CC BY
74
О.В. Злобина1, А.Н. Юденко2, И.Е. Елисеев2, A.M. Ищенко1, А.В. Жахов1, Н.П. Горбунов1, А.С. Симбирцев1
Сравнительная характеристика результатов кристаллизации белка теплового шока 70 в наземных условиях и в условиях микрогравитации на Международной космической станции
1 ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов»
ФМБА России, г. Санкт-Петербург 2 анкт-Петербургский национальный исследовательский академический университет РАН,
г. Санкт-Петербург
O.V. Zlobina1, A.N. Yudenko2, I.E. Eliseev2, A.M. Ischenko1, A.V. Zhahov1, N.P. Gorbunov1, A.S. Simbirtsev1
Comparative analysis of the results of heat shock protein 70 crystallization in earth-based conditions and in microgravity at the International Space Station
1 FGUP «State Research Institute of Highly Pure Biopreparations» FMBA of Russia, St.Petersburg 2 St Petersburg Academic University of the Russian Academy of Sciences , Saint-Petersburg
Ключевые слова: белок теплового шока 70 (БТШ70), нуклеотид-связывающий домен (НСД), шаперон, вторичная и третичная структура белков, кристаллизация белков, метод паровой диффузии (висячей капли), кристаллизация в капиллярах, рентгеноструктурный анализ.
Keywords: heatshockprotein 70 (HSP70), nucleotide-binding domain (NBD), chaperone, secondary and tertiary structure of proteins, crystallization of proteins, vapor diffusion method (hanging drop), crystallization in the capillaries, X-ray analysis.
Цель исследования — разработка режимов и условий кристаллизации белка теплового шока массой 70 кДа (БТШ70) и его нуклеотид-связывающего домена (НСД) в наземных условиях и определение возможности получения монокристаллов белка в условиях микрогравитации на Международной космической станции (МКС). В качестве объекта исследования был использован рекомбинантный БТШ70, который позиционируется как основной компонент препарата, предназначенного для лечения опухолей головного мозга, меланомы и некоторых других видов рака. Для проведения экспериментов по кристаллизации были наработаны препарат БТШ70 в виде полноразмерной молекулы, а также его И-концевой фрагмент, который формирует функционально важный НСД этого белка. Качество белковых препаратов и их высокая степень чистоты, важная для проведения экспериментов по кристаллизации белков, были подтверждены исследованиями их физико-химических и функциональных свойств. Подобраны условия кристаллизации БТШ70 и НСД методом паровой диффузии и получены образцы белковых кристаллов в планшетах в наземных условиях. Отработаны режимы и условия вы-
The study was aimed to develop the regimes and conditions of crystallization of heat shock protein 70kDa (HSP70) and of its nucleotide-binding domain (NBD) in ground-based conditions and to define the possibility of obtaining single protein crystals in microgravity at the International Space Station (ISS). We used recombinant HSP70, which is positioned as the main component of the preparation intended for treatment of brain tumors, melanoma and some other types of cancer. To carry out the crystallization experiments, we produced preparations of HSP70 in a form of a full-size molecule and of the N-terminal fragment, which forms functionally important nucleotide-binding domain (NBD) of this protein. The protein quality and high purity, important for crystallization, were confirmed by analysis of their physical, chemical and functional properties. The conditions of HSP70 and NBD crystallization by the method of vapor diffusion were chosen. The protein crystals were produced in plates in earth-based conditions. The regimes and conditions for growing protein crystals in capillaries in earth-based conditions were developed to obtain the protein crystals at the ISS. Comparative studies on crystallization of HSP70 and NBD molecules in
ращивания кристаллов белка в капиллярах в наземных условиях для получения кристаллов белка на МКС. Проведены сравнительные исследования по кристаллизации молекул БТШ70 и НСД в капиллярах в условиях земной гравитации и микрогравитации на МКС. Выращенные кристаллы исследованы методом рентгеноструктурного анализа, расшифрована третичная структура белка в полученных кристаллах.
capillaries were performed in earth-based conditions and in microgravity at the ISS. The crystals obtained were studied by X-ray analysis and the protein crystal tertiary structure was solved.
Одним из наиболее перспективных подходов к решению проблемы терапии рака является создание противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока (шаперо-нов), способных многократно усиливать им-муногенность опухолевых антигенов [6; 8].
