CC BY
279
© коллектив авторов, 2013
УДК 618.146-006.04-02:578.827.1]-07
А.А. Бязовая1, Д.А. Куевда2, О.Б. Трофимова2, О.Ю. Шипулина2, в.А. Ершов3, Л.в. Лялина1, О.в. Нарвская1
выявление вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска и оценка физического статуса вирусной днк методом полимеразно-цепной реакции при поражении цервикального эпителия
Лаборатория молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург; 2ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; 3ГУЗ Городской клинический онкологический диспансер, Санкт-Петербург
В 116 цервикальных образцах обнаружена ДНК вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР), при этом морфологические признаки фоновых процессов выявили у 19 женщин, CIN 1 - у 9, CIN 2 - у 23, CIN 3 - у 54 (из них Carcinoma in .situ - у 13), плоскоклеточный рак (Squamous Cell Carcinoma) - у 11. Вирусная нагрузка ВПЧ ВКР во всех образцах ДНК превышала порог клинической значимости (3 lg копий ДНК ВПЧ/105 кл.). При генотипировании ВПЧ ВКР обнаружили доминирование ВПЧ-16 типа (ВПЧ-16) у 49,7%, ВПЧ-33 - у 15,3%, ВПЧ-31 - у 12,3%, ВПЧ-45 - у 5,5%. У женщин с фоновыми процессами шейки матки ДНК ВПЧ-16 чаще выявляли в эписомной форме, а при диспластических изменениях эпителия и раке шейки матки - в смешанной форме с различной степенью интеграции в клеточный геном.
Ключевые слова: вирус папилломы человека, ВПЧ-16, физический статус, интеграция
A.A. Vyazovaya, D.A. Kuyevda, O.B. Trofimova, O.Yu. Shipulina, V.A. Yershov, L.V. Lyalina, O.V. Narvskaya
THE IDENTIFICATION OF VIRUSES OF HUMAN PAPILLOMA OF HIGH CARCINOGENIC RISK AND EVALUATION OF PHYSICAL STATUS OF VIRAL DNA USING TECHNIQUE OF POLYMERASE-CHAIN REACTION UNDER AFFECTION OF CERVICAL EPITHELIUM
The Pasteur research institute of epidemiology and microbiology, St. Petersburg, Russia; The central research institute of epidemiology, Moscow, Russia; The municipal clinical oncologic dispensary, St. Petersburg, Russia
The DNA of virus of human papilloma of high carcinogenic risk was detected in 116 cervical samples. At that, the morphological symptoms of background processes are detected in 19 samples, CIN 1 in 9, CIN 2 in 23, CIN 3 in 54 (and out of them carcinoma in situ in 13), epidermoid cancer (squamous cell carcinoma) in 11 cases. The viral load of human papilloma of high carcinogenic risk in all samples ofDNA exceeded threshold of clinical value (3 lg copies ofDNA of human papilloma/105 cells). The genetic typing of human papilloma of high carcinogenic risk revealed the dominance of human papilloma of type 16 in 49.7%%, type 33 in 15.3%, type 31 in 12.3% and type 45 in 5.5%. In women with background processes in cervix of the uterus DNA of human papilloma type 16 was detected more often in episome form. In case of dysplastic alterations of epithelium and cervical cancer DNA of human papilloma type 16 is detected in mixt form with different degree of integration into cell genome.
Key words: virus of human papilloma, virus of human papilloma type 16, physical status, integration
В последние годы растет количество случаев злокачественных эпителиальных опухолей шейки матки, этиологически связанных с вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска (ВКР), в особенности ВПЧ-16-го генотипа (ВПЧ-16) [5, 16]. Согласно данным эпидемиологических исследований, проведенных Международным агентством по исследованию рака (1АГС), встречаемость и разнообразие генотипов ВПЧ ВКР значительно варьируют в разных регионах мира. В случае инвазивного рака шейки матки (РШМ) по частоте встречаемости повсеместно лидирует ВПЧ-16 (53%) [10].
