CC BY
6Циркуляция вируса гепатита Е в свиноводческом хозяйстве
С.Л. Солонин1, К.К. Кюрегян1, О.В. Исаеза1, К.Н. Груздев7, М.И. Михайлов1
Институт полиомиелита и аиоусных эниефилитов им. МЛ. Чумачова РАМН, Московская область; ФГУ Федеральный центр охраны здсроввя животных, Владимир
Введение
Б настоящее время установлено, что вирусный гепатит Ь (6ГЕ) является зоонозным заболеванием, которое достаточно часто выявляется у свиней [1-3]. Антигена к ВГЕ обнаруживают у яри матов, сельскохозяйственных животных, птиц, грызунов, что свидетельствует о распространении ВГЕ среди животных [2-5]. Изучение ВГЕ в регионах, не эндемичных по ГЕ (в странах Йвропы, США, Канады, Японии), позволило выделить от свиней изоляты ВГЕ, относящиеся к 3 генотипу, сходные с изолятами ВГЕ, выделенными от человека на этих же территориях [Ь,У]. Данные результаты рассматриваются как доказательства значимости ВГЕ свиней в распространении ГЕ среди людей на неэндемичных территориях. Также описаны случаи заражения людей при употреблении в пищу сырого или недостаточно термически обработанного мяса свиней, инфицированных ВГЕ 3 и 4 генотипами [3,7-9].
Показано, «то 0,6-4% первичных доноров кроте и беременных женпдш, т.е. условно здорового населения, проживающих в неэндемичных по ГЕ регионах ГФ, обнаруживаются антитела к ВГЕ [10]. Вопрос о происхождении этих антител остается открытым и нуждаемся в дальнейшем изучении.
Для изучения роли свиней, как резервуара ВГЕ-инфекции, и анализа изол^тов ВГЕ, выдз-ленных от животных, необходимо уштывать-возраст, в котором преимущественно происходит инфицирование свинеи ВГЕ. Данные литературы о возрасте инфицирования ВГЕ и
продолжительности инспекции носят несколько противоречивый характер. Так, при экспериментальном заражении свиней показано, что выделение ВГЕ с фекалиями происходит уже на 2 неделе после инфицирования и продолжается до 4-8 недель [11]. Результаты выявления РНК ВГЕ в фекалиях при естественной ВГЕ-инфекции у свиней в разных исследованиях свидетельствуют о более широком временном диапазоне инфекции - с 8-9 недели жизни пп 22 [12,13] или со 2 недели жизни по 29 [14].
При проведении масштабных исследований по определению частоты ВГЕ среди поголовья свиней и генетического разнообразия необходимо более точно установить возраст животных, в котором распространенность естественной ВГЕ-инфекции является наибольшей.
В связи с этим целью данного пилотного исследования являлось определение интенсивности циркуляции ВГЕ среди свиней в возрасте от первой недели жизни до 1 ^ода.
Материалы и методы
Было собрано 219 образцов фекалий у поросят в возрасте о^ 0 до 52 недель со езинофермь: Владимирской области. Образцы были разделены на группы на основании возраста животных с интервалом в 30 дней (табл. 1). Из полученных образцов получали 10% осветлённые экстракты по стандартной методике. Вирусную РНК выделяли из 50 мкл осветленных фекальных экстрактов с набором для выделе.шя нук-леиноьых кислот (производство НПО «Литех») по протоколу производителя.
Возраст животных, дни Количество образцов
0-30 27
31-60 11
61- 90 23
91-120 20
121-150 38
151-180 32
Счыше 180 68
Таблица 1. Исследоваиные образцы фекалий, полученные от свиней
Для контроля потенциального ингибирова-ния выявления РНК ВГЕ в последующей обратной транскрипции - полимеразной цепней реакции (ПЦР), при выделении в каждый образец вносили в известной концентрации внутренний контроль (ВК), прецстагляющий собой синтетическую РНК. В качестве ВК использовали in vitro
синтезированную РНК, кодирующую последо-вгтедьность 5'-НТО вируса СВУ-С. ВК добавляли в образец в количестве 20 копий РНК на выделение посге внесения ;тизирующего растчора. Выявление РНК ВГЕ и ВК проводили в ОТ- ПЦР с вырожденными прайме памп к консервативному участку открогшй рамки считьт.ая 2 (ОРС21 ВГЕ и 5'-ШО СВУ-С соответственно (табл 2).
