CC BY
59
2014
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 1
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ
УДК 616-006.52
В. А. Ершов1, В. С. Чирский2, А. А. Вязовая3, О. В. Нарвская3
ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЦЕРВИКАЛЬНОГО ЭПИТЕЛИЯ ПРИ ПОРАЖЕНИИ ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА
1 Городской клинический онкологический диспансер, Российская Федерация, 198255, Санкт-Петербург, пр. Ветеранов, 56
2 Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова, Российская Федерация, 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6
3 НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Российская Федерация, 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14
Исследованы 127 биоптатов ВПЧ-позитивного цервикального эпителия цитологическим, гистологическим, иммуноморфологическим методами и методом ПЦР. Количество клеток с экспрессией Ki-67, СК5, с митозами и с их нарушениями у больных с ВПЧ 16 генотипа связано с тяжестью эпителиального повреждения. При HSIL, ассоциированных с ВПЧ ФГГ а9, экспрессии СК5 в клетках поверхностного и промежуточного слоев плоского эпителия свидетельствует
0 замедлении клеточной дифференцировки. При эктопии и LSIL нарушения митоза, обусловленные ВПЧ, проявляются преимущественно нарушением цитотомии. В случаях HSIL и SCC, ассоциированных с ВПЧ 16, их дополняют повреждения митотического аппарата. Библиогр. 14 назв. Табл. 4.
Ключевые слова: ВПЧ, шейка матки, митоз, экспрессия.
CHANGES OF PROLIFERATION OF CERVICAL EPITHELIUM AT DEFEAT OF HUMAN PAPILLOMA VIRUSES
V. A. Ershov1, V. S. Chirsky2, A. A. Vyazovaya3, O. V. Narvskaya3
1 City Clinical Oncology Dispensary, 56, pr. Veteranov, St. Petersburg, 198255, Russian Federation
2 Military Medical Academy named after S. M. Kirov, 6, ul. Akademika Lebedeva, St. Petersburg, 194044, Russian Federation
3 Scientific Research Institute of Pasteur, 14, ul. Mira, St. Petersburg, 197101, Russian Federation
The 127 biopsies from HPV-positive epithelium of cervix uteri were studied by cytological, histological, immunomorphological methods and PCR. The number of cells expressing Ki-67, CK5, with mitosis and their alteration at patients with HPV 16 genotype was correlated to grade of cervical squamous epithelial lesion. At HSIL from HPV PGG а9 expression СК5 in superficial and intermediate squamous cells testifies to delay of a cellular differentiation. At ectopia and LSIL from HPV-positive infringements of mitosis are shown mainly by infringement cytotomia. In cases HSIL and SCC from HPV16-positive they are supplemented with damages mitotic device. Refs 14. Tables 4. Keywords: HPV, cervix, mitosis, expression.
По литературным данным [1], в 60% наблюдений слабой и умеренной дисплазий (cervical intraepithelial neoplasia — CIN1 и CIN2) патологические изменения эпителия исчезают спонтанно, приблизительно в 30% случаев они сохраняются в течение
24 месяцев, в 10% наблюдений продвигаются к тяжелой дисплазии (CIN3) и в 1% случаев приводят к развитию плоскоклеточного рака (SCC).
Одним из важнейших факторов, способствующих формированию в эпителии шейки матки плоскоклеточного рака, является вирус папилломы человека (ВПЧ). При интеграции ДНК ВПЧ в ДНК клетки происходит активация вирусных белков-онкогенов Е6 и Е7, повреждающих соответственно гены р53 и рRb клеточной ДНК [2]. Инактивация p53 и рRb, сопровождающаяся задержкой процессов дифференци-ровки клеток эпителия и пролиферацией парабазальных кератиноцитов [3], может приводить к развитию неопластических процессов в цервикальном эпителии.
Интеграция и репродукция ВПЧ, а также регенерация поврежденного церви-кального эпителия связаны с пролиферативными процессами в клетках [4]. Оценить клеточную пролиферацию помогает выявление ядерного белка Ki-67, экспрессию которого отмечают в фазах G1, S, G2 и M клеточного цикла, и цитокератина 5 (CK5), характерного для пролиферирующих базальных [5], резервных [6] и метаплазиро-ванных клеток шейки матки.
Целью исследования являлся анализ изменений пролиферации регенерирующего цервикального эпителия при поражении вирусом папилломы человека.
Материал и методы. Проведен анализ результатов цитологического, иммуноци-тохимического, гистологического, иммуногистохимического и молекулярно-гене-тического методов исследования эпителия шейки матки 127 ВПЧ-инфицированных женщин 21-71 года, находившихся на лечении по поводу цервикальной интраэпи-телиальной неоплазии в Санкт-Петербургском ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» с января по март и с октября 2010 г. по май 2011 г. включительно.
