CC BY
136
УДК 616-006.52
Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2014. Вып. 2
В. А. Ершов1, А. А. Вязовая2, О. В. Нарвская2 ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ КОЙЛОЦИТОВ
1 Городской клинический онкологический диспансер, Российская Федерация, 198255, Санкт-Петербург, пр. Ветеранов, 56
2 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14
Исследованы 45 биоптатов ВПЧ-позитивного цервикального эпителия гистологическим, иммуногистохимическим методами и методом ПЦР. Койлоциты выявлены в 14 случаях в месте заживления эрозии, в 3 — на границе с участками CIN1, в 7 — CIN2, в 16 — CIN3, из них в 2 — с очагами Ca in situ, в 5 случаях — в паратуморальной зоне инвазивного плоскоклеточного рака. Более 90% случаев койлоцитоза обусловлено повреждением эпителия вирусами папилломы человека филогенетической группы а9 и, в первую очередь, ВПЧ 16 генотипа. Во всех случаях экспрессии Ki-67 в койлоцитах не выявлено. Дискариоз и многоядерность койлоцитов являются побочным действием вирусного белка Е7, связывающегося с ядерным белком мито-тического аппарата, что приводит к повреждению клеточной ДНК. Экспрессия р53 обнаружена в единичном наблюдении в многоядерных койлоцитах. Во всех исследованиях в койлоцитах отсутствовала экспрессия цитокератина 5, что позволяет предположить развитие койлоцитов из клеток базального слоя многослойного плоского эпителия (МПЭ). Отсутствие экспрессии цитокератина 10 в околоядерной зоне «просветления» койлоцитов обусловлено разрушением сети цитокератинов при взаимодействии с вирусным белком Е4. Экспрессия Е-кадхерина выражена в преобладающем числе койлоцитов. Библиогр. 11 назв. Табл. 1. Ключевые слова: шейка матки, койлоцит, ВПЧ, эктопия, дисплазии, рак.
IMMUNOMORPHOLOGICAL CRITERIA OF COILOCYTES
V. A. Ershov1, A. A. Vyazovaya2, O. V. Narvskaya2
1 City Clinical Oncology Dispensary, 56, pr. Veteranov, St. Petersburg, 198255, Russian Federation
2 Scientific Research Institute of Pasteur, 14, ul. Mira, St. Petersburg, 197101, Russian Federation
The 45 biopsies from HPV-positive epithelium of cervix uteri were studied by histological, immuhisto-logical methods and PCR. Coilocytes are revealed in 14 cases in a place of healing of erosion, in 3 — on border with sites CIN1, in 7 — CIN2, in 16 — CIN3, in 2 from them — with centers Ca in situ, in 5 — in paratumoral zone of invasive cancer. More than 90% of coilocytosis cases are caused by damage of epi-thelia by human papilloma virus of phylogenetical group а9 and, first of all, HPV 16 genotypes. Expression Ki-67 in coilocytes it is not revealed in all cases. Dyskaryosis and multinuclear coilocytes are collateral action contacting of the protein HPV Е7 with nuclear mitotic apparatus protein 1 (NuMA), that leads to damage of cellular DNA. Expression р53 is found out in individual supervision in multinuclear coilocytes. In all researches in coilocytes the expression of keratin 5 was absent, that allows to assume development of coilocytes from basal cells of squamous epithelia. Absence of keratin 10 expression in perinuclear halos of coilocytes is caused by destruction of keratin network at interaction with HPV Е4. Expression Е-kadherin is expressed in a prevailing number of coilocytes. Refs 11. Table 1. Keywords: cervix uteri, koilocytes, HPV, ectopia, CIN, SCC.
Морфологическим критерием папилломавирусного поражения эпителия принято считать койлоцит — клетку промежуточного или поверхностного слоя многослойного плоского эпителия (МПЭ) с дискариозом и околоядерной зоной «просветления», сформированной в результате некроза [1, 2].
Популяцию койлоцитов в составе МПЭ расценивают как признак низкой степени интраэпителиального повреждения плоского эпителия (LSIL), соответствующую цервикальной интраэпителиальной неоплазии 1 степени (CIN1). В ряде наблюдений [3] отмечают данный вид клеток при высокой степени интраэпителиального по-
вреждения (HSIL), соответственно, CIN2 и CIN3, а также при инвазивном плоскоклеточном раке (SCC). Формирование койлоцитов является отражением клеточной пролиферации и дифференцировки, сопровождаемых репликацией вирусного генома, транскрипцией и трансляцией вирусных белков и сборкой вирионов [1, 2, 4].
При длительном течении процесса в койлоците может изменяться белковая структура цитоплазмы, вследствие чего первоначальная околоядерная зона «просветления» может увеличиться на всю площадь цитоплазмы, что проявляется различиями в окраске ее различных участков [4].