Многочисленные исследования позволили определить основные функции белков класса БТШ70 в клетке и организме. Выяснилось, что шаперон БТШ70 (Hsp70) в клетке узнает и связывает поврежденные или вновь синтезированные полипептиды и производит циклы связывания-освобождения захваченного белка с тем, чтобы исправить его конфор-мацию. Такой шаперонный цикл контролируется самим БТШ70, несколькими белками-помощниками, включая Hdj1/Hsp40 и Bag-1, и нуждается в молекуле АТФ. Восстановленный с помощью БТШ70 активный белок возвращается в структуру, с которой он функционально связан, а неисправимые полипептиды зависимым от БТШ70 образом удаляются с помощью протеолитических систем клетки, протеа-сом или лизосом [5].
Считается, что БТШ70 может выходить на поверхность раковой клетки и представлять ее пептиды ( опухолевые антигены) антиген-презентирующим клеткам, запуская таким образом активацию обеих ветвей иммунной системы, клеточную и гуморальную. В ряде экспериментов in vitro и in vivo было показано, что БТШ70 способен активировать цитолитические функции NK-клеток в отношении опухолевых клеток, усиливать адаптивный иммунный ответ, генерируемый дендритными клетками (АПК), усиливать продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами. Показано также, что экзогенно введенный рекомбинантный БТШ70 способен вытеснять эндогенный аналог из опухолевой клетки на ее поверхность и тем самым способствовать представлению
опухоль-специфических пептидов антиген-презентирующим клеткам [4; 7].
Эти факты согласуются с полученными на различных моделях опухолей собственными результатами, демонстрирующими эффективность действия БТШ70 в модуляции противоопухолевого иммунного ответа организма, что выражается в статистически достоверном продлении жизни экспериментальных животных по сравнению с контролем [10].
Вместе с тем есть данные о том, что раковые клетки содержат количества БТШ70 и БТШ90, значительно превышающие их содержание в нормальных клетках, которые защищают опухолевые клетки от различных воздействий, в том числе цитостатиков и других факторов при химиотерапии. В настоя -щее время активно разрабатывается стратегия ингибирования внутриклеточных шаперонов №р90 и Шр70 [3]. В этом случае БТШ70 может рассматриваться в качестве мишени для поиска ингибиторов, блокирующих его шапе-ронную активность. Знание пространственной структуры этого белка может быть полезным для поиска комплементарных молекул — ингибиторов активности шаперона.
Все эти данные, собранные вместе, указывают на необходимость более тщательного изучения структуры и функций БТШ70 и его доменов для выявления участков белковой молекулы, ответственных за связывание с поверхностными молекулярными элементами нормальной и раковой клетки и иммуно-генными вирусными или опухолевыми белками. Кроме того, важным направлением исследований является поиск молекул, способных активировать или ингибировать функциональную активность БТШ70. Изучение молекулярных механизмов формирования комплексов БТШ70 с белковыми и небелковыми молекулами-лигандами — актуальная задача
для установления механизмов его действия, выявления участков белковой молекулы, ответственных за функциональные свойства белка, и разработки инновационных противоопухолевых и вакцинных препаратов. Для этой цели требуется изучение пространственной организации молекулы БТШ70, образ которой можно получить, исследуя кристаллическую структуру данного белка методом рентгеноструктурного анализа при высоком разрешении.
Молекула БТШ70 содержит в своей структуре два домена: N-концевой нуклеотид-связывающий домен (НСД) с массой 45 кДа и C-концевой субстрат-связывающий домен (ССД) с молекулярной массой 25 кДа, которые соединены между собой подвижной лин-керной последовательностью. Взаимодействие доменов между собой регулирует шапероно-вую активность БТШ70 [11].
Предполагается, что связывание молекулы АДФ с НСД способствует связыванию ССД с белком-мишенью, в то время как связывание НСД с АТФ приводит к освобождению белка-мишени [1]. Однако молекулярные механизмы такого взаимодействия доменов изучены недостаточно детально.
Несмотря на многочисленные попытки, исследователям до сих пор не удалось получить кристаллы полноразмерной молекулы БТШ70. Исходя из имеющейся в литературе информации, дополненной результатами данного исследования, можно заключить, что причины неудач при кристаллизации цельной молекулы БТШ70 могут быть связаны с его способностью к образованию надмолекулярных структур (димеров и олигомеров более высокого порядка) при концентрировании или с чрезвычайной гибкостью в области линкерной последовательности, соединяющей НСД и ССД, которая определяет высокий уровень подвижности доменов относительно друг друга.
