CC BY
147
28
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
УДК 575:576.35 + 582.573.16
ДЕЙСТВИЕ гидрофильных компонентов КУКОЛОК КИТАЙСКОГО ДУБОВОГО ШЕЛКОПРЯДА НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ТЕСТ-ОБЪЕКТА ALLIUM CEPA L.
И. И. Концевая
кандидат биологических наук, доцент,
доцент кафедры ботаники и физиологии растений УО «ГГУ им. Ф. Скорины» Е. А. Карпова
студентка биологического факультета УО «ГГУ им. Ф. Скорины»
Статья посвящена изучению влияния водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на Allium cepa L. Представлены результаты влияния определенных концентраций водного экстракта на цитогенетические параметры в клетках корневых меристем A. cepa L.: длительность фаз митоза, патология митоза, уровень и спектр патологий митоза, частота встречаемости клеток с микроядрами.
Установлено, что наиболее оптимальными концентрациями ВЭКШ, действующими на исследуемые цитогенетические параметры, являются 10,0 мл, 0,001 мл и 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды. Минимальная исследуемая концентрация ВЭКШ была наиболее близка к физиологическим условиям по основным цитогенетическим параметрам: длительность фаз митоза, патология митоза, спектр патологий митоза.
Введение
Среди источников биологически активных веществ, используемых в растениеводстве, до настоящего времени не применяли препараты из гемолимфы куколок китайского дубового шелкопряда, хотя по химическому составу гемолимфа может быть использована для получения высокоэффективных стимуляторов роста. Ранее было обнаружено ингибирующее действие водного экстракта куколок шелкопряда (ВЭКШ) на образование in vivo активных форм кислорода и галогенов в нейтрофилах, что свидетельствует о его антиоксидантном действии [1]. Выявлен состав гемолимфы и водного экстракта куколок шелкопряда, содержащий комплекс аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов, который оптимален для функционирования эукариотических клеток. Установлено общее количество свободных аминокислот в жидком содержимом куколок дубового шелкопряда, которое составляет 14-16 г/л; в том числе обнаружены следующие незаменимые аминокислоты (М ± m, ммоль/л): треонин (10,28 ± 0,272), гистидин (10,26 ± 0,367), лизин (8,66 ± 0,586), валин (8,16 ± 0,193), лейцин (4,76 ± 0,133), изолейцин (4,34 ± 0,145), фенилаланин (1,04 ± 0,070), метионин (0,67 ± 0,083).
Однако следует принять во внимание, что антиоксиданты, в зависимости от концентрации и других факторов, могут проявлять либо антиоксидантное действие, либо прооксидантное, либо вообще не проявлять какого-либо эффекта на интенсивность накопления активных форм кислорода и скорость реакций свободнорадикального окисления и тем самым на общее состояние организма и его адаптивность. Поэтому актуальным является всестороннее изучение влияния гидрофильных компонентов куколок китайского дубового шелкопряда на растения.
Целью представленной работы являлось изучение влияния различных концентраций водного экстракта куколок китайского дубового шелкопряда на цитогенетические параметры в клетках корневых меристем Allium cepa L.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Выявить стадии митоза, на которых происходит митотический блок.
2. Изучить направление и степень эффекта различных концентраций ВЭКШ на прохождение клеточного цикла.
3. Оценить чувствительность корней Allium cepa L. к воздействию ВЭКШ на примере цитогенетических показателей (уровень и спектр патологий митоза, доля клеток на переходе профаза-телофаза, доля микроядер).
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
29
Материалы и методы исследования. Биотестирование различных концентраций ВЭКШ выполняли с помощью Allium-теста [2].
Перед началом эксперимента луковицы A. cepa выдерживали при 40 С для активизации и синхронизации процесса прорастания на протяжении двух недель [3]. В эксперименте на каждый вариант использовали в трех повторностях по 12 репчатых луковиц сорта «Штуттгартен», диаметром 2,0-2,5 см. Предварительно у луковиц удалили внешние чешуи и коричневую нижнюю пластинку, а затем поместили в 20-мл пробирки, наполненные дистиллированной водой. Проращивание луковиц проводили при комнатной температуре 20-250 С при естественном освещении. Через 48 часов отобрали на каждую повторность по 10 наиболее развитых луковиц и поместили их на 24 часа в тестируемые растворы ВЭКШ.
