CC BY
28
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
СТИМУЛИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ ПРЕПАРАТА ЭМИСТИМА С ПРИ ПРОРАСТАНИИ ГОРОХА (PISUM SATIVUM L.) НА РАЗНЫХ ФАЗАХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
Рассоха Светлана Николаевна
младший научный сотрудник отдела аллелопатии Национального ботанического сада им. Н.Н. Гришко
Национальный ботанический сад им. Н.Н. Гришко НАН Украины 01014, Украина, г. Киев. ул. Тимирязевская, 1
DETERMINATION OF ACTIVITY EFFECT OF EMISTIM C ON THE DIFFERENT FASES OF GERMINATION OF SEAD OF PISUM SATIVUM L
Svetlana Rassokcha
M.M. Grishko National Botanical Gardens, National Academy of Sciences of Ukraine,
01014, Ukraine, Kyiv
АННОТАЦИЯ
В лабораторных условиях изучали чувствительность генома проростков гороха сорта Рапорт к препарату эмистиму С. На каждой из фаз деления клеточного цикла проявлялся стимулирующий эффект этого биологически активного препарата, который изображался на графиках в виде кривых доза эффект и подчинялся правилу Арндта-Шульца. Возрастание митотического индекса в корнях гороха, обработанных малыми дозами эмистима С является показателем действия препарата на геном клеток корней прорастающего семени гороха в состоянии активного клеточного деления.
ABSTRACT
It was carried out investigations genome sensitivity of peas seedlings sort Rapport to biostimulin Emistim C. All fases of cell cycles were sensitive to physiological-active substances which composed Emistim C. The action of this influence to confirm the law of Arndt-Schultz and revealed the periodical fallings and upwards of activity peaks (doza-effekt rule).
Ключевые слова: клеточный цикл, фазы деления, митотический индекс (МИ), тест-объект, эмистим С, стимуляция, доза-эффект.
Keywords: cell cycle, the fases of distribution, the mitotic index (MI), test-object, Emistim C, stimulation, doza-effect.
Введение:
Гормональная система растений влияет на все аспекты роста и развития растений. Понимание, как работает эта система, дает возможность побороть многие неблагоприятные факторы, которые ограничивают естественные циклы роста растений и генетическую экспрессию. Растительные гормоны присутствуют на разных стадиях жизненного цикла растений. Они могут быть доступны в достаточном количестве в течение всего жизненного цикла растения для максимизации генетической экспрессии. Растительные гормоны должны постоянно производиться и регулироваться клетками кончиков корней в достаточном количестве, чтобы поддерживать жизненные процессы и оптимизацию гормонального баланса.
Гормональные уровни растения изменяются в зависимости от биотических или абиотических факторов внешней среды в двух направлениях:
Превышающие факторы среды (избыток)
Во-первых, сигнальная система растения, которая находится в верхней части корневой системы, контролирует изменения во внешней среде, регулирует изменения уровня гормонов во всех тканях растения;
Во-вторых, энзимы, производящие гормоны, имеют определенную температуру работы. Гормоны не могут эффективно производиться при очень высокой или очень низкой температурах (Рис.1).
Гормональный дисбаланс может вызвать любая стрессовая ситуация:
Абиотический стресс: жесткие погодные условия, высокий уровень азота, соленость, токсичность и уплотненность почв, и т.д.
Биотический стресс: заболевания, вредители, сорняки, гербициды, загрязненность почв тяжелыми металлами и т.д.
Библиографическое описание: Рассоха С.Н. Стимулирующий эффект препарата эмистима С при прорастании гороха (Pisum sativum L.) на разных фазах клеточного цикла. // Universum: Химия и биология: электрон. научн. журн. 2018. № 7(49). URL: http://7universum. com/ru/nature/archive/item/6104
Температура вода свет ветер нитраты питание (N03)
I > 320 С т т т т т т
ОПТИМАЛЬНАЯ ЗОНА РОСТА (200-320 С)
I < 200 С 4 4 I 4 I (N03) 4
температура вода свет ветер нитраты питание
Понижающие факторы среды (недостаток)
Рисунок 1. Диапазон температур, при которых оптимально производятся фитогормоны.