Материалы и методы
Получение и очистка рекомби-нантного БТШ70. Для получения БТШ70 человека был создан штамм-продуцент Escherichia coli путем трансформации штамма BB 1553 [2] векторной плазмидой pMSHsp70. В ФГУП «Государственный НИИ
особо чистых биопрепаратов» ФМБА России разработана технология получения препарата на основе рекомбинантного БТШ70, которая включает ряд этапов. Основные из них — культивирование рекомбинантного штамма-продуцента, выделение из бактериальной биомассы рекомбинантного белка, очистка от примесей бактериальных белков. Для проверки качества конечный продукт проходит всесторонний физико-химический и биохимический анализ, включая изучение иммунологической и шаперонной активности, которая отражает функциональную полноценность получаемого белка. Культивирование штамма-продуцента проводили в ферментере Bioflo 114 (New Brunswick) с объемом реактора 10 л. Выращенную биомассу клеток штамма-продуцента БТШ70 лизировали и получали из нее белковый экстракт, который далее очищали с помощью хроматографии. Хроматографическую очистку белка проводили на колонке с сорбентом DEAE-Сефароза Fast Flow на первом этапе и на колонке с сорбентом АТФ-агароза на втором этапе.
Получение и очистка нуклеотид-связывающего домена БТШ70. Для получения НСД были подобраны условия ограниченного протеолиза БТШ70 с использованием трипсина. Для этого раствор БТШ70 разбавляли до 1—2 мг/мл фосфатно-солевым раствором (ФСР) (20 мМ ф.б., 150 мМ натрия хлорид, 0,02% азид натрия), затем добавляли свежеприготовленный раствор трипсина (фирма «Sigma») (10 мг/мл) в соотношении 1:30 по весу по отношению к БТШ70. После тщательного перемешивания раствор инкубировали 3 часа в термостате при температуре 37 °С. Реакцию трипсинолиза останавливали добавлением к раствору белка ингибитора фенилметилсульфонилфторида до 0,1%, после чего отбирали пробу на исследование методом электрофореза. Полученный раствор замораживали при температуре —70 °С до востребования.
Непосредственно перед проведением экспериментов по кристаллизации растворы БТШ70 и НСД дополнительно очищали методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) на колонке Супердекс 200 и концентрировали. Собранные в процессе проведения ГПХ фракции белка анализировали ме-
тодом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и наиболее чистые фракции объединяли и концентрировали на ячейках (Amicon) до необходимой концентрации. На конечном этапе препарат диализовали против раствора, содержащего 100 мМ HEPES, pH 7,5 с добавлением 10 мМ MgCl2, 4 мМ K.HPO 1 мМ KH PO .
2 4' 2 4
Электрофоретический анализ белков проводили по методу Лэммли в камере для вертикального электрофореза Mini Protean Tetra Cell (Bio-Rad, США) в градиентном разделяющем (4—20%) и 4% концентрирующем ПААГ в присутствии додецил-сульфата натрия в трис-глициновом буфере, pH 8,3. Электрофорез проводили в нередуци-рующих (без добавления ß-МЭ) условиях.
Кристаллизация белков методом паровой диффузии (висячей капли). Кристаллизацию белков методом диффузии паров проводили на 24-луночных планшетах («Molecular Dimensions», Великобритания). В каждую лунку на планшете помещали раствор осадителя (вещества, которое понижает растворимость белка) объемом 500 мкл. Затем на покровное стекло размером 22*22 мм наносили 3 капли раствора белка. Объем капель раствора белка составлял 1 (2 шт.) и 2 (1 шт.) мкл. В каждую каплю добавляли противораствор в соотношении 1:1, 1:2 и 2:1. Затем покровное стекло переворачивали каплями вниз и накрывали им лунку с про-тивораствором для того, чтобы вода из капли могла постепенно испаряться и переходить в противораствор, увеличивая тем самым концентрацию белка. На место контакта покровного стекла с лункой планшета наносили вакуумную смазку для обеспечения герметичности контакта. Планшет помещали в термостат с температурой +4 °С, +15 °С или +20 °С. Отслеживание роста кристаллов проводили вручную дважды в неделю на сте-реомикроскопе Carl Zeiss.
Кристаллизация белков методом встречной диффузии. Существует множество различных методических подходов к выращиванию кристаллов белков методом встречной диффузии. В данной работе была использована методика фирмы «Confocal Sciense» (Япония), к которой были разработаны приспособления специально для прове-
дения космических экспериментов (КЭ) по кристаллизации белков.
Результаты исследования
Исследование стабильности молекулы БТШ70. Перед началом исследований по кристаллизации белков были проведены предварительные эксперименты по изучению стабильности структуры БТШ70. С помощью исследований методами триптофановой флюоресценции и дифференциальной сканирующей калориметрии были определены компоненты, добавление которых в раствор в небольших концентрациях (1—10 мМ) приводит к стабилизации БТШ70 - АТФ, АДФ, хлорид магния, сульфат аммония, фосфат калия.
В ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России были синтезированы пептиды различной степени гидрофобности, которые, согласно литературным данным, могут связываться с ССД (FYQLALT, KFYQLALTK, KKFYQLALTKK, условно обозначенные соответственно пеп-тид-1, пептид-2 и пептид-3). Методами малоуглового рассеяния и ГПХ было установлено, что добавление в белковый раствор этих пептидов усиливает жесткость белковой молекулы и способствует стабилизации мономерной формы белка. В отсутствие этих пептидов БТШ70 находится в растворе в виде смеси мономеров, димеров и олигомеров более высокого порядка.
С учетом полученных данных по стабилизации структуры белка, а также для более глубокого понимания функционирования НСД в работу были введены помимо АТФ и другие ну-клеотидные лиганды, способные связываться с N-концевым доменом: АДФ, негидролизуемый аналог АТФ — АТФ-гаммаБ, а также низкомолекулярный ингибитор БТШ70 — VER 155008 и субстратные пептиды. Кроме того, эти же ли-ганды были использованы для получения кристаллов из НСД.
Наработка белка для обеспечения экспериментов по кристаллизации в наземных условиях и на МКС. Для обеспечения экспериментов по кристаллизации в наземных условиях и на МКС были проведены работы по получению белковых препаратов БТШ70 и НСД высокой степени очистки (см. раздел «Материалы и мето-
ды»). Исследование методом электрофореза показало, что полученные образцы БТШ70 и НСД являются высокоочищенными и гомогенными (рис. 1). БТШ70 представляет собой гомогенный белок с молекулярной массой 70 кДа, НСД характеризуется молекулярной массой 42 кДа.
Исследование биологической и иммунобиологической активности ( данные не приведены) показало, что образцы рекомби-нантного БТШ70 обладают высокой функциональной активностью.
Поиск условий кристаллизации БТШ70 методом паровой диффузии (висячей капли). Одним из наиболее удобных, технологичных и результативных методов предварительного подбора условий кристаллизации и их оптимизации является метод паровой диффузии, который позволяет проводить широкий скрининг различных условий кристаллизации и находить варианты для получения качественных кристаллов для исследования методом рентгеноструктурного анализа. С помощью метода паровой диффузии был проведен первичный многофакторный скрининг с использованием 96-луночных планшетов
А. 1 2 Б. 1 2 3
Рис. 1. Электрофореграмма препаратов БТШ70 и НСД
1 - калибровочные белки с известными молекулярными массами (соответственно 14,4; 20,1; 30; 45; 66; 97 кДа), фирма «Фармация»; 2 - образец БТШ70, приготовленный для проведения экспериментов по кристаллизации; 3 - препарат БТШ70, использованный для получения НСД; 4 - НСД, полученный методом ограниченного протеолиза из БТШ70. Непосредственно перед кристаллизацией препарат дополнительно очищали с помощью ГПХ, чтобы избавиться от различных примесей, включая полноразмерный БТШ70
для кристаллизации («Molecular Dimensions», Великобритания) и коммерчески доступных наборов реагентов («Hampton Research», США). Протестировано около 2000 уникаль-ныгх условий по кристаллизации БТШ70, включавших поиск состава буферного раствора, выбор значения pH, концентрации белка, температуры инкубации, состава раствора осадителя, а также исследование влияния различные вспомогательных веществ на стабилизацию молекулярной структуры белка.
В проведенном эксперименте варьировалась концентрация белков в диапазоне от 4 до 20 мг/мл; в качестве буферныгх систем исследовали MES, HEPES, фосфатный буфер, рН (4—8). Для тестирования осаждающих растворов использовали 5—30% PEG 2000, PEG 3350, PEG 8000, PEG 10000, PEG 20000, сульфат аммония, малонат натрия.
Мониторинг роста кристаллов проводили в течение 3 месяцев. Отслеживание и фотографирование роста кристаллов производили в 1-й, 3-й, 5-й, 9-й, 14-й, 20-й, 30-й, 40-й, 50-й, 70-й и 90-й дни. Кристаллизацию проводили при температуре 15 °С и 20 °С. В конечном итоге были подобраны условия, при которых из раствора БТШ70 на 35-й день удалось получить кристаллы. На рисунке 2 представлена фотография полученных в результате скрининга кристаллов БТШ70 в комплексе с низкомолекулярными соединениями, добавленными для стабилизации структуры белка.
