CC BY
150 | Л.И. Андреева, П.Д. Шабанов, Б.А. Маргулис, И.В. Гужова, Д.В. Никифорова |
© Андреева Л.И., Шабанов П.Д., Маргулис Б.А., Гужова И.В., Н Никифорова Д.В., 2005
ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА
с молекулярной массой 70 кДа
Л.И. АНДРЕЕВА, П.Д. ШАБАНОВ, Б.А. МАРГУЛИС, И.В. ГУЖОВА, Д.В. НИКИФОРОВА
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
Андреева Л.И., Шабанов П.Д., Маргулис Б.А., Гужова И.В., Никифорова Д.В.
Центральные эффекты белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. // Психофармакол. и биол. наркол. 2005. Т. 5. № 1. С. 794-803. Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия.
В работе исследовали действие препарата белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70), выделенного из мышцы быка и состоящего из двух изоформ белка: индуцибельной
(НБР70) и коститутивной (НБС70), на поведение самцов белых беспородных крыс и крыс линии Вистар в условиях обычного содержания и при стрессе. Показано, что при введении в большую цистерну головного мозга наблюдается ингибирующее действие на исследовательскую и двигательную активность животных с одновременным ростом эмоционального компонента. Эф-
фекты той же направленности наблюдали и при интраназальном введении БТШ70. В случае психоэмоционального и физического стресса двойное интраназальное введение БТШ70 приводило к ограничению манифестации стресс-реакции, судя по поведению и биохимическим показателям. Одним из возможных механизмов действия экзогенного БТШ70 является ограничение моноаминергичес-кой синаптической передачи.
V.Ключевые слова: препарат БТШ70, стресс, поведение, ме-■ ханизмы действия.
Andreeva L.I., Shaba-nov P.D., Margulis B.A., Guzhova I.V., Nikiforova D.V. Central effects of heat shock protein with molecular weight 70 kDa. //Psychophar-macol. Biol. Narcol. 2005. Vol. 5. № 1. P. 794-803. S.M. Kirov Military Medical Academy; Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia.
The paper is devoted to investigation of heat shock protein 70 kDa preparation, consisting of inducible (HSP70) and constitutive (HSC70) isoforms, from bovine muscle action on behaviour of white unbreeded and Wistar rats males in ordinary conditions and in stress. It was shown that injections of HSP70 preparation into cisterna magna led to dose-dependent inhibitory action on exploratory and motor activity with growing emotionality. Effects of the same direction were observed when HSP70 was administrated intranasally. Under psycho-emotional and physical stress double intranasal administration of HSP70 preparation led to limitation of stress-reaction which was seen from behaviour testing and biochemical indexes. One of the possible mechanisms of exogenic HSP70 action is limitation of monoaminergic synaptic transduction.
Key words: HSP70 preparation, stress, behaviour, mechanisms of action.
Среди многочисленных белков-шаперонов (белков теплового шока, БТШ) выделяют полиген-ное семейство белков с молекулярной массой 70кДа (БТШ70) [5]. Наиболее важным свойством белков семейства БТШ70 является их шаперонная активность или способность связывать поврежденные, денатурированные белки и вновь синтезированные полипептиды. Результатом такого связывания может стать исправление формы данного белка, транспорт его из цитоплазмы в другие клеточные органеллы или представление полипептида белок-модифициру-ющим или деградирующим системам, например, лизосомам. Шаперонная активность БТШ70 модулируется белками-помощниками или ко-шапе-
ронами, связанными с молекулой БТШ70, нуклеотидами, содержанием одно- и дивалентных ионов, а также концентрацией белков-мишеней. В каждой клеточной органелле высших животных имеется свой шаперонный механизм, действие которого основано на определенном члене семейства БТШ70. Одним из наиболее примечательных свойств БТШ70 является защитная функция, которую белок демонстрирует в ходе реакции клетки или организма на действие различных неблагоприятных факторов среды. Получено много доказательств протективного эффекта БТШ70, и по этой проблеме написаны сотни работ и несколько десятков монографий. Наиболее убедительные аргументы в пользу за-
щитной функции БТШ70 получены в экспериментах по введению в клетки самого белка или его гена, после чего оценивалась устойчивость клеток к повреждающим факторам. Выяснилось, что про-тективный эффект БТШ70 зависит от дозы белка, полученной данной клеткой, и проявляется по отношению к множеству факторов, в частности тех, которые вызывают программированную клеточную смерть, апоптоз.