Для приготовления маточного водного раствора экстракта и последующих разведений использовали дистиллированную воду. Маточный водный раствор экстракта куколок китайского дубового шелкопряда получали в соответствии с авторским свидетельством СССР № 1787439А1 (В. А. Трокоз, Т. Д. Лотош, А. Б. Абрамова и др.). Нормирование исходного ВЭКШ проводили по сумме свободных аминокислот путем разведения до концентрации 550 мг/л. Такой экстракт использовали для приготовления 6 вариантов разведений экстракта (указано количество экстракта в мл на 100 мл воды и рассчитаны концентрации свободных аминокислот в разведении): o1 - 10 мл (5,5 мг); о2 - 1 мл (0,55 мг); о3 - 0,1 мл (55 мкг); о4 - 0,01 мл (5,5 мкг); о5 - 0,001 мл (0,55 мкг); о6 - 0,0001 мл (0,055 мкг). В качестве основного контроля использовали дистиллированную воду (к1), и дополнительного контроля - водопроводную воду (к2). Выбор дистиллированной воды обоснован в работе [4].
Воду и растворы для обеспечения аэрации меняли каждые 24 часа. Через 72 часа культивирования (от начала проращивания) выполняли фиксацию корешков в растворе Карнуа в течение 24 часов в холодильнике с 8 до 9 часов [5]. Для фиксации отрезали от каждой из 10 луковиц кончики корешков длиной не более 1,0 см (игнорируя самые длинные и самые короткие корешки). Хранили материал в холодильнике до приготовления препаратов. Давленые препараты для цитогенетического анализа, окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [6].
Анализировали по 10-30 проростков в варианте. В каждом препарате учитывали все клетки на стадиях интерфазы, профазы, метафазы, анафазы и телофазы. Для выявления стадии митоза, на которой происходит митотический блок, подсчитывали относительную продолжительность фаз митоза. Возможность ингибирующего либо стимулирующего эффектов ВЭКШ оценивали с использованием метафазного и ана-телофазного метода учета перестроек хромосом в клетках корневых меристем лука. Патологию митоза (ПМ) подсчитывали как отношение числа клеток с нарушениями митоза к общему числу делящихся клеток [7] и классифицировали отдельно для каждого корешка по И. А. Алову с незначительной модификацией [8]. Наряду с аберрациями (мостами и фрагментами), учитывали прочие цитогенетические нарушения, не связанные с повреждениями хромосом: отставание хромосом в метафазе или при расхождении к полюсам делящихся клеток, их слипание, асимметричное расположение веретена деления. Для получения более точной оценки по критерию «патология митоза» вычисляли их частоту без учета профаз. Также подсчитывали число клеток с микроядрами, отмечая их количество в клетке и размеры. Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе Leica Gallen III (Германия) при увеличении 600. По каждому варианту было просмотрено более 20 000 клеток.
Статистическую обработку результатов выполняли с использованием программ Microsoft Excel. Для сравнения выборок по митотической активности, доли клеток на стадиях митоза и по патологиям митоза использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ данных микроскопического исследования выявил, что при всех тестируемых концентрациях ВЭКШ встречаются видимые изменения в размерах и морфологии меристематических клеток лука. При воздействии на корешки экстракта определяли единичные клетки большого размера и до 1% интерфазных фрагментированных клеток. Последние были представлены в виде клеток, не содержащих генетический материал, т. е. это какая-то часть цитоплазмы в межклеточном пространстве, либо это отдельные компоненты цитоплазмы с обособленной частью материала ДНК. Можно предположить, что под влиянием ВЭКШ, в частности
30
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
растворенных в воде незаменимых аминокислот, активируется перестройка регуляторных и метаболических путей белков и нуклеиновых кислот в меристематических клетках.
По-нашему мнению, химические соединения фрагментов клеток могут включаться в различные метаболические пути и тем самым выполнять позитивную роль, но фрагменты могут по причине механического действия подавлять на короткий или более длинный период процесс деления и/или отдельные стадии митоза близлежащих клеток.