Цитологические препараты соскобов эктоцервикса и эндоцервикса готовили методом жидкостной цитологии с помощью центрифуги "Rotofix 32A", фиксировали в течение 5 мин в 95%-ном растворе этилового спирта и окрашивали по методу Па-паниколау с помощью реактивов "Bio-Optica" (Италия).
Для гистологического исследования использовали материал, полученный при электроэксцизии шейки матки, который фиксировали в 10%-ном растворе формалина, обезвоживали в этиловых спиртах восходящей концентрации, заливали в парафиновые блоки, с помощью микротома готовили срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.
С использованием системы детекции "Ultra Vision LP Détection System HRP Polymer & Dab Plus Chromogen" (TL-015-HD) в 27 случаях проводили иммуноци-тохимические и в 54 — иммуногистохимические исследования с использованием моноклональных кроличьих антител (разведение 1:200) к Ki-67 (SP6, RM-9105-S0), в 27 случаях — иммуноцитохимические и в 31 — иммуногистохимические исследования с использованием моноклональных кроличьих антител (разведение 1:100) к кератину 5 (EP1601Y, RM-2106-S0) производства фирмы Thermo Scientific для Lab Vision Corporation (США).
Полученные результаты иммуноморфологических исследований, подсчета митозов, многоядерных клеток оценивали при эктопии и интраэпителиальной нео-плазии среди клеток всех слоев многослойного плоского эпителия (МПЭ) и мета-плазированных резервных клеток, при инфильтративном раке — среди опухолевых клеток.
Заключения результатов цитологических исследований формулировали в соответствии с классификацией TBS [7], гистологических исследований — в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ [8].
Выявление и генотипирование ДНК ВПЧ в соскобе цервикального канала проводили методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени на приборе Rotor Gene ("Corbett Research", Австралия) с использованием комплектов реагентов ФГУН ЦНИИЭ.
Достоверность различий полученных результатов оценивали на основании критерия Фишера с уровнем значимости p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. В результате морфологического исследования операционного материала у 19 женщин (15%) диагностирована эктопия шейки матки, у 108 (85%) — на ее фоне выявлен неопластический процесс. Из них у 8 (6,3%) пациенток установлена слабая (CIN1, LSIL), у 28 (22%) — умеренная (CIN2, HSIL), у 43 (33,9%) — тяжелая формы дисплазии (CIN3, HSIL). Интраэпите-лиальный рак (CIN3, Ca in situ, HSIL) верифицирован в 17 (13,4%), плоскоклеточный рак шейки матки (SCC) — в 12 случаях (9,4%) соответственно (табл. 1).
ВПЧ 16 генотипа обнаружен в 61 (48%) случае, его сочетания с папилломавиру-сами 31, 33, 58 типов филогенетической группы (ФГГ) а9 — в 29 (22,8%), с ВПЧ 18, 39, 45 типов ФГГ а7 — в 6 (4,8%), с ФГГ а9 (31 генотип) и а6 (56 генотип) — в 1 (0,8%) случаях. Папилломавирусы ФГГ а9 (без ВПЧ 16) выявлены в 20 (15,8%), ФГГ а7 — в 8 (6,2%), их сочетание — в 2 (1,6%) случаях (табл. 1).
Таблица 1. Количество инфицированных ВПЧ пациентов
Морфология Количество больных с генотипами ВПЧ Всего
16 16+ а9 16+ а7 16+ а9+а6 а9 а7 а9+а7
Эктопия шейки матки 4 5 1 1 5 2 1 19
Слабая дисплазия (CIN1, LSIL) 5 1 1 1 8
Умеренная дисплазия (CIN2, HSIL) 11 5 4 6 2 28
Тяжелая дисплазия (CIN3, HSIL) 19 14 1 7 1 1 43
Ca in situ (CIN3, HSIL) 13 3 1 17
Плоскоклеточный рак (SCC) 9 1 2 12
Всего 61 29 6 1 20 8 2 127
В препаратах цервикальной эктопии клеток с экспрессией Ki-67 не обнаружено (табл. 2). При CIN1 положительную реакцию на антитела к Ki-67 наблюдали в па-рабазальных клетках у пациенток с ВПЧ 16 типа. У больных с ВПЧ 16 и при его сочетании с ВПЧ других генотипов ФГГ а9 при утяжелении интраэпителиального неопластического процесса отмечен 3,5-4,5-кратный рост численности клеток с экспрессией Ki-67, что соответствует литературным данным [9-11].