В настоящее время интерес к цитозащитным свойствам белков-шаперонов выходит за рамки сугубо биологических исследований. Результаты экспериментов последних 10-15 лет, выполненных, в основном, на клеточных культурах и экспериментальных животных, дали возможность представить несколько направлений практического использования защитных свойств БТШ70 [1]. Во-первых, устойчивость клетки, так и организма в целом, можно повысить путем увеличения внутриклеточного содержания БТШ70. Последнее может быть достигнуто в результате прекондицио-нирующих процедур (дозированное нагревание, гипоксия), под действием лекарственных препаратов, после трансфекции клеток геном БТШ70. Во-вторых, в последнее время привлекает внимание вопрос о защитных свойствах внеклеточного БТШ70. Уже в конце 1980-х гг. было обнаружено, что БТШ70 может покидать клетки глии моллюсков [29], эмбриональные клетки крысы [21] и выходить во внеклеточный матрикс. Сходные данные были получены при анализе белков, выходящих из клеток глиомы человека [19]. Оказавшись во внеклеточной среде, БТШ70 может взаимодействовать с соседними клетками, например, нейронами и защищать их от гибели [22]. Защитный эффект экзогенного БТШ70 при действии индуцирующего апоптоз фактора некроза опухолей был показан также И.В. Гужовой и соавторами на линии клеток миелоидной лейкемии человека и-937 [18]. Таким образом, БТШ70, добавленный к клеткам извне, способен защищать их сходным с внутриклеточным белком образом. На тканевом уровне также было показано, что препарат БТШ70, состоящий из смеси двух изоформ: инду-цибельной (БТШ70и, НЯР70) и конститутивной (БТШ70к, НЯС70), при введении в глаз крысы поглощался сетчаткой и защищал фоторецепторы при и их повреждении светом [30]. На срезах мозга мыши было показано, что рекомбинантный НЯР70, добавленный в инкубационную среду, имитировал защитный эффект теплового прекон-диционирования, который заключался в нормализующем действии на миниатюрные синаптические токи, вызываемые гамма-аминомасляной кислотой, глутаминовой кислотой и глицином [24].
Взаимодействие БТШ70 с клеточной поверхностью и его поглощение было показано для нескольких типов клеток различного происхождения. В центральной нервной системе экзогенный БТШ70, вероятно, может взаимодействовать с глиальными клетками и нейронами. Иммуногистохимически показано, что обе изоформы БТШ70 в наибольшей степени представлены в синапсах. Однако, основная роль в функционировании эндо- и экзоцитоза синаптических пузырьков принадлежит HSC70 [31]. В коре мозга и гиппокампе крысы HSC70 является основным компонентом постсинаптической мембраны, а также связан с аморфными субсинаптическими структурами и цистернами шипикового аппарата. HSP70 обнаружен лишь в небольших количествах в постсинаптической мембране. Обе изоформы БТШ70 можно считать синаптическими маркерами [26]. Кроме того, они обнаружены в достаточном количестве в астроглие. Таким образом, можно предполагать, что БТШ70, может покидать клетки паренхимы мозга и поглощаться ими. Присутствие БТШ70 в синапсах предполагает его причастность к их функционированию и, возможно, к модуляции синаптической передачи. Наконец, необходимо дополнить картину взаимодействием внеклеточного БТШ70 со специализированными Toll-like рецепторами (TLR-2 и TLR-4), связанными с CD14 [15, 16] на поверхности микроглиальных клеток, имеющих мезенхимальное происхождение, которые традиционно считаются специализированными макрофагами ЦНС. В результате такого взаимодействия клетки микроглии активируются, что приводит к увеличению синтеза провоспалитель-ных цитокинов. Последнее может иметь место и при центральном введении экзогенного БТШ70. Положительной стороной активации микроглии БТШ70 может быть увеличение фагоцитоза и очищение межклеточного пространства от амилоидных отложений [23]. Таким образом, нельзя игнорировать еще одно очевидное свойство внеклеточного БТШ70: его процитокиновый эффект. Этот свойство присуще не только БТШ70, но и другим шаперонам, таким как БТШ90, БТШ32. Для внеклеточного БТШ70 был предложен новый термин «шаперокин» [14]. В отличие от внеклеточного БТШ70 увеличение экспрессии и/или содержания внутриклеточного БТШ70 вызывает торможение передачи пролиферативных, апопто-тических, воспалительных сигналов [20].
Таким образом, исходя из шаперонных и защитных свойств БТШ70, мы вправе ожидать от применения препаратов на его основе (рекомбинантный белок или отдельные пептиды) нейро-
протекторных эффектов. Однако предстоит выяснить, каким образом будет влиять экзогенный БТШ70 на состояние и функции ЦНС при его взаимодействии со всем клеточным ансамблем паренхимы мозга. С этой целью нами были предприняты эксперименты на целых животных. Необходимо отметить, что отдельные представители семейства белков БТШ70 являются высоко консервативными: межвидовое сходство структуры продуктов одного гена больше, чем сходство между разными представителями этих белков в пределах одного вида. Так, например, два гена Изр70-1 и Изр70-2 идентичны у крысы и человека [17]. Нами был использован препарат БТШ70, выделенный из мышцы быка, который состоял из смеси конститутивной и индуцибельной изоформ белка (НЯС70 и НЯР70).
МЕТОДИКА
В экспериментах использовали самцов белых беспородных крыс и самцов линии Вистар в возрасте 3-4 мес массой 200-250 г. Препарат БТШ70, содержащий две его изоформы (НЯР70 и НЯС70), был получен из бедренной мышцы быка двухступенчатой хроматографией с последующим высаливанием [5, 25]. Чистота и гомогенность препарата были проверены с помощью электрофореза и иммуноблотинга. Препарат БТШ70 вводили в большую цистерну головного мозга ненаркотизированным животным в объеме 10 мкл и максимальной дозе 10 мкг с помощью дозирующего устройства. Использовали также интраназальный способ введения препарата по 5 мкл в каждую ноздрю в количестве не более 20 мкг. В качестве препарата сравнения служил бычий сывороточный альбумин (БСА).