Мишени Последовательности Положение Направление
ВГЕ 5' - аау tat gem cag tac egg gtt g 3' Внешний Прямой
ВГЕ 5 - ccc tta tcc tgc tga gca ttc tc -3' Внешний Обратный
БК 5' - aat ccc ggt car ctt ggt age - 3' Внешний ПрЯпЛОЙ
ВК 5' - ccc cac tgg tcc ttg tea actc -3' Внешний Обратный
ВГЕ 5' - gty atg yty tgc ata K»t ggc t -3' Внутргнкий Прямой
ВГЕ 5' - age cga cgz aat yaa ttc tgt с -3' Внутренний Обратный
ВК 5' - a eg gtc cac agg tgt tg -3' Внутренний Прямой
ЗК 5' - gac att цаг ggg cga eg -3' Внутренний Обратный
Таблица 2. Олигонукяеотиды, используемые для детекции РНК ВГЕ и РНК ВК
Первый раунд ПЦ? проводили совмещено с ОТ, условия реакции были следующими: 42°С -1 час, затем 5 мин. - 94°С (денатурация и инактивация обратной транскриптазы), затем 35 циклов: 94°С - 30 сек, 45°С - 30 сек., 72°С - 45 сек., финальная элонгация - 72°С - 7 мин.
Условия для второго раунда ПЦР - 35 циклов: 94°С - 30 сек, 45°С - 30 сек., 72°С - 45 сек., финальная элонгация - 72°С - 7 мин. Величина получаемого фрагмента для ВГЕ составляла 350 п.о, ВК - 127 п.о. Полученные в ходе ПЦР продукты, соответствующие ВГЕ и ВК, определяли в электрофорезе 5 агарозном геле (1,5%).
Для подтверждения специфичности детекции РНК BTF и последующего филогенетического апа,шза выявленных вариантов вируса прс водили прямое секвенирование ампкифи-цированных фрагментов генома ВГЕ. Продукт ПЦР величиной 350 нт вырезали из ге_1;я и выделяли из агарозы с помощью набора QlAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Секвенирование
осущестгали с использованием набора GenomeLab Methods Development kit (Beckman Coulter) в анализаторе SEC8800 (Beckman C.oul'cr). Для определения специфичности амплификации и поиска последовательностей, отличающихся от ВГЕ, проводили поиск BLAST в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information). Выравнивание последовательностей ВГЕ выполняли с помощью программы BioEdit, филогенетическое древо было построено по алгоритму neighbor-joining (NT) при помощи программы Clustal X.
Результаты
Пртшенение внутреннего контроля при детекции РНК ВГЕ в образцах фекальных экстрактов, полученных о г свиней, показало от сутствие случаев ишибирования при использовании выбоанного протокола. Пример Электрофоре! раммы с результатами выяснения РНК ВГЕ и РНК ВК приведен на рисунке 1. Из 214 образцов фекалий, полученных от евчнеи до года жизни, РНК ВГЕ была выяотена в 34
27
года жизни, РНК ВГЕ была выявлена в 34 (15,5%) из них. Распределение положительных случаев в зависимости от возраста жиьотпых показано на рисунке 2. Выделение ВГЕ с фекалиями отмэчали у поросят, начиная с 4-5 недели, в 2 образцах из 11 (18%). у поросят 8-12-ти
недель вирусная РНК ВГЕ была обнаружена в 16 из 23 образцов (69,5%), 13-17-ти недель - в 10 из 20 (50%), 17-21 недели - у б из 38 (16%). У- более старших животных ВГЕ-инфекдия выявлена не была.
127 п.о.
---ж ^ 350 по
■
х .uygugu иЫШЫ^ЫШ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ркс. 1. Злехтрофореграммэ с результатами выявления РНК ЗГЕ и РНК внутреннего контроля; М - указатель молекулярных масс (100-1000 п.о.); 1, 5, 8,12 - РНК ВГЕ (+); 2, 3, 7,10,13 - РНК ВГЕ {-); 4. 6, 9, 14 - К Г-) (ЯК не вносился)
Таким образом, возрастной итервал выявления ВГЕ-ингЬркции составил от 4 до 21 недели жизни, при этом наибольшая частота выявления ['более половины обследованных животных) отмечена у животных в возрасте от 8 до 17 недель жизни. Все 34 продукта ПЦР, соответствующие гю размеру фрагменту ОРС 2 ВГЕ, для которых была определена пуклеотидная последовательное*^, соптветствовазм последователь: юсгям BrF генотипа 3 р BLAS1 что указывало на отсутствие. гожг гололожитс тьиых случаев в данной ПЦР._
Филогенетический анализ последовательностей мзолятов ВГЕ показал, что среди поголовья данной фермы циркулирует один вариант вируса, Агоскольку степень гомологии между полученными последовательностями ВГЕ составила 98%-100%. На филогенетическом Гдреве, включающем изоляты ВГЕ генотипа 3 из разных регионов мира и выделенные нами последовательности ВГЕ, формировали единый кластер внутри 3 генотипа (рис. 3).
