CC BY
93
Краткие сообщения
Инфекция и иммунитет 2014, Т. 4, № 2, с. 192-196
ЦЕРВИКАЛЬНАЯ НЕОПЛАЗИЯ И ВИРУСНАЯ НАГРУЗКА ВПЧ 16 ГЕНОТИПА
В.С. Чирский1, В.А. Ершов2, А.А. Вязовая3, О.В. Нарвская3, Л.В. Лялина3
1ФВГБОУВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия 2СПб ГБУЗ Городской клинический онкологический диспансер, Санкт-Петербург, Россия 3 ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Исследованы 83 цервикальных биоптата эпителиальных неоплазий цитологическим, гистологическим, иммуноморфологическим методами и методом ПЦР. При цервикальной эктопии вирусная нагрузка колебалась от 2,49 до 6,65 lg копий ДНК ВПЧ/105. При умеренной и тяжелой формах дисплазии количество вируса превышало 4 lg копий ДНК ВПЧ/105 клеток, при слабой форме дисплазии, интраэпителиальной и ин-вазивной формах плоскоклеточного рака — 5 lg копий ДНК ВПЧ/105 клеток. При прогрессировании цервикальной неоплазии частота выявления клинически значимых показателей вирусной нагрузки коррелировала с увеличением средних значений периметра ядер клеток, ассоциированных с ВПЧ. При эктопии и низкой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия экспрессия капсидного белка L1 свидетельствовала о продуктивном характере вирусного поражения. При высокой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия и инвазивном раке при отсутствии экспрессии L1 ВПЧ высокие показатели вирусной нагрузки свидетельствовали о нарушении жизненного цикла папилломавируса.
Ключевые слова: вирус папилломы человека, вирусная нагрузка, шейка матки, дисплазия, рак, ядерный периметр.
Введение
Персистенция вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР) является этиологическим фактором рака шейки матки, который занимает в мире второе [10], а в России — третье место в структуре онкологической заболеваемости женского населения [4].
Канцерогенез включает в себя ряд последовательных этапов развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN). В большинстве случаев своевременная диагностика и адекватное лечение позволяют устранить угрозу формирования злокачественной опухоли на стадии предрака. С этой целью во многих странах мира используют программу цитологического скрининга.
В настоящее время в повседневную практику активно внедряют цервикальный молекулярно-генетический скрининг [5], позволяющий выявить ВПЧ ВКР и прогнозировать спонтанную элиминацию вируса или развитие интраэпителиальной неоплазии при латентной и субклинической формах инфекции. В качестве одного из диагностических критериев используют количественную характеристику содержания вируса в цервикальной пробе. Однако данные о характере связи показателя вирусной нагрузки с тяжестью цервикальной неоплазии противоречивы [1, 2, 3, 5, 11].
Целью нашего исследования явилось определение прогностического значения вирусной нагрузки ВПЧ 16 генотипа при цервикальных неоплазиях.
Авторы:
Чирский В.С., д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической анатомии ФВГБОУ ВПО Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия;
Ершов В.А., к.м.н., врач-патологоанатом патологоанатомического отделения СПб ГБУЗ Городской клинический онкологический диспансер, Санкт-Петербург, Россия;
Вязовая А.А., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия;
Нарвская О.В., д.м.н., профессор, зав. лабораторией молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия;
Лялина Л.В., д.м.н., зав. лабораторией эпидемиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия.
Адрес для переписки:
Ершов Владимир Анатольевич 198255, Россия, Санкт-Петербург, пр. Ветеранов, 56. Тел.: (812) 752-93-52 (служебн.). Факс: (812) 376-06-25. E-mail: goronkod@zdrav.spb.ru
поступила в редакцию 17.04.2014 отправлена на доработку 18.04.2014 принята к печати 30.04.2014
© Чирский В.С. и соавт., 2014
Материалы и методы
Проведен анализ результатов цитологического, иммуноцитохимического, гистологического, иммуногистохимического и молекуляр-но-генетического методов исследования эпителия шейки матки 83 ВПЧ-позитивных женщин в возрасте 22—61 лет, проходивших лечение по поводу цервикальной интраэпите-лиальной неоплазии в Санкт-Петербургском ГБУЗ Городской клинический онкологический диспансер с октября 2010 по май 2011 гг.