Стресс, имитирующий ситуацию «заложника», вызывали отсаживанием животных на сутки в отдельные клетки без пищи и воды с последующей фиксацией спиной вверх на специальных станочках в течение 5 ч. За час до освобождения и через час после животным вводили интраназально препарат БТШ70. Контрольным стрессированным животным закапывали физиологический раствор. Через 2 и 20 ч после освобождения производили оценку пространственно-ориентировочной и исследовательской активности животных, после чего производили забор материала на биохимические анализы. В сыворотке крови определяли биохимические показатели с помощью автоматических анализаторов, определяли тиол-ди-сульфидное соотношение [9], содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кисло-
той [2]. Образцы ткани среднего мозга и печени замораживали в жидком азоте, где в последствии определяли продукты, реагирующие с ти-обарбитуровой кислотой и содержание эндогенных HSP70 и HSC70 с помощью Western blotting анализа.
Поведенческие реакции оценивали в тестах «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», соединенных между собой светлой и темной камерах [8, 12].
Психомоторный стимулятор фенамин (амфетамин) вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг через час после введения 5 мкг БТШ70 в cisterna magna. Через 1 ч после введения фенамина исследовали поведенческие реакции.
Каждая группа крыс состояла из 6-8 животных, достоверность выявленных различий оценивалась методами вариационной статистики.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Первые эксперименты с нестрессированными животными при введении в большую цистерну головного мозга различных количеств БТШ70 (1,2; 5; 6; 10 мкг) обнаружили зависимый от дозы возрастающий ингибирующий эффект. В тесте «открытое поле» это выражалось в уменьшении горизонтальной двигательной активности (числа пересеченных квадратов), вертикальной двигательной активности (количество стоек), исследовательской активности (количество заглядываний в «норки»). В совокупности наблюдаемые изменения свидетельствовали о возрастании тревожности. При этом введение максимальной дозы БТШ70 (10 мкг) приводило к увеличению числа болюсов дефекации на 48%, что считается признаком, характеризующим повышенную эмоциональность. Под воздействием БТШ70 дозозависимо уменьшались чистка и гру-минг. Животные больше оставались на свету: время до ухода в темную камеру увеличивалось в 1,5-2 раза.
Отмеченные явления достигали наибольшей выраженности при максимальной дозе введенного препарата БТШ70 (10 мкг). В ряде случаев через 2 ч после ведения белка у крыс развивалась сонливость, нарушение координации, животные переставали есть. При этом температура тела снижалась на 2-3 °С. Крысы медленно, постепенно, спустя сутки, выходили из этого состояния, напоминающего нейролепсию. Сходные изменения наблюдали также при введении в большую цистерну головного мозга липополиса-харида E. coli в количестве 0,1-1,0 мкг. Описанные явления никогда не наблюдались при
введении крысам бычьего сывороточного альбумина в дозе 10 мкг.
Интересно, что в случае трехкратного интра-назального введения препарата БТШ70 мы также получили изменения поведения животных той же направленности. При этом также уменьшался груминг на 32% и значительно повысилась эмоциональность: число болюсов дефекации выросло в 5,5 раза (с 0,6 до 3,3 на каждое животное, р < 0,01). Крысы также в 2 раза дольше задерживались в светлом отсеке в тесте «свет — темнота». Таким образом, разные способы введения БТШ70 приводят к однонаправленным изменениям поведенческих реакций у крыс. Необходимо отметить, что наблюдаемые нами изменения поведения развивались через 2-3 ч после введения препарата БТШ70. Визуальное наблюдение за животными, находящимися в клетке, в течение первых 30 мин после интраназального введения белка, наоборот, показало, что крысы были более подвижными, чем животные, которым вводили физиологический раствор. Устойчивый ингибирующий эффект в результате введения БТШ70 достигался спустя латентный период времени.
Выявленные нами изменения поведенческой активности во многом напоминают таковые, которые происходят у крыс в условиях стресса, когда значительно увеличивается время замираний (фри-зинга) и уменьшается число выходов в центр поля по сравнению с контрольными животными, что, считают, является отражением повышенной тревожности.
Суммируя приведенные данные, можно заключить, что введение нестрессированным крысам двумя способами препарата БТШ70 вызывает изменения поведенческих реакций, напоминающее таковое при некоторых ситуациях стресса (рис. 1). Таким образом, есть основания считать, что экзогенный белок БТШ70 оказывает действие на центральную нервную систему, выражаемое в
увеличении эмоциональности и угнетении двигательной и исследовательской активности. Нейро-медиаторные и нейроэндокринные механизмы этого эффекта требуют дальнейшего изучения.