Папилломавирусная инфекция (ПВИ) распространяется преимущественно контактным половым путем, поражая женщин репродуктивного возраста [3, 4, 14]. В 70% случаев ПВИ заканчивается спонтанной элиминацией вируса в течение года, а в 90% - в течение двух лет [1, 14]. С возрастом частота инфицирования ВПЧ ВКР снижается, но возрастает вероятность вирусной персистенции, которая может приводить к развитию цервикальной эпителиальной неоплазии различной степени тяжести [1, 7]. По данным ВОЗ, при отсутствии
Для корреспонденции:
Вязовая Анна Александровна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Адрес: 197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14 Телефон/факс (812)233-21-49 E-mail: elmtree2001@mail.ru
отягощающих факторов в течение трех лет морфологические поражения плоского эпителия в виде слабой дисплазии (CIN 1; Сегу1са1 intraepithelial neoplasia, цервикальная интраэпи-телиальная неоплазия) подвергаются регрессии в 50-62% случаев. У 10-20% женщин старше 30 лет персистенция ВПЧ может приводить к прогрессированию дисплазии (CIN 2-3) и РШМ [1, 14, 15]. С момента заражения ВПЧ ВКР особенно ВПЧ-16 и ВПЧ-18 до развития CIN 3 и инвазивного РШМ, как правило, проходит 15-20 лет [1, 4 ,7, 9, 14].
Обязательным этапом канцерогенеза является интеграция генома ВПЧ в хромосому хозяина, что сопровождается потерей функциональной активности вирусного гена Е2, контролирующего экспрессию онкогенов Е6/Е7, и повышением синтеза онкобелков Е6/Е7 [1, 11, 12]. В злокачественных опухолях вирусную ДНК также выявляют как в эписомной, так и в смешанной формах [6, 8].
Цель работы - оценить разнообразие генотипов ВПЧ ВКР и физический статус ДНК ВПЧ-16 при поражениях цер-викального эпителия.
Материалы и методы. В 2010-2011 гг. изучены ВПЧ-позитивные образцы цервикальных соскобов у 116 женщин в возрасте от 21 до 74 лет, находившихся на обследовании и лечении в Городском клиническом онкологическом диспансере Санкт-Петербурга. Выявление, количественное определение и генотипирование ВПЧ осуществляли с помощью тест-систем "Центрального НИИ эпидемиологии". Физический статус ДНК ВПЧ-16 генотипа определяли
БИОМАРКЕРЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ПАТОЛОГИИ
Таблица 1
Структура генотипов ВПЧ ВКР
Характеристика поражения шеики матки Генотип ВПЧ ВКР
16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59
Фоновые процессы (n = 19) 10 3 6 3 2 2 1
CIN 1 (n = 9) 5 1 2 1
CIN 2 (n = 23) 14 3 4 5 2 2 2 1 1
CIN 3 (n = 41) 31 2 11 9 1 1 3 2 1 1 1 1
CIS (n = 13) 12 1 3 1
SCC (n = 11) 9 1 1 1
Всего (n = 116) ... 81 5 20 25 3 3 9 2 5 3 4 3
методом мультиплексной полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени с использованием экспериментального комплекта реагентов "Центрального НИИ эпидемиологии" и оценивали по соотношению количества копий вирусных генов Е2/Е7 с учетом стандартного отклонения и коэффициента вариации. При эписомной форме это соотношение принимали равным 1, при 100% интеграции -0, промежуточные значения соответствовали смешанной форме вирусной ДНК (эписомная + интегрированная) [2].
Гистологические препараты, полученные в ходе электро-эксцизии шейки матки, окрашивали гематоксилином и эозином; результаты исследования формулировали в соответствии с международной классификацией [13].
Результаты и обсуждение. В цервикальных образцах у 116 женщин (21-74 лет) обнаружили ДНК ВПЧ ВКР. Морфологические признаки фоновых процессов (эктопии, эндоцер-вициты, полипы цервикального канала и шейки матки) выявили у 19 больных. Признаки CIN обнаружили у 86 пациенток: CIN 1 - у 9, CIN 2 - у 23, CIN 3 - у 54 (из них Carcinoma in situ, CIS, - у 13). Плоскоклеточный рак (Squamous Cell Carcinoma, SCC) выявили у 11 больных.