Количество раковых клеток с данным маркером у больных с интраэпителиаль-ной и инфильтративной формами рака, ассоциированными с ВПЧ 16 генотипа, и с Ca in situ с сочетанием ВПЧ 16 с ВПЧ других генотипов ФГГ а9 была почти одинаковой и в 2-3 раза превышала показатели Ki-67 при раке, ассоциированном с папил-ломавирусами ФГГ а9 и ФГГ а7.
Таблица 2. Экспрессия Ki-67 в парабазальных и атипичных клетках ВПЧ-инфицированных
пациенток
Морфология Количество клеток с экспрессией Ki-67 (%)
ВПЧ 16 ВПЧ 16+а9 ВПЧ 16+а7 ВПЧ 16+а9+а6 ВПЧ а9 ВПЧ а7 ВПЧ а9+а7
Эктопия шейки матки 0 0 0 0 0 0 0
Слабая дисплазия (CIN1, LSIL) 1,6±0,3 0 0 0
Умеренная дисплазия (CIN2, HSIL) 0,8±0,2 1,3±0,2 2,8±0,3 3,6±0,4 2,8±0,3
Тяжелая дисплазия (CIN3, HSIL) 5,8±0.5 6,4±0,5 0,9±0,2 4,3±0,4 0 1±0,2
Ca in situ (CIN3, HSIL) 3,4±0,4 3,7±0,4 1,3±0,2
Плоскоклеточный рак (SCC) 3,9±0,4 0,7±0,2 1,3±0,2
В препаратах эктопии и СШ1 клеток с экспрессией СК5 не обнаружено (табл. 3), что подтверждают данные литературы [12]. В случаях ЖЩ ассоциированных с ВПЧ 16 генотипа и с его сочетаниями с ВПЧ ФГГ а9 и ФГГ а7, отмечено нарастание численности клеток с экспрессией СК5 от минимальных значений среди парабазальных до максимальных — среди поверхностных клеток МПЭ. В случаях ЖЩ ассоциированных с ФГГ а9 и ФГГ а7 и с их сочетанием, а также во всех наблюдениях SCC независимо от генотипа ВПЧ наблюдали обратную закономерность.
Таблица 3. Экспрессия СК5 в клетках МПЭ ВПЧ-инфицированных пациенток
Морфология Клетки Количество клеток с экспрессией СК5 (%)
ВПЧ16 ВПЧ 16+а9 ВПЧ 16+а7 ВПЧ 16+ а9+а6 ВПЧ а9 ВПЧ а7 ВПЧ а9+а7
Эктопия шейки матки ПК 0 0 0 0 0 0 0
Прк 0 0 0 0 0 0 0
ПБК 0 0 0 0 0 0 0
Слабая дисплазия (CIN1, LSIL) ПК 0 0 0 0
ПрК 0 0 0 0
ПБК 0 0 0 0
Умеренная дисплазия (CIN2,HSIL) ПК 65,1±0,9 0 30,9±0,9 22,9±0,8 0
ПрК 40,4±0,9 0 51,4±0,9 12,2±0,6 0
ПБК 55,2±0,9 15,7±0,7 0 37,8±0,9 50±1
Тяжелая дисплазия (CIN3, HSIL) ПК 37,5±0,9 16,9±0,7 34,5±0,9 14,3±0,7 0 0
ПрК 28,8±0,9 27,8±0,9 68,2±0,9 27,7±0,8 5,9±0,4 0
ПБК 22,8±0,8 14,6±0,7 21,6±0,8 38,7±0,9 12,6±0,7 1±0,2
Ca in situ (CIN3, HSIL) ПК 20,6±0,8 45,9±0,9 5,8±0,4
ПрК 19,5±0,8 44,2±0,9 15,5±0,7
ПБК 8,8±0,6 14,3±0,7 80,1±0,8
Плоскоклеточный рак (SCC) ПК 0 0,7±0,2 0
ПрК 0 1±0,2 0
ПБК 3,3±0,4 3,8±0,4 0,4±0,1
Примечание. ПК — клетки поверхностного слоя МПЭ; ПрК — клетки промежуточного слоя МПЭ; ПБК — парабазальные (в том числе атипичные) клетки МПЭ.
Экспрессия Ki-67 и CK5 в одних и тех же биоптатах выявлена в 4 (14,3%) случаях CIN2, в 15 (38,9%) — тяжелой дисплазии, в 15 (88,2%) — Ca in situ, в 11 (91,7%) — SCC, ассоциированных с ВПЧ ФГГ а9.