Целью исследования явилось изучение механизма формирования койлоцита путем оценки пролиферации, апоптоза, белковой структуры цитоплазмы и межклеточных связей.
Материал и методы. Проведен анализ результатов гистологического, имму-ногистохимического и молекулярно-генетического исследования эпителия шейки матки 45 ВПЧ-инфицированных женщин 19-60 лет, обратившихся за медицинской помощью в Городской клинический онкологический диспансер Санкт-Петербурга с января 2011 по январь 2012 г.
Для гистологического исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки, который фиксировали в 10% растворе формалина, обезвоживали в этиловых спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки, с помощью микротома готовили срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.
Во всех случаях проводили иммуногистохимические исследования с использованием системы детекции "Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen" (TL-015-HD), моноклональных кроличьих антител к Ki-67 (SP6,RM-9106-S0), к p53 (SP5,RM-9105-S0), к цитокератину 5 (EP1601Y,RM-2106-S0), моноклональных мышиных антител к цитокератину 10 (DE-K10,MS-611-P0) и к Е-кадхерину (SPM471,VS-9470-P0) производства фирмы Thermo Scientific (США).
Полученные результаты иммуноморфологических исследований койлоцитов оценивали в препаратах эктопии, интраэпителиальной неоплазии, инфильтратив-ного рака.
Заключения результатов гистологических исследований формулировали в соответствии с последней редакцией гистологической классификации ВОЗ [5].
Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени на приборе Rotor Gene ("Corbett Research", Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ.
Результаты исследования и их обсуждение. В результате гистологического исследования операционного материала койлоциты выявлены в МПЭ в месте заживления эрозии у 14 (31,1%) женщин (табл.). У 3 (6,7%) пациенток они обнаружены на границе с участками CIN1, у 7 (15,6%) — CIN2, у 16 (35,5%) — CIN3, из них у 2 больных — с очагами Ca in situ. У 5 (11,1%) больных плоскоклеточным раком шейки матки (SCC) койлоциты наблюдали в паратуморальной зоне.
ВПЧ 16 генотипа обнаружен в 29 (64,4%) из 45 случаев, его сочетания с папилло-мавирусами филогенетической группы (ФГГ) а9 — в 7 (15,6%). ВПЧ ФГГ а9 (без ВПЧ 16) определены в 6 (13,4%), ФГГ а7 — в 2 (4,4%), их сочетания — в 1 (2,2%) случаях.
Во всех исследованиях экспрессии ядерного белка Ю-67, ассоциированного с клеточной пролиферацией, в койлоцитах не выявлено, что свидетельствует о нахождении клеток в постмитотической фазе клеточного цикла.
Наблюдаемый дискариоз, по-видимому, можно расценить как следствие избыточного накопления ДНК (клеточной или вирусной) в S-фазе вследствие воздействия на клеточные белки вирусных белков Е6 и Е7, создающих оптимальные условия для вирусной репликации генома, необходимой для производства инфекционных вирионов [3].
В 8 (57,1%) случаях эктопии, в 2 (66,7%) — СШ1, в 5 (71,4%) — СШ2, в 13 (81,3%) — СШ3, в 4 (80%) случаях SCC среди койлоцитов выявлены двух-пяти ядерные клетки, сформированные вследствие нарушений процесса цитотомии [6] или нарушения митотического аппарата ассоциацией вирусного белка Е7 с ядерным митотическим аппаратным белком (№МА1), что могло привести к повреждению клеточной ДНК в процессе митоза [7].
Экспрессия р53 обнаружена в одном наблюдении в 0,05% койлоцитов, содержащих 3-4 ядра. В данном случае многоядерность может быть расценена как следствие митотической ошибки, которая привела к повреждению клеточной ДНК и запустила механизм апоптоза. В остальных случаях экспрессии р53 не обнаружено ни в одном койлоците, что служит признаком инактивации данного апоптозного белка продуктом вирусного гена Е6 [3].
Во всех исследованиях в койлоцитах отсутствовала экспрессия цитокератина 5, характерного для пролиферирующих резервных клеток [8], которые могут в процессе метаплазии приобрести свойства плоского эпителия [9]. По нашему мнению, данные наблюдения позволяют судить о развитии койлоцитов из клеток базального слоя МПЭ.
В одном случае при умеренной форме дисплазии в окружающих околоядерную зону «просветления» участках цитоплазмы койлоцитов наблюдали экспрессию ци-токератина 10. В остальных 44 случаях все койлоциты содержали оптически пустую цитоплазму, что, по-видимому, обусловлено взаимодействием вирусного белка Е4 с сетью цитокератинов, вследствие чего происходит их деструкция, необходимая для облегчения формирования вирионов и последующего их выхода из клетки [10].