Прогностическую ценность показателя вирусной нагрузки ВПЧ ВКР однозначно не определили, однако содержание вирусной ДНК в количестве ниже определенного порогового уровня ассоциировано с высокой вероятностью спонтанной элиминации возбудителя и отсутствием риска прогрессии поражения цервикального эпителия [8]. В нашем исследовании вирусная нагрузка ВПЧ ВКР у всех женщин превышала порог клинической значимости (3 lg копий ДНК ВПЧ/105 кл.), а среднее значение количества ВПЧ ВКР во всех образцах превышало 6 lg копий ДНК ВПЧ/105 кл. Корреляции вирусной нагрузки со степенью диспластических изменений эпителия
Таблица 2
Физический статус (форма) ДНК ВПЧ-16
Характеристика Форма ДНК ВПЧ-16
поражения шейкн матки эписом- интегрированная
ная до 20% 20-40% < 100%
Фоновые процессы (n = 9) 7 (77,8) 2 (22,2) 0 0
CIN 1 (n = 5) 1 (20,0) 2 (40,0) 2 (40,0) 0
CIN 2 (n = 13) 4 (30,8) 7 (53,8) 1 (7,7) 1 (7,7)
CIN 3 (n = 29) 4 (13,8) 11 (37,9) 12 (41,4) 2 (6,9)
CIS (n = 11) 2 (18,2) 1 (9,1) 8 (72,7) 0
SCC (n = 9) 2 (22,2) 1 (11,1) 6 (66,7) 0
Всего (n = 76) ... 20 (26,3) 24 (31,6) 29 (38,2) 3 (3,9)
Примечание. В скобках указан процент.
шейки матки не установили, что согласуется с данными других исследователей [6].
Дополнительные возможности определения прогноза течения ПВИ дает генотипирование ВПЧ ВКР. Персистен-ция ВПЧ-16 и ВПЧ-31 повышала риск прогрессии CIN [7, 9]. При генотипировании 116 образцов ДНК выявили присутствие одного типа ВПЧ ВКР у 77 (66,4%) женщин, а двух типов и более - у 39. В структуре генотипов ВПЧ ВКР чаще встречали ВПЧ-16 - 49,7%, ВПЧ-33 - 15,3%, ВПЧ-31 и ВПЧ-45 - 12,3 и 5,5% соответственно (табл. 1). Частота встречаемости ВПЧ-16 возрастала от 52% при фоновых процессах до 81,8% при РШМ (см. табл. 1), что согласуется с данными литературы [6].
Прогрессирование диспластических изменений эпителия шейки матки CIN 1-3 ^ SCC сопровождалось уменьшением количества выявленных генотипов ВПЧ: ВПЧ-16 в сочетании с другими генотипами (ВПЧ-31, ВПЧ-33, ВПЧ-35, ВПЧ-39, ВПЧ-45, ВПЧ-52 или ВПЧ-58) при CIN 1-3 обнаружили у 42,6% больных, при CIS - у 27,3%, при SCC - у 11,1%.
Интеграция ВПЧ в клеточный геном является одним из основных факторов развития тяжелых дисплазий и опухолевой трансформации эпителия шейки матки [11, 12]. Физический статус и степень интеграции вирусной ДНК изучили в 76 (из 81) цервикальных образцах, содержащих ВПЧ-16 (монотип или в комбинации с другими типами) (табл. 2). В зависимости от степени интеграции вирусного генома до 20%, от 20 и более 40% частота встречаемости ВПЧ-16 в сочетании с другими типами составила 48 и 26% соответственно.
При фоновых процессах ДНК ВПЧ-16 чаще (77,8%) находилась в эписомной форме (см. табл. 2). Частота выявления эписомной формы при прогрессировании диспластических изменений CIN 1 ^ SCC в среднем составила 21%. Смешанная форма ДНК ВПЧ-16 преобладала при CIS (81,8%) и SCC (77,8%). Аналогичные данные получены и другими исследователями [6, 8].