Учитывая отмеченное ингибирующее действие БТШ70 на поведение животных и имея в виду цитопротекторные свойства белка, мы изучили воздействие двукратного интраназального введения БТШ70: первый раз на фоне вызванного психоэмоционального и физического неизбегаемого стресса, имитирующего ситуацию «заложника», и второй раз после его окончания. Изменения поведения крыс в контрольной группе через 2 ч после освобождения свидетельствовали о состоянии повышенной возбудимости животных. Так, движения животных в «открытом поле» носили беспорядочный ажитированный характер. Животные были одинаково подвижны в течение всего времени тестирования. В отличие от нестрессирован-ных крыс они совершали в 2 раза больше горизонтальных перемещений, делали в 3 раза больше стоек, в 2 раза чаще заглядывали в норки и неоднократно выходили в центр поля. Данная модель стресса привела к перевозбуждению животных. В отличие от контрольной группы крысы опытной группы (с интраназальным введением БТШ70) заметно отличались. Через 2 ч после освобождения они совершали меньше двигательных и исследовательских актов, а по ряду показателей приближались к нестрессированным животным (рис. 2). Через 20 ч крысы контрольной группы (введение физиологического раствора) уже вели себя достаточно спокойно, зато крысы опытной группы (введение БТШ70) становились более активными, но в отличие от поведения крыс контрольной группы, тестированных через 2 ч после окончания стресса, их движения носили более спокойный характер. Таким образом, интрана-зальное введение БТШ70 привело к снятию излишнего возбуждения вследствие перенесенного стресса, а на следующий день крысы данной груп-
Рис. 1.
Общая направленность изменений поведенческой активности крыс при различных способах введения экзогенного БТШ70 и при стрессе. За 100% приняты значения характеристик поведенческих реакций у контрольных животных.
Рис. 2.
Результаты тестирования поведения крыс в «открытом поле» через 2 и 20 ч после окончания психоэмоционального и физического стресса.
1 — нестрессированные животные, 2 — введение физиологического раствора (контроль), 3 — введение препарата БТШ70. По оси ординат — количество отдельных актов поведенческих реакций в течение 3 минут.
* — р < 0,05; ** — р < 0,01.
пы находились в состоянии повышенной активности, при этом нервозный компонент был не выражен.
Данные биохимического анализа сыворотки крови животных показали, что перенесенный стресс вызвал гормональные изменения, оказал катаболическое действие, увеличил проницаемость клеточных мембран во всех группах животных (табл. 1). Так, особенно отчетливо увеличилась активность аспартат- и аланинаминот-рансфераз, снизилось содержание тироксина. Через 2 ч после прекращения воздействия в 1,52,0 раза увеличилось содержание мочевины, имелась тенденция к увеличению содержания креа-тинина, глюкозы. Последствия перенесенного стресса сказывались и через 20 ч после его окончания. Наиболее выраженные изменения произошли в отношении увеличении уровня фермен-темии. Уровень глюкозы, тироксина, фосфата снизился до значений, более низких, чем у не-стрессированных животных. Содержание мочеви-
ны и креатинина возвращалось к уровню, характерному для нестрессированных животных. А концентрация электролитов (калия, натрия и хлора), наоборот, увеличивалась. Концентрация общих сульфгидрильных групп непосредственно после окончания стресса увеличивалась, а на следующий день снижалась ниже обычного уровня, характерного для нестрессированных животных, при этом, соответственно, увеличивалось содержание дисульфидов.
Судя по отсутствию достоверных различий в количестве сульфгидрильных групп и дисульфидов в сыворотке крови на одних и тех же сроках между контрольной и опытной группами, можно предполагать, что введение БТШ70 не повлияло на состояние свободно-радикальных процессов при стрессе. То есть, видимо, активация свободно-радикальных процессов, рост напряжения ан-тиоксидантных систем с последующим истощением и сдвигом в сторону увеличения окисленных продуктов произошли в начальный период стрес-
са. Об этом же свидетельствуют данные по содержанию продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), в печени животных. Так, у нестрессиро-ванных крыс содержание ТБК продуктов составило 201 ± 112 нмоль/г ткани; через 2 ч после стресса в контрольной и опытной группах —