Таблица. Встречаемость койлоцитов при повреждениях цервикального эпителия в зависимости от генотипа ВПЧ
Морфология основного заболевания Число случаев Всего
ВПЧ16 ВПЧ16+а9 ВПЧа9 ВПЧа7 ВПЧ а9+а7
Эктопия 11 1 1 1 14
СШ1 2 1 3
СШ2 4 1 2 7
СШ3 9 3 3 1 16
8СС 3 1 1 5
Всего 29 7 6 2 1 45
Экспрессия мембранного белка Е-кадхерина в 24 (53,3%) случаях выявлена в клетках всех слоев МПЭ — от базального до поверхностного, в том числе и в кой-
лоцитах [11], что свидетельствовало о сохранении ими адгезивности. В остальных (46,7%) наблюдениях мембранная реакция отмечена в слое базальных, парабазаль-ных клеток и непосредственно в прилегающих к ним койлоцитах в отличие от кой-лоцитов, расположенных выше — на границе промежуточного и поверхностного слоев МПЭ, в которых этот белок не был обнаружен. Корреляция экспрессии данного маркера с тяжестью основного процесса не выявлена.
Таким образом, койлоциты развиваются из базальных клеток многослойного плоского эпителия вследствие взаимодействия с вирусом папилломы человека. Характерное для койлоцитов разрушение сети цитокератинов при сохранении межклеточной адгезии проявляется в постмитотической фазе клеточного цикла. Более 90% случаев койлоцитоза обусловлено повреждением эпителия вирусами папилломы человека филогенетической группы а9 и, в первую очередь, ВПЧ высокого канцерогенного риска 16-го генотипа.
Литература
1. Koss L. G. Diagnostic cytology and its histopathologyc bases: 5 ed. Philadelphia: J. B. Lippincott Company, 2006. 1709 p.
2. Wang H-K., Duffy A. A., Broker T. R., Chow L. T. Robust production and passaging of infectious HPV in sguamous epithelium of primary human keratinocytes // Genes and Develop. 2009. Vol. 23. P. 181-194.
3. Doorbar J. The papillomavirus life cycle // J. Clin. Virol. 2005. Vol. 32 (Suppl. 1). S. 7-15.
4. Ершов В. А., Нарвская О. В. Фоновые процессы и неоплазия эпителия шейки матки. СПб.: ООО «Человек», 2007. 80 с.
5. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. WHO classification of tumours. Lyon: IARC Press, 2003. 432 p.
6. Ершов В. А., Чирский В. С., Вязовая А. А. и др. Активность процессов пролиферации и апоптоза при интеграции в цервикальный эпителий ДНК вируса папилломы человека 16 генотипа // Архив патологии. 2013. Т. 75, № 2. С. 16-19.
7. Nguyen C. L., Mtinger K. Human papillomavirus E7 protein deregulates mitosis via an association with nuclear mitotic apparatus protein 1 // J. Virol. 2009. Vol. 83, N 4. P. 1700-1707.
8. Martens J. E., Smedts F. M., Ploeger D. et al. Distribution pattern and marker profile show two subpopulations of reserve cells in the endocervical canal // Int. J. Gynecol. Pathol. 2009. Vol. 28, N 4. P. 381-388.
9. Smedts F., Ramaekers F. C., Hopman A. H. The two faces of cervical adenocarcinoma in situ // Int. J. Gynecol. Pathol. 2010. Vol. 29, N 4. P. 378-385.
10. Mcintosh P. B., Laskey P., Sullivan K. et al. E1-E4-mediated keratin phosphorylation and ubiquitylation: a mechanism for keratin depletion in HPV16-infected epithelium // J. Cell. Sci. 2010. Vol. 123 (Pt 16). P. 28102822.
11. Kaplanis K., Kiziridou A., Liberis V., Destouni C., Galazios G. E-cadherin expression during progression of squamous intraepithelial lesions in the uterine cervix // Eur. J. Gynaecol. Oncol. 2005. Vol. 26, N 6. P. 608-610.
Статья поступила в редакцию 25 марта 2014 г.
Контактная информация
Ершов Владимир Анатольевич — кандидат медицинских наук, врач-патологоанатом; goronkod@ zdrav.spb.ru
Вязовая Анна Александровна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Нарвская Ольга Викторовна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией
Ershov Vladimir A. — Candidate of Medicine, physician-pathologist; [email protected] Vyazovaya Anna A. — Candidate of Biology, senior researcher Narvskaya Olga V. — Doctor of Medicine, Professor, Head of Laboratory