Длительность фаз. Расчет различных типов митотического индекса и определение долей делящихся клеток необходимы для регистрации времени прохождения клетками различных стадий митоза, в том числе выявления возможной задержки клеток на какой-либо стадии вследствие повреждения собственных структур под действием внешних или внутренних факторов любой природы.
Известно, что продолжительность разных стадий митоза в физиологических условиях неодинакова. Наиболее продолжительны стадии, связанные с процессами синтеза: профаза и телофаза. Стадии митоза, во время которых происходит движение хромосом, обычно осуществляются быстро. При сопоставлении прохождения фаз митоза в текущем эксперименте установлено, что наиболее близки к оптимальным условиям роста для меристематических клеток корней водные растворы, используемые в контроле 2 и вариантах опыта о5 и о6 (рисунок 1). Применение дистиллированной воды в контроле 1 изменяет темп прохождения клетками профазы в сторону ее сокращения, а метафазы - в сторону удлинения в сравнении с общепринятой нормой.
о
ф
5
К
§
ч
100%
80%
60%
40%
20%
0%
к1 к2 о1 о2 о3 о4 о5 об
И телофаза ■ анафаза S метафаза □ профаза
варианты опыта
Рисунок 1 - Относительная продолжительность фаз митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ
В зависимости от того, на какие синтетические процессы клеточного цикла влияют разные концентрации экстракта, происходит остановка клеточного деления на определенной стадии митоза (рисунок 1). Так, по сравнению с контролем 2 концентрации экстракта в вариантах опыта о1, о2, о3, о4 вызывали митотический блок на стадии метафазы, и концентрации экстракта в вариантах опыта о1, о2, о4, о5, о6 - на стадии телофазы.
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
31
Патология митоза. Поскольку многие соединения, индуцирующие или ингибирующие митотическую активность, часто способствуют возникновению мутаций в анализируемых тест-системах, мы исследовали способность ВЭКШ в различных концентрациях стимулировать или подавлять протекание патологических процессов в клетках корневой меристемы лука.
Установлено, что все тестируемые концентрации ВЭКШ не вызывают достоверное повышение показателя ПМ по сравнению с контролем 1. Причем, определение корреляционных отношений между ПМ с учетом профазы и ПМ без учета профазы выявило высокое положительное значение, равное 0,97. В сравнении с контролем 2 процент клеток с регистрируемой патологией митоза не изменяется в вариантах опыта о1, о2, о5, о6 и возрастает с 1,9 ± 0,33 до 5,1 ± 0,51-6,3 ± 0,82% в вариантах о3, о4 (рисунок 2), что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования: 2-5% [9].
Данные, представленные на рисунке 2, свидетельствуют о том, что ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного влияния на значения ПМ. Низкое число ПМ в опытных вариантах позволяет предположить проявление высокой адаптивности у исследуемого объекта, возможно, в результате действия ВЭКШ.
8 -|
варианты
Е2 % ПМ с учетом профазы н % ПМ без учета профазы
Рисунок 2 - Патология митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ
Уровень и спектр патологий митоза. Спектр ПМ включал такие типы патологий, как асимметричное расположение веретена деления, забегание и отставание хромосом в анафазе митоза, обособление единичных хромосом и группы хромосом в метафазе, мосты в анафазе и телофазе, то есть наиболее общие типы митотических нарушений. Выявлено, что в результате действия ВЭКШ при большинстве тестируемых концентраций сужается спектр различных патологий митоза по сравнению с контрольными вариантами в меристематических клетках корешков лука. Тот факт, что исходный опытный материал в контроле 1 и в контроле 2 характеризуется определенным спектром патологий митоза и показывает достаточно высокий уровень по каждому регистрируемому типу, свидетельствует об особенностях партии луковиц, которую использовали в опыте (таблица).