При стрессе обычно происходит следующее: разрушаются или изменяют свою пропускную способность мембраны; происходит увеличение повреждений окисляющих агентов; снижение необходимой нормы функции протеинов. На уровень растительных гормонов влияют также питательные вещества, как катализаторы гормонального синтеза, так и восприятия. Способность корней поглощать питательные вещества из почвы зависит от рН почвы и наличия хелатирующих агентов. Антиоксиданты снижают уровень радикалов кислорода для защиты клеточных мембран, энзимов, ДНК, снижая повреждения клеток и стресс. Комплекс полиаминов стабилизирует клеточную структуру, увеличивает доступность и эффективность питательных веществ. №НШ -технологии увеличивают количество энергосберегающего нитрата амина (ЫН2). Эта технология [14, 15] позволяет преобразовывать мочевину в аминную форму азота, ингибируя активность энзимов «уре-аза». Растение минует фазу преобразования нитратной формы азота в аминную, что позволяет растению сохранять сахар в плодах. Эта техника способствует поднятию на 50% нижнего уровня использования мочевины из-за сокращения потерь азота при вымывании и испарении; контролировать вегетативный рост при дополнительном использовании энзимами «ре-дуктазы нитратов» с преобразованием неиспользуемого 1Ж3 в используемый аминный азот ^ЫН2 . Увеличить доступность сахара в растении для роста плодов, сухого вещества, специальной тяжести, показаний Брикс. Эти процессы происходят из-за увеличения энергии фотосинтеза, доступной для производства сахара и синтеза аминокислот, что увеличивает его поток из листьев в плоды.
Учитывая эти факторы и предварительные имеющиеся данные по изучению механизма действия биологически активных веществ - регуляторов роста растений, мы на примере препарата эмистима С, изучили его действие в широком спектре концентраций разведений на разных фазах клеточного цикла на примере корешков проростков гороха.
Цель исследования:
Раннее было показано [11], что динамика изменения структурного и функционального состояний генома имеет сортовую и видовую специфику, чем может быть обусловлена необходимость разной продолжительности обработки семян для получения стимулирующего эффекта. Авторы считают [1, 2, 3, 13,
14], что важная роль в модели клеточного цикла принадлежит тому, чтобы выяснить механизм действия фитогормональных соединений и физиологически активных рострегулирующих веществ, которые являются мощным фактором увеличения продуктивности сельскохозяйственных культур. В нашей работе на примере корешков проростков гороха (сорт Рапорт) показана активность действия эмистима С на разных фазах прорастания. Известно временное распределение фаз клеточного цикла [10-12, 13, 15] по схеме, которая позволяет откалибровать проросшие семена по фазам клеточного цикла:
Сухое семя ^ в0 ^ в1 ^ 8 ^ в2 ^ Митоз
0 ч. 3-6ч. 16-19ч. 28-31ч. 33-36 ч. 38-41ч.
Методика проведения опытов:
Клетки прорастающих семян гороха высокочувствительны в период активации хроматина и максимально восприимчивы к влиянию физиологически активных веществ (Троян В.М., 1998) [7, 9]. Клетки зародышей были использованы нами для подбора эффективных концентраций ФАВ - в частности к эми-стиму С. В работе соблюдали следующие экспериментальные условия:
1. Семена замачивали в постоянном объеме воды до половины высоты семени при постоянной температуре 240 С.
2. Для равномерного прорастания отбиралась фракция однородно набухших семян через три-четыре часа после инкубации в воде.
3. Для отбора клеток в период выхода из состояния покоя использовались полностью набухшие семена без признака роста зародыша.
4. Для отбора клеток в в0-фазе использовались семена с признаками видимого роста зародыша, но до проклевывания, а для отбора клеток, вступающих в в1-фазу - семена в момент проклевывания.