Цитологические препараты соскобов эк-тоцервикса и эндоцервикса готовили методом жидкостной цитологии и окрашивали по методу Папаниколау.
Материал электроэксцизии шейки матки для гистологического исследования готовили по стандартной методике и окрашивали гематоксилином и эозином.
В 60 случаях проводили иммуноцитохими-ческие, в остальных 23 — иммуногистохимиче-ские исследования с использованием системы детекции «Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen» (TL-015-HD), Thermo Scientific (США) и моноклональных антител (разведение 1:100) к капсидному протеину L1 ВПЧ 16 генотипа (CAMVIR-1, Mob 394), DBS (США). Полученные результаты оценивали в цитологических или гистологических препаратах полуколичественным способом среди всех атипичных клеток, характерных для интраэпи-телиальной неоплазии, в смежных с ними клетках многослойного плоского эпителия, в ме-таплазированных резервных клетках, а также во всех опухолевых клетках морфологического препарата и клетках паратуморальной зоны.
С помощью видеокамеры «Progres C3» в режиме «Measure» х100 в цитологических препаратах измеряли периметр ядра всех присутствующих в них клеток, рассчитывали среднее значение периметра ядер (ПЯ) клеток плоского эпителия типичного строения, а также атипичных и опухолевых клеток, ассоциируемых с ВПЧ [7].
Заключения результатов цитологических исследований формулировали в соответствии с классификацией «The Bethesda System for reporting cervical cytologic diagnoses» [6], гистологических исследований — в соответствии с гистологической классификации ВОЗ [10].
Выявление, количественное определение (lg копий ДНК ВПЧ ВКР/105 клеток) и геноти-пирование ВПЧ ВКР в цервикальном соскобе проводили методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени на приборе Rotor Gene («Corbett Research», Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ (Москва) согласно инструкции производителя.
Достоверность различий полученных результатов оценивали на основании критерия Фишера.
Результаты и обсуждение
В результате морфологического исследования операционного материала у 12 женщин 32— 50 лет верифицирована эктопия шейки матки, у 71 на ее фоне выявлены изменения многослойного плоского эпителия. Из них у 5 женщин (22— 46 лет) диагностирована слабая (CIN I, LSIL), у 16 больных (25—54 лет) — умеренная (CIN II, HSIL), у 27 пациенток (22—60 лет) — тяжелая форма дисплазии (CIN III, HSIL). У 14 женщин (29—61 лет) верифицирован интраэпителиаль-ный (CIN III, Carcinoma in situ, HSIL) и у 9 пациенток (27—48 лет) — инвазивный плоскоклеточный рак шейки матки (SCC).
В 66 (79,52%) из 83 ВПЧ-позитивных образцов материала обнаружено присутствие ВПЧ 16-го генотипа. В остальных случаях выявлена ассоциация ВПЧ 16 с папилломавирусами других генотипов.
При цервикальной эктопии определены как клинически мало значимые уровни инфицирования — 2,49, так и высокие показатели количества ВПЧ — 6,65 lg копий ДНК ВПЧ/105 (рис. 1). Для умеренной и тяжелой форм дисплазии были характерны показатели «вирусной нагрузки» свыше 4,0 lg копий ДНК ВПЧ/105 клеток. Во всех случаях слабой формы дисплазии, ин-траэпителиальной и инвазивной форм плоскоклеточного рака количество вируса превышало 5,0 lg копий ДНК ВПЧ/105 клеток (рис. 1).
В биоптатах большинства цервикальных не-оплазий выявлено от 6,01 до 7,0 lg копий ДНК ВПЧ/105 клеток.
Иммуноморфологический критерий репродукции ВПЧ — капсидный белок L1 [9] — при эктопии обнаружен в клетках поверхностного слоя плоского эпителия, средние значения ПЯ которых составили 24,78+2,99 ц (рис. 2).
