки аппарата деления клетки, в том числе веретена и прикрепления к нему хромосом, состояние кинетохоров, что обеспечивает правильную агрегацию хромосом. Аппарат клеточного деления обеспечивает движение хромосом, связывание между собой сестринских хрома-тид, регуляцию и их последующее разделение в анафазе митоза.
При обнаружении слабых эффектов (ошибок) циклин-киназного комплекса включается система ликвидации повреждений ДНК и восстановление ее исходной структуры. Если повреждения ДНК значительны и их исправления не происходит, клетка самоуничтожается с помощью апоптоза, либо вступает далее в аберрантное деление. Вступление в анафазу блокируется в случае дефектов аппарата деления клетки.
События, происходящие в клетках меристемы зародыша под воздействием пищеварительных ферментов вредной черепашки, на границе "метафаза-анафаза", могут отражать блокировку вступления клеток в телофазу. Этот факт четко проявляется у большей части исследуемых сортов пшеницы - Юка, Краснодарская 38, Августа, Сила.
Нарушение нормального течения митоза приводит к возникновению различной патологии, условно разделяющейся на два типа: функциональную и органическую. Функциональная патология отражает гипореактивность (ареактивность) вступающих в митоз клеток, вызванную снижением регуляторных реакции митоза, определяющих интенсивность проли-
Вестник защиты растений, 2, 2014 ферации клеток. Органическая патология - это повреждение структур, участвующих в мито-тическом делении (хромосомы, митотический аппарат, клеточная поверхность), а также нарушение процессов репликации ДНК, образования веретена деления, движения хромосом, нарушение цитокинеза. Среди возникающих патологических состояний выделяют 3 основные группы патологии митоза (Алов, 1965,1972), характерных не только для животных, но также и для растительных организмов: первая группа связана с нарушением хромосом; вторая - с повреждением митотиче-ского аппарата; третья группа связана с нарушением цитокинеза, внутри которой различают ранний цитокинез, берущий начало в анафазе, и его запаздывание или отсутствие.
Результаты наших исследований показывают, что повреждения зерновок вредной черепашкой также сопровождаются появлением патологических митозов, меняющих митоти-ческий режим клеток. В процессе деления клеток зародыша зерновок, поврежденных клопами, установлен спектр различных патологических отклонений от нормы. У сортов Августа, Коллега, Саратовская 55 и Джангаль в клеточной популяции меристемы зародыша поврежденных клопами зерновок по показателю увеличения доли профазных клеток были обнаружены нарушения митоза, относящиеся к первой группе патологии. Подобные
изменения при делении клеток могут происходить в процессе нарушения синтеза ДНК при редупликации хромосом и проявляться в случае возникновении стрессовых ситуаций. В некоторых случаях наблюдали фрагментацию хромосом, которая в дальнейшем приводила к образованию микроядер, не участвующих в метакинезе. Образование мостов в анафазе, наблюдаемое нами у сортов Джангаль и Августа при повреждении зерновок по 3-4 баллам, нарушает течение завершающих фаз деления и задерживает цитокинез. По причине дезорганизации клеточного аппарата может происходить задержка митоза в метафазе, которая обнаруживается по увеличению доли мета-фазных клеток. Такого рода патология наблюдалась только у сорта Краснодарская 38. Незавершенные митозы, характеризующиеся увеличением в клеточной популяции доли клеток, находящихся в анафазе и телофазе, приводят к запаздыванию или к прекращению цитокинеза и возникновению двуядерных и многоядерных клеток за счет объединения не разошедшихся наборов хромосом, то есть к эндорепродукци - увеличению содержания ДНК в клетке. Накопление клеток в анафазе и телофазе, запаздывание или отсутствие цитокинеза отмечено у большей части исследуемых сортов - Юка, Краснодарская 38, Августа, Сила, Саратовская 55 и Джан-галь.
Заключение
Поскольку вредитель предъявляет высокие требования к энергетическому обеспечению и обладает множественностью ферментов гидролиза субстрата, которые, присутствуя в поврежденной зерновке, могут включаться в метаболизм клеток меристемы зародыша, рассмотренные выше события, происходящие в митотическом цикле клетки, являются важными для раскрытия причинно-следственных связей во взаимодействиях вредной черепашки с кормовыми растениями на тканевом и ор-ганизменном уровнях.