5. Для получения максимального количества клеток в 8-фазе длина проклюнувшегося корешка должна быть в пределах 0,5 - 0,8 см, а в митозе -1,2 - 1,5 см.
Выполняя данные условия, можно получить определенное количество клеток с уровнем синхронности не ниже уровня живых систем клеток на протяжении пререпликативного периода и в 8-фазе цикла, что позволяет смоделировать схему проверки
№ 7 (49)
активности действия эмистима С в период фаз клеточного цикла.
В эксперименте проводили обработку в течение трех часов в растворах эмистима С в концентрациях растворов от 10-4 до 10-9 М на тех этапах прорастания гороха, которые соответствовали определенным фазам цикла в меристеме.
Для Go-фазы семена, предварительно замоченные в воде на три часа, обработали в течение трех часов последовательными концентрациями (от
10-4 до 10-9М) эмистима С, промывали водой и инкубировали в термостате 5-6 дней при температуре 240 С.
Для Gl-фазы семена гороха замачивали на 16-19 часов, затем 3 часа обрабатывали эмистимом С, промывали водой и выращивали на влажных фильтрах в течение 5-6 дней при температуре 240 С.
Для S-фазы замачивали семена на 28 часов с последующей обработкой семян эмистимом С в течение трех часов, промывали водой и оставляли на влажных фильтрах на 5-6 дней при той же температуре.
Так же поступали с семенами при митозах, но замачивали их на 38-41 час.
Учет опытных образцов гороха проводили, сравнивая с контрольными по общей массе корешков, ги-покотилей и средней массе одного корешка и одного гипокотиля. Стимуляцию вычисляли в процентах.
Нами были исследованы тип и спектр физиологической активности препарата эмистима С, которая отображалась на графиках, как неравномерная кривая спадов и подъемов активности в зависимости от разведений препарата эмистима С на проростки гороха посевного Pisum sativum L. на разных стадиях прорастания. Имея 2-3 и более подъемов активности на графиках, можно говорить о наличии доза-эффект [2, 3]: стимуляции препаратом в нескольких концентрациях. Нами были использованы методики подсчетов биотестов и митотических индексов [4, 5, 8].
Результаты исследований и обсуждение:
Готовили препараты, фиксированные и окрашенные по общепринятой методике Паушевой для подсчета митотических индексов [8]. На графическом рисунке (Рис.2) и таблицах 2, 4, отображены 5 средних вариантов времени забора корешков для цитофи-зиологического исследования. По наибольшему среднему митотическому индексу - это на 36 час фиксации, судили о наиболее удобном времени обработки семян гороха стимулятором роста эмистимом С.
Таблицы: 1, 3. Одновременно отбирали такие же варианты корней проростков гороха, необработанные стимулятором (вода) в качестве контроля. Это также 5 вариантов: 36 часов, 39 часов, 42 часа, 45 часов и 48 часов. Препараты, окрашенные ацетоорсеи-ном, просматривали в 100 полях зрения в микроскопе при увеличении10х90 для каждого корня в 4-5 биологических повторностях. Вели подсчет, как общего числа клеток в каждом поле зрения, так и числа делящихся клеток по фазам митотического цикла. Анализируя данные контроля, мы имеем распределение ми-тотических индексов по времени: 1 вариант 6,23%, 2
июль, 2018 г.
вариант 4,09%, 3 вариант 1,79%, 4 вариант 2,78%, 5 вариант 4,20%. (График не публикуется).
В опыте (обработка эмистимом С в концентрации 10-9 М): 1 вариант 7,73%, 2 вариант 6,93%, 3 вариант 4,33%, 4 вариант 3,82%, 5 вариант 3,58%. В опыте митотический индекс выше, в профазах средние значения на порядок выше, чем в контроле. Смотри Рис. 2 «Митозы» и Рис.3 «Стимуляция по правилу доза-эффект».
По результатам приведенных данных можно сделать вывод, что почасовая фиксация показала тенденцию уменьшения величин митотических индексов от длительности времени прорастания. Через больший промежуток времени уменьшалось количество клеток, находящихся в митозе [1-3, 6, 13].