В препаратах CIN I кроме поверхностных клеток типичного строения протеин L1 наблюдали в крупных ядрах клеток с околоядерной зоной просветления — койлоцитах, так и без нее — «некойлоцитах, периметры ядер которых составили, соответственно, 29,12+1,97 ц и 86,93+2,11 ц (p < 0,01). Увеличение ядер клеток, ассоциированных с ВПЧ (рис. 2), среднее значение ПЯ которых составило 46,98+2,87 ц (p < 0,01), обусловленное увеличением количества ДНК [7] и, в первую очередь — вирусной ДНК [8], объясняло различия в вирусной нагрузке при эктопии и CIN I (рис. 1).
При умеренной дисплазии (HSIL, CIN II) протеин L1 был обнаружен в клетках поверхностного слоя плоского эпителия (ПЯ = 23,06+3,04 ц), прилежащего к неопластическому участку. Ядерные изменения атипичных клеток, а также койлоцитов и «некойлоцитов» в пограничном эпителии, средние значения ПЯ которых составили, соответственно, 38,12+2,56, 57,01+2,11 и 54,67+2,88 ц (p < 0,01), служили кос-
ЕЗ = —| —|
1 |_ = §
1 1 1 1 = п
3,01-4
4,01-5
5,01-6 Ig копий
| Эктопия В Слабая дисплазия
Тяжелая дисплазия О Ca in situ
6,01-7
7,01-8
Умеренная дисплазия Инвазивный рак
8,01-9
Рисунок 1. Частота выявления показателей вирусной нагрузки ВПЧ 16 генотипа при разных формах поражения цервикального эпителия
венным свидетельством накопления в них ДНК. Среднее значение ПЯ клеток при CIN II, ассоциированных с ВПЧ, составило 43,22+1,99 ц (p < 0,01) и не превышало соответствующие показатели при CIN I (рис. 2).
При тяжелой дисплазии (HSIL, CIN III) капсидный белок L1 обнаружен в атипичных клетках (ПЯ = 41,87+2,56 ц) в одном случае. В остальных исследованиях CIN III и SCC
Рисунок 2. Средние значения периметра ядер ассоциированных с ВПЧ клеток в препаратах цервикальной неоплазии
экспрессию L1 наблюдали в граничащих с участком поражения эпителия койлоцитах и поверхностных клетках, средние значения ПЯ которых составили, соответственно, 54,78+2,23 и 22,68+1,94 ц. Периметр ядер атипичных клеток при тяжелой дисплазии был сопоставим с соответствующими показателем при CIN II, составив 43,99+2,33 ц, но уступал периметру ядер при Ca in situ и SCC, которые составили, соответственно, 68,11+3,12 и 69,35+1,88 ц (p < 0,01), крупные размеры которых, характерные для цервикальных неоплазий [7], связаны с нерегулируемой репликацией вирусной ДНК при гиперэкспрессии E7 [8, 12]. Средние значения ПЯ клеток, ассоциируемых с ВПЧ (рис. 2), составили при тяжелой дисплазии 49,39+1,97 ц, при интраэ-пителиальном раке — 61, 45+3,48 ц, при инва-зивном раке — 62,07+3,66 ц (p < 0,01).
Таким образом, при утяжелении поражения цервикального эпителия частота выявления клинически значимых показателей вирусной нагрузки коррелировала с увеличением средних значений периметра ядер клеток, ассоциированных с ВПЧ. При эктопии и LSIL положительная экспрессия капсидного белка L1 свидетельствовала о продуктивном характере вирусного поражения. При HSIL и инвазив-ном раке отсутствие экспрессии L1 и высокие показатели вирусной нагрузки характеризовали изменение жизненного цикла папилло-мавируса.
Список литературы
1. Вязовая А.А., Ершов В.А., Банюк Н.В., Нарвская О.В. Выявление различных генотипов вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска у женщин Санкт-Петербурга // Папилломавирусная инфекция и злокачественные новообразования. Интегрированная система надзора и профилактики: материалы междунар. симп.; 4—5 июня 2009 г. — СПб.: НИИЭМ им. Пастера, 2009. — С. 26-27.