419 ± 269 и 416 ± 121 нмоль/г; через 20 ч — 467 ± 339 и 601 ± 322 нмоль/г соответственно. Интересно, что в среднем мозге мы не обнаружили увеличения содержания ТБК продуктов. В группе нестрессированных крыс оно было 232 ± 52 нмоль/г; через 2 ч после стресса в контрольной и опытной группах — 232 ± 45 и
Таблица 1
Биохимические показатели в сыворотке крови крыс после перенесенного психоэмоционального и физического стресса
П оказатель И нтактные ж и вотные (1) Стресс + физиологический раствор Стресс + БТШ 70
Ч ерез 2 часа (2) Ч ерез 20 часов (3) Ч ерез 2 часа (4) Ч ерез 20 часов (5)
Креатинфосфокина-за, и/л 4306 ± 1766 4053 ± 1691 5099 ± 929 р1,3 < 0,05 р3,5 <0,01 3790 ± 3258 2663 ± 1502 р1,5 < 0,01 р3,5 < 0,01
Аспартатаминотран -сфераза, и/л 176 ± 30 295 ± 50 р1,2 < 0,01 р2,4 < 0,05 423 ± 328 438 ± 138 р1,4 < 0,01 р2,4 < 0,05 372 ± 185 р1,5 < 0,05
Аланинаминотран-сфераза, и/л 50 ± 10 64 ± 19 84 ± 29 р1,3 < 0,05 91 ± 27 р1,4 < 0,01 73 ± 26
Л ак татдег и дрог еназа, И/л 950 ± 322 729 ± 106 1283 ± 1102 888 ± 355 1045 ± 175
Глюкоза, ммоль/ л 9,3 ± 2,1 9,8 ± 1,5 р2,3 < 0,05 р2,5 < 0,05 8,1 ± 1,0 р2,3 < 0,05 9,6 ± 1,5 р4,5 < 0,05 7,6 ± 1,1 р2,5 < 0,05 р4,5 < 0,05
Мочевина, ммоль/ л 4.4 ± 0,5 8,6 ± 3,1 р1,2 < 0,05 р2,3 < 0,05 4,7 ± 1,9 р2,3 < 0,05 6,7 ± 1,6 р1,4 < 0,01 5,2 ± 1,8
Креатинин, мкмоль/ л 17,0 ± 4,8 25,9 ± 15,2 23,5 ± 6,9 21,3 ± 8,5 19,2 ± 4,1
Кальций, ммоль/ л 2,24 ± 0,23 2,58 ± 0,5 р2,4 < 0,05 2,38 ± 0,16 2,24 ± 0,14 р2,4 < 0,05 2,40 ± 0,12
Фосфат, ммоль/ л 2,40 ± 0,33 2,18 ± 0,33 1,94 ± 0,39 р1,3 < 0,05 2,15 ± 0,19 1,75 ± 0,30 р1,5 < 0,01
Тироксин, мг % 4,97 ± 0,08 4,48 ± 0,97 р2,3 < 0,05 3,70 ± 0,55 р1,3 < 0,01 р2,3 < 0,05 3,60 ± 0,95 р1,4 < 0,05 4,09 ± 0,43 р1,5 < 0,01
Калий, ммоль/ л 6,8 ± 0,7 6,5 ± 0,5 7,2 ± 0,3 6,4 ± 0,9 7,6 ± 1,0
Натрий, ммоль/ л 145 ± 9 148 ± 2 р2,3 < 0,05 р2,5 < 0,05 155 ± 8 р1,3 < 0,05 р2,3 < 0,05 147 ± 6 159 ± 15 р2,5 < 0,05
Хлор, ммоль/ л 105 ± 12 109 ± 2 115 ± 8 108 ± 3 119 ± 11 р1,5 < 0,05
ЯИ-группы, мкмоль/ л 237 ± 23 332 ± 123 р1,2 < 0,05 р2,3 < 0,05 198 ± 42 р1,3 < 0,05 р2,3 < 0,05 р3,4 < 0,05 268 ± 62 р3,4 < 0,05 188 ± 123
ЯЯ-связи, мкмоль/ л 163 ± 25 171 ± 47 182 ± 64 153 ± 25 р4,5 < 0,05 192 ± 10 р1,5 < 0,05 р4,5 < 0,05
Тиолди сул ьфидное соотношение 1,49 ± 0,34 2,05 ± 0,78 р2,5 < 0,05 1,14 ± 0,35 1,75 ± 0,49 р4,5 < 0,05 0,98 ± 0,57 р2,5 < 0,05 р4,5 < 0,05
Рис. 3.
Содержание HSP70 в образцах ткани среднего мозга и печени крыс (Western blotting).
1, 2, 3 — нестрессированные животные; 4, 5, 6 — через 2 ч после стресса (контроль); 7 8, 9 — через 2 ч после стресса (БТШ70); 10, 11, 12 — через 20 ч после стресса (контроль); 13, 14, 15 — через 20 ч после стресса (БТШ70).
200 ± 111 нмоль/г; через 20 ч — 220 ± 95 и 203 ± 59 нмоль/г соответственно.
Интраназальное введение стрессированным животным БТШ70 отразилось на уменьшении концентрации кальция в сыворотке крови сразу после стресса, тенденцией к уменьшению концентрации мочевины и креатинина по сравнению со стрессированными животными, которым вводили физиологический раствор. А на следующий день отмечали уменьшение уровня креатинфос-фокиназы, тенденцию к уменьшению лактатде-гидрогеназы. То есть, несмотря на то, что БТШ70 вводили в конце стрессорного воздействия и после его окончания, удалось выявить защитное действие препарата, судя по благоприятным изменениям ряда биохимических показателей.
Еще одним доказательством защитного действия экзогенного БТШ70 уже на тканевом и клеточном уровне явились результаты иммуно-блотинга проб, полученных из среднего мозга и печени. На рис. 3 видно, что содержание инду-цибельной изоформы, HSP70, которое в норме у крыс крайне незначительное, увеличивается после стресса в печени и среднем мозге животных. Двукратное интраназальное введение БТШ70 приводит к уменьшению содержания HSP70. Увеличение в клетках содержания, прежде всего, индуцибельной изоформы белка, выполняющего защитную роль, одновременно рассматривают и как маркер стресса. На основании полученных нами данных можно заключить, что применение экзогенного БТШ70 в ситуации развившего острого стресса уменьшает проявление стресс-реакции на организменном и клеточном уровне.