Согласно данным, приведенным в статье Цыганковой В.А. и авторов [12], «Молекулярно-генетиче-ский контроль ауксиновых сигналов: передача и реализация», генная экспрессия согласуется с молеку-лярно генетическим контролем ауксиновых сигналов. А эмистим С как раз и является биологическим комплексом, состоящим из гормонов ауксинового, гибберелино-цитокининового ряда, 15 типов аминокислот, олигосахаридов, жирных кислот, микроэлементов и витаминов. Он стимулирует рост и развитие практически всех сельскохозяйственных и декоративных культур. Он получен путем микробиологического синтеза на основе продуктов жизнедеятельности грибов везикулярно-арбускулярной микоризы из растений жень-шеня и облепихи. Препарат запатентован в Институте биоорганической химии и нефтехимии (г. Киев) и нашел свое широкое применение во многих зарубежных и странах СНГ [7, 9].
В обзоре [12] предоставлены данные относительно регуляторных компонентов путей сигналов индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) в растительной клетке (мембранные белки-рецепторы, чувствительные к экзогенным сигналам ИУК, система вторичных мессенджеров (цАМФ, цГМФ, инозитолтрифосфат и диацилглицерол, цитоплазматический кальций, «сенсорный» белок кальциевых сигналов - кальмодулин), которые опосредуют передачу сигналов ИУК от рецепторов на эффекторы (ферменты), катализирующие внутриклеточный метаболизм). Приведен список недавно идентифицированных генов, детерминирующих синтез белков-участников передачи сигналов ИУК у арабидопсиса: ген АВР1, кодирующий мембранный белок - рецептор ИУК; AtCP 1 и AtCBL1 гены, кодирующие «сенсорные» белки кальция; многочисленные семейства MDR генов мембранных белков, которые включены в активный АТФ-зависимый транспорт протонов от ИУК через клеточные мембраны, PIN гены белков, контролирующих пассивный полярный интра - и интерклеточный транспорт анионов от ИУК; ARG1 и RCN1 гены белков, ответственных за передачу гравитропических сигналов и регулирующих транспорт анионных форм ИУК через мембраны специализированных гравичувствитель-ных клеток - статоцитов; VTI гены SNARE белков-транспортеров, участвующих в везикулярном ин-траклеточном транспорте ИУК и AtMRP5 гены белков-транспортеров конъюгированных форм ИУК;
ARF гены ауксин-активируемых трансфакторов, контролирующих экспрессию ранних/первичных аук-син-регулируемых Aux/IAA, SAUR, GH3 ACS генов, а также многочисленных семейств SKP1, RBX1, AT-CUL1, ASK1, ASK2, AXR1, ECR1, RCE1, ENR2p, Cdc53p, Scp1p, TIR1 генов белков (составных убик-витин-белок лигазного комплекса) и CSN генов белков (составных мульти-субъединичного белкового
регуляторного комплекса COP9 сигналосом) - компонентов убиквитин/протеосом-опосредованного пути распада Aux/IAA белков, репрессирующих передачу ауксиновых сигналов.
Рассмотрена гипотетическая модель регуляции экспрессии генов ИУК.
Таблица 1.
Зависимость митотических индексов от времени в кончиках проростков корешков гороха
Контроль
Из расчета на каждые 100 полей зрения
Время (час) Число кл-к всего в п/зр Ч.кл. в митозе Ч. кл в Профазе Ч. кл. в метафазе Ч. кл. в анафазе Ч. кл. в телофазе Митотич. Индекс (%)
36 1729 107,5 51,25 25,5 8,25 22,5 6,231
39 1526 61,5 26 17 2,5 16 4,097
42 998 21 12,5 3 0,5 5 1,797
45 1492 50,5 25 10 4 11,5 2,781
48 1365 59 43 6,67 2 7,33 4,200
Таблица 2.