32
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Таблица - Уровень и спектр патологий митоза в корневой меристеме Allium cepa под действием ВЭКШ
Варианты опыта Асимметричное расположение веретена деления Отставание и забегание хромосом в анафазе, обособление хромосом Мосты Фрагментация хромосом Микроядра
к1 39,3 ± 4,02 52,0 ± 5,13 5,9 ± 0,41 2,8 ± 0,71 0,02 ± 0,008
к2 39,8 ± 4,12 44,3 ± 4,12* 6,8 ± 0,73 9,1 ± 0,83** 0
о1 35,0 ± 4,21 65,0 ± 7,11* 0 0 0
о2 37,8 ± 4,01 62,2 ± 5,61* 0 0 0,03 ± 0,009*
о3 40,0 ± 4,23 57,4 ± 5,03 2,6 ± 0,42* 2,0 ± 0,40 0,01 ± 0,001*
о4 22,3 ± 2,12** 77,7 ± 8,67** 0 0 0,01 ± 0,001*
о5 25,0 ± 2,01* 68,8 ± 5,93** 2,1 ± 0,31* 4,1 ± 0,41 0,03 ± 0,009*
о6 28,6 ± 2,51* 71,4 ± 6,84** 0 0 0
- различия статистически значимы по сравнению с к1 (Р < 0,05); ; - различия статистически значимы по сравнению с к1 (Р < 0,01).
В данном эксперименте довольно высокую долю среди ПМ составляет асимметричное расположение митотического веретена как в контрольных, так и в опытных вариантах. В контрольных вариантах и в вариантах опыта о1, о2, о3 значения данного признака колеблются от 35,0 ± 4,21 до 40,0 ± 4,23%, в вариантах о4, о5, о6 отмечено достоверное снижение значений до 22,3 ± 2,12-28,6 ± 2,51% (Р < 0,05). Следует подчеркнуть, что деление клетки нуждается не только в событиях, которые происходят в точной временной последовательности, но и в точном их расположении в месте деления. Чтобы гарантировать, что дочерние клетки получат одинаковые наборы ДНК, место деления должно разделять пополам митотическое веретено с определенной ориентацией. Асимметричное расположение веретена деления не влияет на распределение ядерного материала ДНК, однако может привести к неравномерному распределению цитоплазматических органелл и, соответственно, ДНК митохондрий и пластид.
Выявлено, что меристематические клетки корешков лука в контрольных вариантах (1 и 2) содержат мосты, которые составляют 5,9 ± 0,41-6,8 ± 0,73% от всех патологий митоза. Действие ВЭКШ существенно снижает величину встречаемости мостов в клетках до 2,6 ± 0,42% либо 0. Хромосомные и хроматидные мосты являются обычно следствием фрагментации хромосом, что прослеживается по нашим данным (таблица). Образование мостов приводит к генотипической разнородности дочерних клеток, а также нарушает течение завершающих стадий деления и задерживает цитокинез. Тестируемые концентрации ВЭКШ, по-видимому, нивелируют негативные процессы, имеющие место при клеточном делении.
Поступление в межклеточное пространство и меристематические клетки повышенного количества комплекса аминокислот, углеводов, микроэлементов и антиоксидантов в результате использования ВЭКШ, по-видимому, замедляет метаболические процессы в связи с перестройкой, что и индуцировало увеличение числа клеток (Р < 0,05; Р < 0,01) с повреждениями в области кинетохора, у которых регистрировалось отставание и забегание хромосом в анафазе, обособление хромосом.
Образование микроядер происходит вследствие фрагментации или отставания отдельных хромосом, вокруг которых в телофазе формируется ядерная оболочка, параллельно образованию оболочки вокруг основных дочерних ядер. Новообразованные микроядра либо сохраняются в клетке в течение всего дальнейшего клеточного цикла вплоть до очередного деления, либо подвергаются пикнозу, разрушаются и выводятся из клетки.
В эксперименте обнаружено незначительное число микроядер как в контроле 1, так и в ряде вариантов опыта (от 0,01 ± 0,001% до 0,03 ± 0,009%), что, однако является тревожным моментом, поскольку их присутствие служит индикатором начала патологических процессов и нестабильности генома [9].
На основании данных таблицы следует отметить, что наиболее грубые патологии митоза (мосты, фрагментация хромосом, микроядра) не были выявлены при использовании ВЭКШ в максимальной и минимальной концентрациях, соответственно, 10 мл и 0,0001 мл ВЭКШ на 100 мл воды.