Реактивный переход клеток к делению при воздействии пищеварительных ферментов вредной черепашки выражается, прежде всего, в понижении или повышении пролифератив-ной активности клеток меристемы зародышевых корней. Известно, что реактивные изменения клеток (угнетение митозов или вспышка митотической активности), выходящие за
пределы диапазона изменчивости параметров, характерных для нормального функционирования ткани, приводят к появлению различных типов нарушений в онтогенезе растений. Выявленные нами изменения в ходе клеточного цикла меристемы зародыша поврежденных зерновок свидетельствуют о проявлении компенсаторных возможностей и разной патологической реактивности ткани в ответ на воздействие вредной черепашки. Временная задержка клеток в профазе, как синтаксическая реакция, отмеченная у сортов Августа, Коллега, Саратовская 55 и Джангаль, в большей мере имеет репарационную направленность в виде проявления защитно-восстановительных реакций генотипа. Блокировка вступления клеток в телофазу, наблюдаемая у большинства анализируемых сортов пшеницы, вызывает подавление вступления дочерних клеток в интерфазу, что может привести к изменению
темпов динамики роста и развития проростков.
Таким образом, опосредованные сложные взаимодействия между вредной черепашкой и пшеницей на тканевом уровне могут приводить к существенным отклонениям морфофи-зиологического состояния растений, что в дальнейшем сказывается на изменении детерминантов посевных качеств семян и потенци-
Вестник защиты растений, 2, 2014 альной продуктивности формирующихся из них растений. В качестве цитофизиологического маркера, характеризующего потенциальную (скрытую) вредоносность клопов, могут служить цито-генетические показатели - относительная доля распределения клеток, находящихся в интерфазе и на разных фазах митоза в клетках меристемы зародышевых органов проростков.
Алов И.А. Патология митоза // Вестник АМН СССР, 1965, 1, с. 58-66.
Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. М.,1972, 1, Медицина, 264 с.
Вилкова Н.А. Физиологические основы теории устойчивости растений к насекомым. Автореф. докт. дисс., Л., ВИЗР, 1980, 48 с.
Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщова Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок клопами Методы исследования патологических изменений растений. Л., Колос, 1976, с. 203-209.
Епифанова ОИ. Лекции о клеточном цикле. М., КМК, 2003, 160 с.
Ильинских Н.Н., Новицкий, В.В., Ванчукова Н.Н., Ильинских И.Н. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск: Изд-во Томского ун-та, 2003, 272 с.
Капусткина А.В. Морфофизиологические особенности прорастания зерновок озимой пшеницы при их повреждении вредной черепашкой. //Вестник защиты расте-
Литература
ний, 2009, 4, с. 39-47.
Машкина О.С., Калаев В.Н., Мурая Е.С., Леликова Е.С. Цитогенетические реакции семенного потомства сосны обыкновенной на комбинированное антропогенное загрязнение в районе Новолипецкого металлургического комбината. //Экологическая генетика, 2009, 7, 3, с. 17-27.
Мэзия Д. Митоз и физиология клеточного деления. М., Изд-во Иностр. лит-ра, 1963, 426 с.
Омельянчук Л.В., Трунова С.А., Лебедева Л.И., Федорова С.А. Основные события клеточного цикла, их регуляция и организация. //Генетика, 2004, 40, 3, с. 293-300.
Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Нефедова Л.И., Фасулати С.Р. Фитосанитарная дестабилизация агроэкосистем. СПб, 2013, 183 с.
Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М., ВО "Агропромиздат", 1988, 271 с.
Фурст Г.Г. Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей. М., Наука, 1979, 153 с.
CYTOPHYSIOLOGICAL REACTIVITY OF WHEAT GRADES TO SUNN PEST (EURYGASTER
INTEGRICEPS) HARMING ACTIVITY L.I.Nefedova, A.V.Kapustkina Research data on cytophysiological reactivity of various wheat grades to the Sunn Pest harming activity are presented. As a cytophysiological marker of the potential (latent) harmfulness of bugs, the indicators are offered, characterizing relative fraction of cell distribution; the cells being in interphase and in different mitosis phases in meristem cells of sprout germinal bodies. The complex interactions between the Sunn Pest and wheat at tissue level can lead to essential deviations in morphophysiological condition of plants, that further affects change of sowing grain quality and potential plant productivity.
Keywords: wheat, caryopsis, germ meristem, albumin, Eurygaster integriceps, mitotic cycle, cy-tophysiological reactivity.
Л.И.Нефедова, к.с-х.н., vizrspb@ mail333.com А.Л.Капусткина, к.б.н., vizrspb@ mail333.com