Зависимость митотических индексов от времени в корешках проростков гороха
под действием эмистима С Из расчета на каждые 100 полей зрения
Время (час) Число кл. в зоне деления Ч. кл. в митозе Ч. кл. в профазе Ч. кл. в метафазе Ч. кл. в анафазе Ч. кл. в телофазе Митотич. Индекс (%)
36 1615 120 70,67 17,33 9,33 22,67 7,729
39 2158,6 118,6 47,3 37,7 6,7 27 4,850
42 1210 51,5 36,5 5 4 6 4,330
45 1261,5 50 29,5 11,5 2 7 3,816
48 1366,7 45,67 30,33 8,67 2,33 4,33 3,584
Таблица 3.
Зависимость митотических индексов от времени в кончиках корешков проростков гороха
Контроль
Время (час) Число профаз 1 Число ме-тафаз 2 Число анафаз 3 Число телофаз 4 % профаз 5 % метафаз 6 % анафаз 7 % телофаз 8 % Митотич. Индексов
36 48,419 24,159 7,352 20,070 2,95 1,504 0,46 1,315 6,231
39 44,403 26,185 3,758 25,654 1,698 1,155 0,145 1,071 4,097
42 62,820 7,693 1,282 28,205 1,075 0,247 0,041 0,435 1,797
45 67,677 15,101 4,445 12,778 1,513 0,515 0,194 0,559 2,781
48 67,113 12,682 2,993 17,12 3,33 0,543 0,164 0,500 4,200
1,2,3,4 - % делящихся клеток по фазам цикла от 5,6,7,8 - % делящихся клеток по фазам цикла от
числа делящихся клеток общего числа клеток в поле зрения
Таблица 4.
Зависимость митотических индексов от времени под действием эмистима С в кончиках корешков проростков гороха
Время (час) Кол-во профаз 1 Кол. ме-таф 2 Кол. анафаз 3 Кол-во телофаз 4 % профаз 5 % метафаз 6 % анафаз 7 % телофаз 8 % Митот. Индекс.
36 62,1 13,37 7,37 17,2 5,6 1,11 0,55 1,42 7,73
39 49,44 25,77 4,074 20,72 2,199 1,372 0,226 1,044 4,85
42 65,41 11,073 6,461 17,055 3,132 0,371 0,341 0,488 4,33
45 55,5 25,625 8,125 10,625 2,242 0,886 0,165 0,524 3,816
48 71,54 16,85 3,65 7,95 1,132 2,07 0,098 0,243 3,584
1,2,3,4 - % клеток в каждой фазе митоза от числа делящихся клеток
5,6,7,8 - % клеток в каждой фазе митоза от общего числа клеток
80,0-
70,0-
50,0-
20,0-
36 час. 39 час. 42 час. 45 час. 48 час.
■ профаза 62,1 31,2 65,4 55,5 71,5
□ метафаза 13,4 37,3 11,1 25,5 16,9
И анафаза 7,4 7,0 6,5 8,1 3,7
□ телофаза 17,2 24,6 17,1 10,6 8,0
И мит.инд 7,7 6,9 4,3 3,8 3,6
0
40,0
30,0
10.0
Рисунок 2. Влияние эмистима С на величину митотических индексов в меристеме гороха посевного на
разных фазах клеточного цикла
Заключение
Сравнивая активность эмистима С на трех фазах клеточного цикла (по МИ в G0, Gl, S) кончиков корешков проростков гороха посевного сорт Рапорт, можно сделать вывод, что наибольшей активации можно достичь, обрабатывая семена на стадии Go. (Рис. 3), где митотические индексы были на порядок выше по сравнению с контролем: 7,7 (на 36 час), 6,9 (на 39 час), 4,3 (на 42 час) и 3,8 (на 45 час), 3,6 (на 48 час), Рис. 2.