Двухъ-, семиядерные койлоциты — клетки поверхностного и промежуточного слоев МПЭ, обнаружены в 10 (52,6%) наблюдениях эктопии, в 7 (87,5%) — CIN1, в 27 (96,4%) — CIN2, в 39 (90,7%) — тяжелой дисплазии, в 16 (94,1%) — Ca in situ, в 12 (100%) — SCC соответственно. Многоядерные клетки парабазального слоя в препаратах эктопии не выявлены (табл. 4). Их наблюдали в 1 (12,5%) случае CIN1, в 21 (75%) — CIN2, в 39 (90,7%) — тяжелой дисплазии, в 14 (82,4%) — Ca in situ и во всех наблюдениях SCC. Частота выявления многоядерных клеток при HSIL в 2 раза превысила их встречаемость в наших предыдущих исследованиях [13]. Численность многоядерных клеток парабазального слоя возрастала в ВПЧ16-позитивных случаях с 0,5±0,1% в препаратах CIN1 до 6,9±0,5% при Ca in situ. Их количество при HSIL, ассоциированной с ВПЧ ФГГ а9, превышала численность койлоцитов, что, по-видимому, свидетельствует о задержке дифференцировки клеток с нарушением цитотомии. Независимо от генотипа ВПЧ их показатели при SCC не превышали 4,5±0,9%.
Таблица 4. Многоядерные клетки ВПЧ-инфицированных пациенток
Морфология Клетки Количество многоядерных клеток (%)
ВПЧ16 ВПЧ 16+а9 ВПЧ 16+а7 ВПЧ16+ а9+а6 ВПЧ а9 ВПЧ а7 ВПЧ а9+а7
Эктопия ш/ матки К 0,7±0,1 0,3±0,1 0,5±0,1 2,6±0,3 0,2±0,1 0,5±0,1 0
ПБК 0 0 0 0 0 0 0
Слабая дисплазия (CIN1, LSIL) К 0 0,5±0,1 2,2±0,3 0,7±0,1
ПБК 0,5±0,1 0 0 0
Умеренная дисплазия (CIN1, LSIL) К 0,5±0,1 1,4±0,2 0,8±0,1 1,6±0,3 1,2±0,2
ПБК 0,5±0,1 3,3±0,4 2,9±0,3 0,3±0,1 0,5±0,1
Тяжелая дисплазия (CIN3, HSIL) К 1,3±0,2 2,3±0,3 2±0,3 0,2±0,1 3,3±0,4 2,5±0,3
ПБК 0,5±0,1 3,8±0,4 0,7±0,1 1,2±0,2 9,3±0,6 4±0,4
Ca in situ (CIN3, HSIL) К 2,4±0,3 0,9±0,1 0,9±0,1
ПБК 6,9±0,5 3,9±0,4 0,7±0,1
Плоскоклеточный рак (SCC) К 2,4±0,3 2,6±0,3 2,1±0,3
ПБК 4,5±0,4 3,4±0,4 4,4±0,4
Примечание. К — койлоциты; ПБК — парабазальные (в том числе атипичные) клетки МПЭ.
Метафазу, телофазу и анафазу наблюдали в препаратах тяжелой дисплазии, ассоциированной с ВПЧ 16 и с его сочетаниями с ВПЧ ФГГ а9 и ФГГ а7, в 0,3±0,1%, 0,2±0,1% и 0,3±0,1% атипичных клеток соответственно. В случаях Ca in situ и SCC, ассоциированных с ВПЧ 16, митозы выявлены соответственно в 2,6±0,3% и 4,2±0,4% клеток рака.
При повреждениях цервикального эпителия ВПЧ 16 патологические митозы представлены k-митозами с рассеиванием или слипанием хромосом и трехполюс-ными митозами. Их наблюдали в препаратах тяжелой дисплазии в 0,5±0,1% атипичных клеток, Ca in situ — в 1±0,2%, SCC — в 2,7±0,3% опухолевых клеток, что составило соответственно 62,5±1,0%, 27,8±0,9% и 39,1±0,9% от общего числа всех митозов и в первом случае превышало, а в остальных двух — было меньше данных литературы [14].
В целом нарушения митоза в виде повреждения митотического аппарата и/или нарушения цитотомии выявлены у больных с ВПЧ 16 в 1±0,2% атипичных клеток при тяжелой дисплазии, в 7,9±0,5% клеток рака при Ca in situ и в 7,2±0,5% опухолевых клеток при SCC.