Для выяснения одного из возможных механизмов центрального действия экзогенного БТШ70, обуславливающих уменьшение возникшего возбуждения, мы использовали стимуляцию ЦНС фенамином. Известно, что фенамин активирует высвобождение, прежде всего, дофами-
на, а также норадреналина из гранул пресинапти-ческих нервных окончаний, тем самым стимулируя центральные постсинаптические дофаминовые и норадреналиновые рецепторы. Предполагают также, что фенамин незначительно ингибирует моноаминоксидазу и тормозит обратный захват дофамина и норадреналина, обеспечивая их более длительное нахождение в синаптической щели. В значительной степени стимулирующее действие
Таблица 2
Влияние предварительного введения в большую цистерну головного мозга БТШ70 на изменение поведенческих реакций через 1 час после введения фенамина
Открытое поле
Элементы поведен-ческ их реакций ФБ (1) Ф Б-Ф ен (2) Б ( со Е 7 О БТШ 70-Ф ен (4)
ЧПК 20 ±14 40 ± 12 р1,2 < < 0,05 20 ± 9 Р 2,3 < < 0,05 24 ± 10 Р 2,4 < < 0,05
ВДА 5,4 ± 4,5 6,6 ± 6,0 4,0 ± 3,7 4,7 ± 4,1
ИА 4,6 ± 3,3 8,6 ± 4,1 3,8 ± 3,7 3,7 ± 2,9
Г руминг 3,8 ± 2,5 1,8 ± 2,05 2,2 ± 2,05 3,5 ± 1,2
Болюсы деф. 2,0 ± 2,9 0,6 ± 1,2 1,2 ± 1,6 3,6 ± 2,9
Приподнятый крестообразный лабиринт
П оказатель 1 2 3 4
Время в от -крытых ру -кавах, с 138 ± 121 72 ± 64 99 ± 117 74 ± 118
Свешивания 3,0 ± 2,9 7,8 ± 3,3 р 1,2 < < 0,05 7,4 ± 5,8 5,7 ± 4,9
Выляды ва-ния 0,4 ± 0,4 5,8 ± 3,3 Р 1,2 < < 0,01 1,8 ± 2,05 3,0 ± 2,5 Р 1,4 < < 0,05
Свет-темнота
П оказатель 1 2 3 4
Время пребывания в светлой камере 10,3 ± 4,9 21,2 ± 2,9 Р 1,2 < < 0,01 13,8 ± 7,4 Р 2,3 < < 0,05 8,0 ± 3,7 Р 2,4 < < 0,01
Выгляды ва-ния 2,2 ± 3,7 5,0 ± 2,05 3,4 ± 2,05 6,0 ± 2,5
Переходы свет-темнота 1,0 ± 1,2 2,6 ± 1,6 1,2 ± 1,2 1,0 ± 0,1 Р 2,4 < < 0,05
фенамина обусловлено его влиянием на стволовую часть мозга [3, 6].
В результате тестирования животных выявили изменение поведенческих реакций, активированных фенамином, на фоне предварительно введенного в большую цистерну головного мозга БТШ70 (табл. 2). Так, в тесте «открытое поле» отмечали уменьшение числа пересеченных квадратов (ЧПК), числа «стоек» (ВДА), «норок» (ИА) и, наоборот, увеличение числа болюсов дефекаций у крыс с введением БТШ70 по сравнению с животными, которым вводили фенамин на фоне интрацистернального введения фосфатного буфера (группа Фен-ФБ). В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» была отмечена тенденция к уменьшению количества свеши-ваний и выглядываний из закрытых рукавов крыс группы Фен-БТШ70 по сравнению с крысами группы Фен-ФБ, а в тесте «свет-темнота» они быстрее уходили в темную камеру и меньшее количество раз переходили из одной камеры в другую. Таким образом, экзогенный БТШ70, предварительно введенный в спинно-мозговую жидкость, отчетливо сглаживает реакцию возбуждения, вызванную фенамином. Предварительное введение в большую цистерну головного мозга препарата БТШ70 препятствует проявлению в полной мере эффектов фенамина. Пока можно предполагать существование нескольких вероятных механизмов ограничительного действия БТШ70 на психомоторную стимуляцию фенамином. БТШ70 может препятствовать высвобождению моноаминов в синаптическую щель или модулировать свойства постсинаптической мембраны таким образом, что дофаминовые и норадренали-новые рецепторы функционируют менее эффективно. Нельзя не рассматривать возможность того, что БТШ70 способствует обратному захвату моноаминов, либо активирует моноаминоксидазу. Наконец, возможно, что свой вклад в наблюдаемые эффекты вносит взаимодействие БТШ70 с микроглией, с последующей ее активацией, продукцией медиаторов воспаления, влияющих на функциональное состояние нейронов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Ингибирующий эффект БТШ70 на двигательную и исследовательскую активность крыс после его непосредственной доставки, прежде всего, к продолговатому мозге (введение в большую цистерну) может быть обусловлен угнетением синаптической передачи в норадренергических и до-фаминергических нейронах. Известно, что тела норадренергических нейронов расположены в про-
долговатом мозге и области моста, особенно в голубом пятне, то есть в структурах, близких к месту введения БТШ70. Воздействие экзогенного БТШ70 на эмоциональный компонент выражается в увеличении количества болюсов дефекаций и фризинга, что, по всей видимости, свидетельствует о влиянии БТШ70 на ядра лимбической системы мозга, где в значительной степени представлены дофаминергические нейроны [11]. Ингибирующее свойство БТШ70 по отношению к моноаминергическим системам выявляется на фоне их стимуляции фенамином.