Из данных, проведенных в результате проведенных экспериментов следует, что клетки прорастающего семени гороха в период повышенной активности генома максимально чувствительны к действию физиологиче-
ски активных веществ - эмистима С. На всех фазах клеточного цикла наблюдается чувствительность к действию физиологически активных веществ, находящихся в составе эмистима С. Причем действие это подчиняется правилу Арндта-Шульца (Arndt-Schultz), и выражается в периодических спадах и подъемах пиков активности (от 1 до 3 и более). Согласно этому правилу кривая доза-эффект имеет один максимум, но Попов, Иванова [4, 10] установили, что кривая имеет два и более максимумов, в ее ходе наблюдаются повторяемость форм в начальном, среднем и конечном интервалах, что дает возможность построить обобщенный график волнообразной кривой доза-эффект, где средний интервал
соответствует максимуму кривой Арндта-Шульца и характеризуется несколькими (чаще всего двумя) максимумами и одним минимумом. Его обозначают как интервал насыщения. Конечный интервал характеризу-
ется преобладанием торможения. Эти авторы указывают на то, что стимулирующий эффект не бывает стабильной, неизменной величиной, а зависит от реакции организма (главная волна) и от условий среды (второстепенные волны) [4, 7, 9, 10].
Рисунок 3. Влияние препарата эмистима С на стимуляцию роста проростков гороха посевного (корней и
стеблей) в фазе Go.
Список литературы:
1. Борейко В.К., Калинин Ф.Л., Троян В.М. Торможение биосинтеза рибонуклеиновых кислот на протяжении пререпликативного периода клеточного цикла гидразидом малеиновой кислоты // Физиология и биохимия культурных растений. - 1979. - 11, № 2. - С.153-157.
2. Григорюк 1.П., Нижник Т.П., Курчий Б.О. Регулящя вмюту абсцизово1 та емютимом С у посушливих умовах // Фiзiологiя та бiохiмiя культурних рослин. - 2001. - 33, № 3. - С. 241-244.
3. Гродзинский Д.М., Белецкая Е.К., Хилько Т.Д., Кравцова Л.И. О чувствительности клеточной популяции апикальной меристемы стебля озимой пшеницы к воздействию низких температур // Физиология и биохимия культурных растений. - 1981. - 13, № 3. - С. 269-273.
4. Иванова И.А. Зависимость между реакцией и дозой у растительных организмов // Тезисы докладов международного симпозиума по стимуляции растений. - София. - 1966. - С. 11-12.
5. Кулаева О.Н. Определение кинетиновой активности с помощью биотестов. Методы определения регуляторов роста и гербицидов: Сб. научных трудов. - Москва: Наука, 1966. - С.120-135.
6. Му^ка В.К., Григорюк Т.1. Вивчення фiзiологiчноï активносп рiзних партш регулятору росту емютиму // Фiзiологiя та бiохiмiя культурних рослин. - 2001. - 33, № 1. - С. 3-9.
7. Опис до патенту на винахщ. Споаб одержання регулятору роста рослин. Пономареноко С.П., Боровшова Г.С., Блiзнюк С.Т., 1зжеурова В.В. АТ Високий врожай. - 1993.
8. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.
9. Пономаренко С.П. Регуляторы роста растений. Киев. - 2003. - 319 с.
10. Стимуляция растений. Доклады Международного симпозиума по стимуляции растений. - 1966: София, 2530 октября 1966 г. - 127 с.
11. Троян В.М. Клггинний цикл рослин та його регулящя. - Кшв: Наукова думка. - 1998. - 171 С.
12. V.A. Tsygankova, L.A. Galkina, L.I. Musatenko, K.M. Sytnik. 2007. Molecular-genetic control of auxin signals: transmission and realisation. //Botany and Mycology: modern horizons/Collection of papers devoted to the 80 anniversary of A.M. Grodzinky (1926-1988), Academician of Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv Academperiodica, 2007. - p.189-231.
13. Quastler H. The analysis of cell population kineticks // Cell proliferation. Oxford, Blackwell. - 1963. - P. 18.
14. Stollerukraine.com - Биофордж (Bio-Forge): Уникальные свойства и преимущества использования. Stol-ler.USA/ Unleashing the Power of Plants.