80 70
О0
if 50
ы
м 40
Ё 30 20 10 0
- - ------
[""I шшшш
О 30
31 60 61 О0 91-120 121- 150 151-180 Свыш* 180 Возраст животных, дни
Рис. 2. Распределение случаев выявления РНК ВГЕ в разных возрастных группах животных
К
ч
L,
-3957 -3962
3968 3975 -3950
-3948
3973 с 3947 97 00 3991 3956 3983 3996 59
-4002
99
3989 4006 74 - 3990
3987
3988 4005
j— 3951 ' 92 49 76
af195063
ef053274
— AY032757
-EU360977
-АВ073911 1
I-Contlg 2 (1412)
I--АВ246521
- АР003430.1 -АВ222183
АВ290Э12
-AF082843
Генотип 3
- eu676172
— м80581
Генотип 4 Генотип 1 Генотип 2
Рис. 3. Филогенетические взаимоотношения изученных изолятов В^Е, выделенных от свиней, в области ОРС2; номера указаны длл вариантов ВГЕ, взятых из базы данных СлтеЗапк
Обсуждение
Общая частота выязленпя ВГЕ-инфекщти среди свиней в возрасте до 1 года жизни в нашем исследовании составила 15,5% процентов, что сходно с показателями, регистрируемыми в других странах, веэндемичпых по ВГЕ. Так, С. McCrearj с соавт., 2008 [15] при обследовании 1U свиноводческих хозяйств в Великобритании выявили ВГЕ-инфекпию в среднем у 21,5% сеи-ней. При этом показатели для отдетных хозяйств состав,ирги от 0,5% до 35% [15]. I. Di Bartolo с соавт., 2СП8 [16] по результатам обследования 6 свиноводческих ферм в Италии, сообщают о варьировании частоты выявления
ВГЕ еррди свиней от 12,8% до 72,5% б разных хозяйствах.
При экспериментальном воспроизведетп ВГЕ-инфекции у свиней показано, что выдете-ние вируса с фекалиями начинается через 2 нежели после инфицирования и продолжается в течение 4-S недель [11]. Однако эти данные получены при шутривенном введении ВГЕ в большой дозе (105 инфицирующих елиниц для обезьян), Иоэтому могут не соотве гстъ^нэть истинней картине, наблюдаемой при естественной инфекции.
Обследование свиней разных возрастов в Канаде показало, ато при естественной ин-
фекции PíiK PFF в фекалиях выявляется у 11,8% 2-х недельных поросят. Авторами быта покатана возможность инфицирование вирусом вплоть до 2У недели [14]. Однако результаты выявления ВГЕ у свиней в европейских странах показали, что период выделения вируса с фекалиями, и, следовательно, инфицирование, происходит позднее, начиная с 5-8 недели жизни 112,13,15].
В нашем исследовании случаи выявления РНК ВГЕ в фекалиях зарегистрированы у сви-нрй 4-5 недель жизни. Частота ВГЕ составляла 18%. Вероятность более раннего развития В1Е-икфекции у поросят мала, «»скольку показано, что в первую неделю жизни практически они все имеют материнские ангитела (анти-ВГЕ класса IgG), эащишаюгдие их от лнфицирова-ния, а к 7-8 неделям жизни большинство из них теряют данные антитела и становятся восприимчивыми к инфицированию [17]. Наибольшая частота ьыявления ВГЕ-инфекции отмечена у животных в возрасте от 8 до 17 недель, при этом у животных старше 21 недели ВГЕ уже не выявляли. Такие же возрастные рамки максимального распространения ВГЕ-инфекции у свиней наблюдали С. McCreaiy соавт. в Великобритании [15] и С. Seminati - в Испании [13].
Все выделенные нами от свиней последовательности ВГЕ по результатам филогенетического анализа принадлежали к генотипу 3, объединяющему изоляты ВГЕ, выделенные от свиней и человека на неэндемичных пс FF территориях. Все проанализированные изоляты ВГЕ из обследованного свиноводческого хозяйства образовали едшпто группу, с максимальной степенью гомологии (98-100%), что указывает на циркуляцию одного варианта вируса на данной ферме.