Если бы усиление дефекаций при введении БТШ70 сопровождалось усилением уринаций, то можно было бы констатировать возникновение сильного страха. Однако мы не отметили усиления уринаций. Увеличение дефекаций связывают с повышением высвобождения кортикотро-пинрилизинг гормона [4]. Вероятно, в изменении эмоциональности также принимают участие и моноаминергические системы.
Учитывая низкую активность протеолитичес-ких ферментов в неповрежденном мозге [13], можно предполагать, что введенный БТШ70 довольно долго находится в нерасщепленном состоянии в спинно-мозговой жидкости и межклеточном пространстве. Ингибирующий эффект БТШ70 зависит от дозы и может сохраняться в течение нескольких суток, что предполагает его непосредственное связывание и довольно длительное нахождение в клетках паренхимы мозга. Однако, нужны дополнительные исследования для определения распространения и связывания введенного в ликвор БТШ70.
Еще больше вопросов возникает, каким образом осуществляется действие БТШ70 при его интраназальном введении. Обонятельная система находится в привилегированном положении по сравнению с другими сенсорными системами, и в случае обоняния передача сенсорных сигналов в лимбическую систему осуществляется поразительно прямым путем [7]. Кроме того, известно, что интраназальный способ введения отдельных пептидов, например, фрагментов ИЯРбО [27] и даже целых белков и их конструкций [28] обеспечивает их доставку в структуры головного мозга. Применительно к БТШ70 таких данных нет, и этот вопрос требует специального изучения.
Интраназальное введение БТШ70 на фоне развившегося психоэмоционального и физического стресса привело к уменьшению манифестации стресс-реакции. Причем, судя по биохимическим показателям, введение БТШ70 не повлияло на протекание произошедшей ранее активации сво-
Ç Л.И. Андреева, П.Д. Шабанов, Б.А. Маргулис, И.В. Гужова, Д.В. Никифорова ^_
ЛИТЕРАТУРА
бодно-радикальных процессов. Кроме того, данные по содержанию глюкозы, калия, натрия, хлора, кальция и фосфата, а также тироксина в сыворотке крови не позволяют говорить о воздействии экзогенного БТШ70 на выработку таких гормонов, как инсулин, вазопрессин, альдостерон, парати-реоидный и тиреоидный гормоны. Выявленные отличия касались снижения содержания кальция в опытной группе через 2 ч после стресса, тенденции к уменьшению катаболического эффекта стресса (содержание мочевины, креатинина), и снижении степени ферментемии на следующий день.
Характерной особенностью крысы является преобладание в клетках конститутивной изоформы БТШ70, НЯС70. Повышение внутриклеточного содержания НЯР70 возрастает пропорционально силе действующего на клетку стрессор-ного фактора. Мы отметили умеренное увеличение содержания НЯР70 в печени и среднем мозге стрес-сированных животных, которое уменьшилось в результате интраназального введения БТШ70. Тем самым, можно предполагать, что в данных условиях в индукции НЯР70 и ее ограничении экзогенным БТШ70 задействованы нейроэндокринные механизмы.
Анализ изменений поведения нестрессирован-ных и стрессированных крыс при введении двумя различными способами БТШ70 позволил заключить, что с увеличением количества вводимого белка нарастает ингибирование пространственно-ориентировочной и исследовательской активности с возрастанием эмоциональности, характеризуемой увеличением дефекаций и фризинга. В случае стресса, приведшего к состоянию гипервозбуждения, применение БТШ70 оказало стресслимитирующее действие. Ранее было показано, что интраназаль-ное введение препарата БТШ70 ежедневно в течение 3 дней в разовой дозе 3,25 мкг нормализует двигательную и исследовательскую активность крыс, угнетенную вследствие перенесенного неизбегаемо-го стресса: 60 ударов электрическим током в течение 1 ч [10], при этом уменьшалась тревожность животных. Сходные изменения получены нами через 20 ч после стресса, когда стрессированные крысы с последующим введением БТШ70 больше двигались и отличались пониженной тревожностью (рис. 2). Нами было обнаружено свойство экзогенного БТШ70 ограничивать моноаминовую синаптическую передачу. Таким образом, БТШ70, вводимый в большую цистерну головного мозга и инт-раназально вмешивается в нейроэндокринное и медиаторное звенья регуляции как в покое, так и при стрессе.
Работа поддержана грантом РФФИ № 03-0333024.
Андреева Л.И. Теоретическое и прикладное значение белков теплового шока 70 кДа; возможность практического применения и фармакологической коррекции. // Обзоры по клин. фармакол. и лек. терапии. 2002. Т. 1. № 2. С. 2-18.
2. Андреева Л.И., Кожемякин ЛА, Кишкун АА. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой.// Лаб. дело. 1988. № 11. С. 41-43.
3. Базисная и клиническая фармакология / Под ред. Г. Бертрама Катцунга: В 2 т.; Т. 1, М.: Бином, СПб.: Невский диалект, 1998. 612 с.