Таким образом, в результате анализа проведенных исследований установлено, что при поражении цервикального эпителия ВПЧ 16 генотипа и его комбинациями с папилломавирусами ФГГ а9 количество клеток с экспрессией Ki-67 и с его сочетан-ной экспрессией с СК5 напрямую связано со степенью повреждения цервикального эпителия. В ВПЧ16-позитивных случаях количество клеток с митозами и с их нарушениями коррелирует с тяжестью эпителиальных изменений. При HSIL, ассоциированных с ВПЧ ФГГ а9, экспрессия СК5 в клетках поверхностного и промежуточного слоев плоского эпителия свидетельствует о замедлении клеточной дифференциров-ки. При эктопии и LSIL независимо от генотипа ВПЧ нарушения митоза проявляются преимущественно нарушением цитотомии. В случаях HSIL и SCC, ассоциированных с ВПЧ 16, их дополняют повреждения митотического аппарата.
Литература
1. Costa C., Espinet B., Molina M. A. et al. Analysis of gene status in cervical dysplastic lesions and squamous cell carcinoma using tissue microarrays // Histol. Histopathol. 2009. Vol. 24, N 7. P. 821-829.
2. Doorbar J. The papillomavirus life cycle // J. Clin. Virol. 2005. Vol. 32 (Suppl. 1). S. 7-15.
3. Ramírez-Salazar E., Centeno F., Nieto K. et al. HPV16 E2 could act as down-regulator in cellular genes implicated in apoptosis, proliferation and cell differentiation // Virol. J. 2011. Vol. 20, N 8. P. 247-254.
4. Pyeon D., Pearce S. M., Lank S. M. et al. Establishment of human papillomavirus infection requires cell cycle progression // PloS. Pathog. 2009. Vol. 5, Issue 2. e1000318.
5. Ivanova P., Atanasova G., Poumay Y., Mitev V. Knockdown of PKD1 in normal human epidermal keratinocytes increases mRNA expression of keratin 10 and involucrin: early markers of keratinocyte differentiation // Arch. Dermatol. Res. 2008. Vol. 300, N 3. P. 139-145.
6. Martens J. E., Smedts F. M., Ploeger D. et al. Distribution pattern and marker profile show two subpopulations of reserve cells in the endocervical canal // Int. J. Gynecol. Pathol. 2009. Vol. 28, N 4. P. 381-388.
7. Apgar B. S., Zoschnick L., Wright Jr. T. C. The 2001 Bethesda system terminology // Amer. Famil. Physic. 2003. Vol. 68, N 15. P. 1992-1998.
8. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. WHO classification of tumours / eds F. A. Tavassoli, P. Devilee. Lyon: IARC Press, 2003. 432 p.
9. Данилова Н. В., Андреева Ю. Ю., Мальков П. Г. Дифференциальный диагноз предраковых и регенеративных изменений в эпителии шейки матки с применением иммуногистохимического исследования // Архив патологии. 2011. Т. 73, № 2. С. 10-14.
10. Короленкова Л. И., Степанова Е. В., Ермилова В. Д. и др. Экспрессия Ki-67, тимидин фосфори-лазы и PTEN в интраэпителиальной цервикальной карциноме // Вопросы онкологии. 2011. Т. 57, № 2. С. 199-203.
11. Conesa-Zamora P., Doménech-Peris A., Orantes-Casado F. J. et al. Effect of human papillomavirus on cell cycle-related proteins p16, Ki-67, Cyclin D1, p53, and ProEx C in precursor lesions of cervical carcinoma: a tissue microarray study // Am. J. Clin. Pathol. 2009. Vol. 132, N 3. P. 378-390.
12. Smedts F., Ramaekers F. C., Hopman A. H. The two faces of cervical adenocarcinoma in situ // Int. J. Gynecol. Pathol. 2010. Vol. 29, N 4. P. 378-385.
13. Ершов В. А., Лисянская А. С. Цитологические особенности высокой степени интраэпители-ального повреждения плоского эпителия шейки матки, обусловленные вирусом папилломы человека // Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. 2010. Т. 17, № 3. С. 88-89.
14. Казанцева И. А. Патология митоза в опухолях человека. Новосибирск: Наука, 1981. 114 с.
Статья поступила в редакцию 16 декабря 2013 г.
Контактная информация
Ершов Владимир Анатольевич — кандидат медицинских наук; [email protected] Чирский Вадим Семенович — доктор медицинских наук, профессор Вязовая Анна Александровна — кандидат биологических наук Нарвская Ольга Викторовна — доктор медицинских наук, профессор
Ershov Vladimir A. — Candidate of Medicine; [email protected] Chirsky Vadim S. — Doctor of Medicine, Professor Vyazovaya Anna A. — Candidate of Biology Narvskaya Olga V. — Doctor of Medicine, Professor