Таким оброзомл-Полуценные результаты позволяют определить возрастные группы свиней, в которых наиболее часто встречается ВГЕ-инфекция. Очсзиднп, что дальнейшие исследования по изучению генетического разнообразия BSE и распространенности ВГЕ-инфекции среди свиней в различных регионах России следует проводить в группах жизотных в возрасте 8-17 педель.
Литература
;i¡ Vira! hepatitis, 3rd Edition Howard С. Thomas (Ed.), Stanley Lemon (Ed.), Are J. Zucxe-man (Ed.). -Wiley-3lackkwe //, 20C5. - 896 p.
[2] Purcell Ft., Emerson S. Hepatitis E: ал emeiging awareness of an old disease //J. Hepatol. - Vol. 48. - P. 454 - 503.
[3] Михайлов M. И., Шахгильцян И. В., Оьищенко Г.Г. Эн^еральные вирусные гепатиты (этиологии, эпидемиология, диагностика, профилактика), М.; ФГОУ
миология, диагностика, профилактика), N1.: С I ВУЧМЦ РоодраЕа, 2007. 352 с.
[¿J] Не J., Innis B.L., Shrestha М.Р. Evidence that Rodents i a Reservo'r of Hepatitis E Virus for Hurrans ¡n Nep Clin. Microbiol. - 20C2. - Vol. 40. - P. 4493» 4498.
[5] Ticehurst J., Rhodes L.L., Krawczynski K. et al. !п*ес?:гг owl monkeys (Aotus trivrgatus) and cynonolgus mort e (Macaca ^ascicularis) with hepatitis E virus from Мег'сз J. Infect. Sis. - 19S2. - Vol. 1S5. - P. 835 - 845.
[6] Okamoto H., TaKashi M., Nishizawa T. et al., Ana'ysis ш the Complete Genome of Indigenous Swine Hepatitis E rus Isolated ;n Japar> // Siochem. Siopnys. Res. Сопг -2001. - Vol. 289.-P. 923-336.
[7] Li T.C., Chijiwa K., Sera N Hepatitis E Virus Transrr .ss^ fronri W:ld Boar Meat // Em. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 12. -P. 1958-1960
[8' Vlatsuda H., Okada K-, Takcihashi K., ^shiro t. -• hepatitis E virus infection after ingestion of uncooked from a wild boar // J. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 18i 944 - 951.
[9] Masuda J., Ya-io K., Tamada Y. et al. Acute hepatitis E с man who consumed wild boar meat prior to the onset illness in Nagasaki, Japan // Hepatol. Res - 2СЮГ - . : 31.-P. 178- 183.
[10] Михэйлов М.И., Замятина МЛ., Голещук В.Ф. Вис кый гепатит Е Проблемы изучения // Зопр. вирусг -мед. - 2С05. № 3. С. 20 22.
[11] Merg X J., Haibur P.G., Haynes J.S. at al. Exparimer-г infection of pigs with the newly identified swine hepat
E virus (swine HEV), but not with human strains of HEV Arr.h. Virol. - 1398. - Vol. 143. - P. 1405 -1415.
[12] de Deus N., Casas M., Peraltd B. et al. Hapatitis E \ii infection Dynamics and organic distribution in natural fected oigs in a farrow-to-finish farm // Vet. Microcicl -2008.-Vol. 25.-P. 13-28.
[13] Serrinati С Mateu £„ Peralta B. et al. Distribution c' hepatitis E virus infection and its prevalence in p.gs or commercial farms in Spain // Vet. J - 2008. - Vol 175 -P. 130 132.
[14] Leblanc D., Ward P. Gagnt. M.J. et al. Presence of hepat: tis E virus in a naturally infected swine herd from nurser, to slaughter W Int. J. Food Microbiol - 200"?. - Vol. 117 -P. 160 166.
[15] МсСгеэгу С., IVartelli F., Grierson S. et al. Excretion of hepatitis F virus by pigs ot different ages ard its presence in slurry stores in the United Kingdom // Vet. Rec. - 2008 -Vol. 163.-P. 263 -265.
[16] Di Bartolo I., Martelli F., Inglese N. et al. Widespread diffusion of genotype 3 hepatitis E virus amcr.g farming swine in Northern Italy//Vet. Microbiol. - 2008. Vol. 132 - P. 47 - 55.
[17] Vitral C.L, Pinto M A, Lewis-Ximenez L.L. et al. Serological evidence of hepatitis E virus infection in different anima species from the Southeast of Brazil // Mem. Ins1-Oswaldo Ciuz. - 20C5. - Vol. 100 - P. 117 - 122.