При CIS (72,7%) и SCC (66,6%) степень интеграции ДНК ВПЧ превышала 20% (см. табл. 2). У трех пациенток (CIN 2-3) наблюдали 100% интеграцию ДНК ВПЧ-16 (монотип).
Заключение. У всех пациенток с морфологическими признаками поражения цервикального эпителия различной степени выявили клинически значимое количество ДНК ВПЧ ВКР (более 3 lg копий ДНК ВПЧ/105 кл.), преимущественно ВПЧ-16, ВПЧ-33, ВПЧ-31 и ВПЧ-45. Частота встречаемости ВПЧ-16 у больных плоскоклеточным РШМ превышала 80%. У женщин с фоновыми процессами шейки матки ДНК ВПЧ-16 чаще обнаруживали в эписомной форме, а при диспласти-ческих изменениях эпителия и РШМ - в смешанной форме с различной степенью интеграции в клеточный геном.
Необходимы планомерные комплексные цитологические, молекулярно-генетические и морфологические исследования представительных выборок с целью оценки физического статуса ДНК ВПЧ ВКР и разработки надежных критериев прогноза течения ПВИ у инфицированных ВПЧ ВКР.
ЛИТЕРАТУРА
1. Киселев Ф.Л. Инфекции и рак. Практическая онкология. 2011; 12
(2): 62-5.
2. Куевда Д.А., ЕрмаковаН.В., Шипулина О.Ю. и др. Сборник трудов "Генодиагностика инфекционных болезней - 2007" / под ред. В.И. Покровского. Т. 3. М.: Университетская книга, Паис; 2007.
3. Лялина Л.В. Организация и проведение скрининга на наличие онкогенных вирусов папилломы человека в целях профилактики злокачественных новообразований органов репродуктивной системы. Методические рекомендации. СПб.; 2005.
4. Прилепская В.Н., Кондриков Н.И., Бебнева Т.Н Значение вирусов папилломы человека в развитии диспластических процессов шейки матки. Гинекология. 2000; 2 (3): 80-2.
5. Bosch F.X., Munoz N. The viral etiology of cervical cancer. Virus Res. 2002; 89: 183-90.
6. Briolat J., Dalstein V., SaunierM., JosephK., Caudroy S. HPV prevalence, viral load and physical state of HPV-16 in cervical smears of patients with different grades of CIN. Int. J. Cancer. 2007; 121 (10): 2198-204.
7. Chen H., Schifman M., Lin C., Pan M., You S., Chuang L., Hsieh C., Liaw K., HsingA., Chen C. Persistence of type-specific human papillomavirus infection and increased long-term risk of cervical cancer. J. Natl. Cancer Inst. 2011; 21 (103): 1387-96.
8. Cricca M., Morselli-Labate A., Venturoli S., Ambretti S., Gentilomi G., Gallinella G., Costa S., Musiani M., Zerbini M. Viral DNA load, physical status and E2/E6 ratio as markers to grade HPV16 positive women for high-grade cervical lesions. Gynecol. Oncol. 2007; 106
(3): 549-57.
9. InsingaR., Perez G., Wheeler C., KoutskyL., GarlandS., LeodolterS. et al. Incident cervical HPV infections in young women: transition probabilities for CIN and infection clearance. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2011; 20 (2): 287-96.
10. IARC Working Group on the evaluation of carcinogenic risks to humans. Human papillomaviruses. IARC Monogr. Eval. Carcinog. Risks Hum. 1995; 64: 1-378.
11. Jeon S., Allen-Hoffmann B., Lambert P. Integration of human papillomavirus type 16 into the human genome correlates with a selective growth advantage of cells. J. Virol. 1995; 69 (5): 2989-97.
12. Munger K., Baldwin A., Edwards K., Hayakawa H., Nguyen C., Owens M., Grace M., Huh Ket. Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. J. Virol. 2004; 78 (21): 11 451-60.
13. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. WHO classification of tumours / Eds. F.A. Tavassoli, P. Dev-ilee. Lyon: IARC Press; 2003.
14. StanleyM. Pathology and epidemiology of HPV infection in females. Gynecologic Oncology. 2010: S5-S10.
15. TrottierH., MahmudS., Lindsay L., JenkinsD., Quint W., WietingS., SchuindA., FrancoE. Persistence of an incident human papillomavirus infection and timing of cervical lesions in previously unexposed young women. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2009; 18 (3): 854-62.
16. zurHausenH. Papillomaviruses in the causation of human cancers -a brief historical account. Virology. 2009; 384 (2): 260-5.
REFERENCES
1. Kiselev F.L. Infections and Cancer. Practical Oncology. 2011; 12 (2): 62-5 (in Russian).
2. Kuevda D.A., Ermakova N.V., Shipulina O.Yu., Minkina G.N., Kisel-eva V.I., Shinkarkina A.P. A high viral load and HPV integration into the human genome as molecular markers of dysplastic changes in the cervix. In: Molecular diagnostics. 2007: Proc. 6th All-Russian scientific-practical conference with international participation. Moscow; 2007; 3: 130-2 (in Russian).
3. Lyalina L.V. Organizing and conducting screening for oncogenic human papillomavirus to prevent cancers of the reproductive system. St. Petersburg; 2005: 28 (in Russian).
4. Prilepskaya V.N., Kondrikov N.I., Bebneva T.N The significance of human papillomavirus in the development of cervical dysplastic processes. Gynecology. 2000; 2 (3): 80-2 (in Russian).
5. Bosch F.X., Munoz N. The viral etiology of cervical cancer. Virus Research. 2002; 89: 183-90.
6. Briolat J., Dalstein V., Saunier M., Joseph K., Caudroy S. HPV prevalence, viral load and physical state of HPV-16 in cervical smears of patients with different grades of CIN. International Journal of Cancer. 2007; 121 (10): 2198-204.
7. Chen H., Schifman M, Lin C, Pan M., You S., Chuang L. et. al. Persistence of type-specific human papillomavirus infection and increased long-term risk of cervical cancer. Journal of the National Cancer Institute. 2011; 21 (103): 1387-96.
8. Cricca M., Morselli-Labate A., Venturoli S., Ambretti S., Gentilomi G., Gallinella G. et. al. Viral DNA load, physical status and E2/E6 ratio as markers to grade HPV16 positive women for high-grade cervical lesions. Gynecologic Oncology. 2007; 106 (3): 549-57.
9. Insinga R., Perez G., Wheeler C., Koutsky L., GarlandS., Leodolter S. et. al. Incident cervical HPV infections in young women: transition probabilities for CIN and infection clearance. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 2011; 20 (2): 287-96.
10. Human papillomaviruses. IARC Working Group on the evaluation of carcinogenic risks to humans. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 1995; 64: 1-378.
11. Jeon S., Allen-Hoffmann В., Lambert P. Integration of human papillomavirus type 16 into the human genome correlates with a selective growth advantage of cells. Journal of Virology. 1995; 69 (5): 2989-97.
12. Munger K., Baldwin A., Edwards K., HayakawaH., Nguyen C., Owens M., et al. Mechanisms of human papillomavirus-induced oncogenesis. Journal of Virology. 2004; 78 (21): 11 451-60.
13. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs. WHO classification of tumours. Eds. F.A. Tavassoli, P. Devilee. Lyon: IARC Press; 2003: 432.
14. StanleyM. Pathology and epidemiology of HPV infection in females. Gynecologic Oncology. 2010: S5-S10.
15. TrottierH., MahmudS., Lindsay L., JenkinsD., Quint W., WietingS. et. al. Persistence of an incident human papillomavirus infection and timing of cervical lesions in previously unexposed young women. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 2009; 18 (3): 854-62.
16. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers -a brief historical account. Virology. 2009; 384 (2): 260-5.
Поступила 12.02.13