2. Вязовая А.А., Куевда Д.А., Трофимова О.Б., Шипулина О.Ю., Ершов В.А., Лялина Л.В., Нарвская О.В. Выявление вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска и оценка физического статуса вирусной ДНК методом ПЦР при поражении цервикального эпителия // Клиническая лабораторная диагностика. — 2013. — № 8 — С. 24-26.
3. Евстигнеева Л.А., Бахидзе Е.В., Семиглазов В.В. Роль генотипа вируса папилломы человека, множественности вируса, вирусной нагрузки и иммунного статуса в патогенезе рака шейки матки // Ученые записки Санкт-Петербургского государственного университета им. акад. И.П. Павлова. — 2008. — Т. 15, № 2. — С. 10-14.
4. Состояние онкологической помощи населению России в 2010 г. / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. — М.: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России, 2011. — 188 с.
5. Трушина О.И., Новикова Е.Г., Шипулина О.Ю., Романюк Т.Н. Вирусная нагрузка ДНК ВПЧ как прогностический фактор злокачественной прогрессии ПВИ // Молекулярная диагностика-2014: сб. тр. VIII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием / Под ред. В. И. Покровского. — М., 2014. — Т. 1. — С. 207.
Ссылки 6-12 см. в References (с. 196). See References for numbers 6-12 at p. 196.
Infekcia i immunitet (Infection and Immunity) euADT ^rMm»«. luinATinkie
2014, vol. 4, no. 2, pp. 192-196 SHORT COMMUN|CAT|ONS
CERVICAL NEOPLASIA AND VIRUS LOAD OF HPV 16 GENOTYPE
Chirsky V.S.a, Ershov V.A.b, Vyazovaya A.A.c, Narvskaya O.V.c, Lyalina L.V.c
aMilitary Medical Academy of S.M. Kirov, St. Petersburg, Russian Federation bMunicipal Clinical Oncology Dispensary, St. Petersburg, Russian Federation cSt. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russian Federation
Abstract. The 83 biopsies from HPV16-positive cervical epithelial neoplasies were studied by cytological, histological, im-munomorphological methods and PCR. At cervical ectopia virus loading changed from 2.49 up to 6.65 lg copies of DNA HPV/105. At CIN II and CIN III the quantity of a virus exceeded 4 lg copies of DNA HPV/105 of cells, at the CIN I, Ca in situ and SCC — 5 lg copies of DNA HPV/105 of cells. At progressing of neoplasia frequency of revealing of clinically significant parameters of virus loading correlated with increase in average values of nuclear perimeter of cells, associated with HPV. At ectopia and LSIL expression of capsid protein L1 testified about virus production. At HSIL and SCC at absence expression L1 HPV high parameters of virus load testified to infringement of life cycle papillomaviruses.
Key words: HPV, viral load, cervix uteri, CIN, cancer, perimeter of nucleus. Authors:
Chirsky V.S., PhD, MD (Medicine), Professor, Head of the Department of Pathologic Anatomy, Military Medical Academy of S.M. Kirov, St. Petersburg, Russian Federation;
Ershov V.A.H, PhD (Medicine), Pathologist of Pathological Department of Municipal Clinical Oncology Dispensary; 198255, Russian Federation, St. Petersburg, Veteranov pr., 56. Phone: (812) 752-93-52 (office). Fax: (812) 376-06-25. E-mail: goronkod@zdrav.spb.ru
Vyazovaya A.A., PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Molecular Microbiology, St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russian Federation;
Narvskaya O.V., PhD, MD (Medicine), Professor, Head of the Laboratory of Molecular Microbiology, St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russian Federation;
Lyalina L.V., PhD, MD (Medicine), Head of Laboratory of Epidemiology, St. Petersburg Pasteur Institute St. Petersburg, Russian Federation.
References
1. Vyazovaya A.A., Ershov V.A., Banyuk N.V., Narvskaya O.V. Vyyavlenie razlichnykh genotipov virusa papillomy cheloveka vyso-kogo kantserogennogo riska u zhenshchin Sankt-Peterburga [Detection of high risk human papillomavirus types in women in St. Petersburg] Papillomavirusnaya infektsiya i zlokachestvennye novoobrazovaniya. Integrirovannaya sistema nadzora i pro-filaktiki: materialy mezhdunarodnogo simpoziuma; 4-5 iyunya 2009 g. [Human papillomavirus infection and cancer. Integrated surveillance system and prevention: book of abstracts]. St. Petersburg, 2009, pp. 26—27.