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
33
Выводы
Проведено исследование эффекта гидрофильных компонентов куколок китайского дубового шелкопряда на клетки корневой меристемы Allium cepa.
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
1. При анализе влияния различных концентраций ВЭКШ на развитие луковиц A. cepa не установлено негативных воздействий на изучаемые цитогенетические параметры (доля клеток на определенной стадии митоза, патология митоза, уровень и спектр патологий митоза, доля микроядер).
2. ВЭКШ в исследуемых концентрациях не оказывает существенного негативного воздействия на значения ПМ, которое колеблется от 2,12 до 6,25%, что фактически находится в пределах нормального значения уровня спонтанного мутирования.
3. Выявлено, что в результате действия большинства тестируемых концентраций ВЭКШ сужается спектр различных типов патологий митоза в меристематических клетках корешков лука в сравнении с контрольными вариантами.
4. На примере исследуемых цитогенетических показателей клеток корневых меристем A. сера установлены близкие к физиологическим условиям концентрации ВЭКШ, равные 10 мл, 0,001 мл и особенно 0,0001 мл исходного ВЭКШ в 100 мл воды.
Перечень принятых обозначений и сокращений ВЭКШ - водный экстракт куколок шелкопряда;
ПМ - патология митоза;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
г/л - грамм на 1 литр;
см - сантиметры;
мг/л - миллиграмм на 1 литр;
мл - миллилитры;
мкг - микрограммы;
мг - миллиграммы.
Литература
1. Антиоксидантная активность куколок китайского дубового шелкопряда (Antheraea pernyi G.-М.) / А. А. Чиркин [и др.] // Уч. записки УО «ВГУ им. П. М. Машерова» : сб. науч. ст. / М-во образования Респ. Беларусь, Витеб. гос. ун-т им. П. М. Машерова ; редкол.: А. В. Русецкий (гл. ред.) [и др.]. - 2007. - Т. 6. - С. 248-265.
2. Fiskesjo, G. The Allium test as a standard in environmental monitoring / G. Fiskesjo // Hereditas. -1985. - V. 102. - P. 99-102.
3. Гудков, И. Н. Роль асинхронности клеточных делений и гетерогенности меристемы в радиоустойчивости растений / И. Н. Гудков, Д. М. Гродзинский // Механизмы радиоустойчивости растений. - Киев, 1976. - С. 110-137.
4. Genotoxicity and cytotoxicity assay of water sampled from the underground nuclear explosion site in the north of the Perm region (Russia) / T. I. Evseeva [et al] // J. Environ. Radioactivity. - 2005. - Vol. 80. - P. 59-74.
5. Токсические и цитогенетические эффекты, индуцируемые у Alliu cepa L. низкими концентрациями Cd и 232Th / Т. И. Евсеева [и др.] // Цитология и генетика. - 2005. - № 5. - С. 73-80.
6. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р. П. Барыкина [и др.]. - М. : МГУ, 2004. - 312 с.
7. Алов, И. А. Цитофизиология и патология митоза / И. А. Алов. - М. : Медицина, 1972. - 264 с.
8. Калаев, В. Н. Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма / В. Н. Калаев, С. С. Карпова. - Воронеж : ВГУ, 2004. - 80 с.
9. Захаров, В. М. Биотест: интегральная оценка здоровья экосистем и отдельных видов / В. М. Захаров, Д. М. Кларк. - М. : Моск. отд-ние Междунар. фонда «Биотест», 1995. - 68 с.
Summary
The article is devoted to the influence of Chinese tussah moth pupae aqueous extract on Allium cepa L. Results of aqueous extract effects on the duration of the mitosis phases, the mitosis pathologies, the level and range of mitosis pathologies, the frequency of cells with micronuclei in the root meristem cells of A. cepa are presented.
It was stated that the optimal concentration of aqueous extract of Chinese tussah moth pupae acting on the studied cytogenetic parameters is 10,0 ml, 0,001 ml and 0,0001 ml of initial extract in 100 ml of water. The minimal concentration of the extract was the closest to the next physiological conditions: the duration of the phases of mitosis, the mitosis pathology, the range of mitosis pathologies.
Поступила в редакцию 26.12.12.