4. Калуев А.В., Макарчук Н.Е., Дерягина МА., Шишкин С.Л. Роль дефекации в поведении человека и животных. Киев: КСФ, 2001. 134 с.
5. Маргулис БА., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке.//Цитология. 2000. Т. 42. №4. С. 323-341.
6. Машковский МД. Лекарственные средства: В 2 т. М.: Новая волна, 2000. Т. 1. 540 с.
7. Наута У., Фейртаг М. Организация мозга. // Мозг: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. C. 83-111.
8. Пошивалов В.П. Этологический атлас для фармакологических исследований на лабораторных грызунах. М., 1978. 43 с.
9. Соколовский В.В. Тиолдисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма. СПб., 1996. 30 с.
10. Флеров МА., Ордян Н.Э., Маргулис БА. и др. Использование БТШ70 для нормализации последствий неизбегаемого стресса у крыс. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2003. Т. 136. № 2 С. 120-122.
11. Шабанов П.Д., Лебедев АА. Подкрепляющие системы мозга: локализация, нейрохимическая организация, участие в формировании зависимости от психостимуляторов. // Психофармакол. и биол. наркол.2001.№ 1. С. 13-26.
12. Шабанов П.Д., Лебедев АА., Мещеров Ш.К. Дофамин и подкрепляющие системы мозга. СПб.: Лань, 2002. 208 с.
13. Эйнштейн Э. Белки мозга и спинномозговой жидкости в норме и патологии. / Пер. с англ. М.: Мир, 1988. 280 с.
14. Asea A., Kabingu E., Stevenson MA, et al. HSP70 peptidembearing and peptide-negative préparations act as chaperokines. // Cell Stress Chaperones. 2000. Vol. 5. N 5. P. 425-431.
15. Asea A., Rehli M., Kabingu E., et al. Novel signal
transduction pathway utilized by extracellular HSP70. Role of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 // J. Biol.Chemistry. 2002. Vol. 277. N17.
P. 15028-15034.
16. Dybdahl B., Wahba A., Lien E., et al. Inflammatory response after open heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signaling through toll-like receptor-4. //Circulation. 2002. Vol. 105. N 6. P. 685-690.
17. Gunther E, Walter L. Genetic aspects of the hsp70 multigene family in vertebrates. // Experientia. 1994. Vol. 50. N 11-12. P. 987-1000.
18. Guzhova I.V., Arnoldt A.C.V., Darieva ZA., et al. Effects of exogenous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization // Cell Stress Chaperones. 1998. Vol. 3. N 1. P. 67-77.
19. Guzhova I.V. Kislyakova K., Moskaliova O., et al. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. //Brain Res. 2001. Vol. 914. P. 66-73.
20. Hightower L.E., Brown, Renfro J.L., et al. Tissue-level cytoprotection. // Cell Stress Chaperones. 2000. Vol. 5. N 5. P. 412-414.
21. Hightower L.E., Guidon P.T. Jr. Selective release from cultured mammalian cells of heat shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins. // J. Cell. Physiol. 1989. Vol. 138. P. 257-266.
22. Houenou L.J., Li L., Lei M., et al. Exogenous heat shock cognate protein Hsc 70 prevents axotomy-induced death of spinal sensory neurons. // Cell Stress Chaperones. 1996. Vol. 1. N 3. P. 161-166.
23. Kakimura J., Kitamura Y., Takata K, et al. Microglial activation and amyloid-beta clearance induced by exogenous heat-shock proteins. // FASEB. J. 2002. Vol. 16. N 6. P. 601-603.
24. Kelty J.D., Noseworthy PA, Feder M.E., et al. // J. Neurosci. 2002. Vol. 22. N 1. RC193.
25. Margulis BA., Welsh M.. // Isolation of hsp 70-binding protein from bovine muscle. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 178. P. 1-7.
26. Moon I.S., Park I.S., Schenker L.T., et al. Presence of constitutive and inducible forms of heat shock protein 70 in the cerebral cortex and hippocampal synapses. // Cereb. Cortex. 2001. Vol. 11. N 3. P. 238-248.
27. Prakken B, Wauben M, van Kooten P., et al. Nasal administration of arthritis-related Tcell epitopes of heat shock protein 60 as a promising way for inmunotherapy in chronic arthritis. // Biotherapy. 1998. Vol. 10. N 3. P. 205-211.
28. Thorne R.G., Emory C.R., Ala TA., Frey W.H. A quantative analysis of the olfactory pathway for drug delivery to the brain. // Brain Res. 1995. Vol. 692. N 1-2. P. 278-282.
29. Tytell M, Greenberg S.G., Lasek R.G. Heat shocklike protein is transferred from glia to axon. // Brain Res. 1986. Vol. 363. P. 161-164.
30. Yo Q., Kent C.R., Tytell M. Retinal uptake of intravitreally injected Hsc/Hsp70 and its effect on susceptibility to light damage. //Mol. Vis. 2001. Vol. 7. N 7. P. 48-56.
31. Zinsmaier K.E., Bronk P. Molecular chaperones and the regulation of neutransmitter exocytosis. // Biochem. Pharmacol. 2001. Vol. 62. N 1. P. 1-11.