2. Vyazovaya A.A., Kuevda D.A., Trofimova O.B., Shipulina O.Yu., Ershov V.A., Lyalina L.V., Narvskaya O.V. Vyyavlenie virusov papillomy cheloveka vysokogo kantserogennogo riska i otsenka fizicheskogo statusa virusnoy DNK metodom PTSR pri porazhenii tservikal'nogo epiteliya [Detection of high risk human papillomaviruses and estimation of the physical status DNA HPV by PCR in cervical epithelium lesions]. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika — Clinical Laboratory Diagnostics, 2013, no. 8, pp. 24—26.
3. Evstigneeva L.A., Bakhidze E.V., Semiglazov VV. Rol' genotipa virusa papillomy cheloveka, mnozhestvennosti virusa, virusnoy nagruzki i immunnogo statusa v patogeneze raka sheyki matki [The role of human papillomavirus genotype, viral load and the immune status in pathogenesis of cervical cancer]. Uchenye zapiski Sankt-Peterburgskogo gosudarstvennogo universiteta im. akad. I.P. Pavlova — Scientists of note of the St. Petersburg state university, 2008, vol. 15, no. 2, pp. 10—14.
4. Ostoyanie onkologicheskoy pomoshchi naseleniyu Rossii v 2010 godu (pod red. V.I. Chissova, V.V. Starinskogo, G.V. Petrovoy) [Condition of the oncological aid to the population of Russia in 2010 (Eds. V.I. Chissov, V.V. Starinskiy, G.V. Petrova)]. Moscow, 2011. 188p.
5. Trushina O.I., Novikova E.G., Shipulina O.Yu., Romanyuk T.N. Virusnaya nagruzka DNK VPCH kak prognosticheskiy faktor zlokachestvennoy progressii PVI [Viral load DNA HPV as prognostic factor of cancer progression in HPI] Molekulyarnaya di-agnostika-2014: sbornik trudov VIII Vserossiyskoy nauchno-prakticheskoy konferentsii s mezhdunarodnym uchastiem (pod red. V.I. Pokrovskogo) [Molecular diagnostics-2014: proceedings of the VIIIth All-Russia conference (ed. V.I. Pokrovsky)]. Moscow, 2014, vol. 1, p. 207.
6. Apgar B.S., Zoschnick L., Wright T.C.Jr. The 2001 Bethesda system terminology. Am. Fam. Physic., 2003, vol. 68, no. 15, pp. 1992-1998.
7. Artacho-Pdrula E., Rold&n-Villalobos R., Salas-Molina J., Vaamonde-Lemos R. Histomorphometry of normal and abnormal cervical samples. Anal. Quant. Cytol. Histol., 1993, vol. 15, no. 4, pp. 290-297.
8. Doorbar J. The papillomavirus life cycle. J. Clin. Virol., 2005, vol. 32 (suppl. 1), pp. 7-15.
9. Griesser H., Sander H., Hilfrich R.A. Correlation of immunochemical detection of HPV L1 capsid protein in Pap smears with regression of high risk positive mid/moderate dysplasia. AQCH, 2004, vol. 26, no. 5, pp. 241-245.
10. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. WHO classification of tumours. Eds. F.A. Tavassoli, P. Devilee. Lyon: IARC Press, 2003. 432p.
11. Yoshida T., Sano T., Kanuma T., Owada N., Sakurai S., Fukuda T., Nakajima T. Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of the type distribution, viral load and physical status of human papillomavirus in liquid-based cytology samples from cervical lesions. Int. J. Ginecol. Cancer, 2008, vol. 18, no. 2, pp. 121-127.
12. Zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat. Rev. Cancer., 2002, vol. 2, no. 5, pp. 342-350.
Received 17.04.2014 Revision received 18.04.2014 Accepted 30.04.2014