Образование кристаллов БТШ70 наблюдали в единичных случаях через 30— 90 дней, и оно было не всегда воспроизводимо, что, по-видимому, связано с внутримоле-
Рис. 2. Кристалл БТШ70, полученный методом паровой диффузии в комплексе с АДФ и пептидом-3 с использованием реагентов Hampton Research PEG/Ion screen
кулярной подвижностью БТШ70, образованием олигомерных форм в каплях и возможной деградацией белка во времени.
На основании полученных при скрининге в 96-луночных планшетах первичных условий кристаллизации поиск оптимальных условий был продолжен с использованием 24-луночных планшетов для получения более воспроизводимых результатов и ускорения процесса кристаллизации.
Кристаллы БТШ70 появлялись не раньше, чем через 4 недели после начала эксперимента, в то время как кристаллизация НСД проходила более успешно и в более короткие сроки — от 4 до 10 дней.
На рисунках 3 и 4 представлен результат тестирования условий кристаллизации БТШ70 (рис. 3) и НСД (рис. 4), полученный методом паровой диффузии.
После воспроизведения условий кристаллизации проводили тестирование дифракционного качества образовавшихся кристаллов на дифрактометре ApexDuo (Bruker). Дифракционные картины снимались на двумерный CCD-детектор ApexDuo (Bruker) и качественно свидетельствовали о том, что полученные кристаллы относятся к белку и его пространственная структура принципиально может быть исследована. На рисунке 5 представлен пример дифракционной картины, снятой с полученных кристаллов. Измерения проводили на базе Санкт-Петербургского национального исследовательского Академического университета РАН.
Рис. 3. Кристаллы БТШ70 в комплексе с пептидом и лигандами, полученные методом паровой диффузии
Фотографии сделаны с использованием флюоресцентного микроскопа. А - комплекс БТШ70 с АТФ и пептидом-1, противораствор: 20% PEG 3350, 100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,5; Б - комплекс БТШ70 с АДФ и пептидом-3, противораствор: 25% PEG 3350, 100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,0
Получение кристаллов белка в капиллярах. В результате исследования методом паровой диффузии подобраны и оптимизированы условия кристаллизации БТШ70 и НСД для проведения дальнейших экспериментов по кристаллизации методом встречной диффузии в капилляре.
Условия, используемые для получения кристаллов посредством паровой диффузии, могут применяться и для кристаллизации белка в капиллярах. Метод кристаллизации в капиллярах, или метод встречной диффузии, имеет ряд преимуществ перед методом паровой диффузии. Помимо отсутствия конвекции при кристаллизации в капиллярах значительно снижается влияние вибрации и сводится к минимуму контакт с кислородом воздуха, появляется также возможность получения более качественных кристаллов за счет создания градиента концентрации осаждающего агента между раствором белка и проти-вораствором (градиент пресыщения).
Рис. 4. Кристаллы НСД в комплексе с лигандами, полученные методом паровой диффузии
Фотографии сделаны с использованием флюоресцентного микроскопа. А - комплекс НСД с АТФ, противораствор: 20% PEG 3350, 100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,5; Б - комплекс НСД с АДФ, противораствор: 20% PEG 3350,
100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,5; В - комплекс НСД с VER 155008, противораствор: 20% PEG 3350, 100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,5; Г - комплекс НСД с АТФ-гаммаS, противораствор: 25% PEG 3350, 100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,5
Рис. 5. Дифракционная картина, снятая с кристалла НСД-БТШ70 в комплексе с АДФ
Измерение проведено на дифрактометре Bruker Apex II. Разрешение 2.0 А. Кристалл получен методом паровой диффузии.
Кристаллизацию проводили при концентрации НСД-БТШ70 15 мг/мл и АТФ 5 мМ, состав противораствора: 20% PEG 3350, 100 мМ HEPES, 5 мМ Na/K фосфатный буфер, pH 7,5
Кристаллизация белка в капилляре может осуществляться с помощью различных приспособлений, а также в соответствии с различными методиками. В данной работе мы использовали методологию, которая уже применяется при кристаллизации белков на МКС.
Согласно этому методу раствор белка с помощью пипетки помещали в кварцевый капилляр с внутренним диаметром 0,3 или 0,5 мм и длиной 3—6 см («Confocal Sciense», Япония) (рис. 6). Один конец капилляра герметично закрывали воском, а на другой конец надевали силиконовую трубку длиной 1 см с залитым в нее агарозным гелем. Капилляр в таком виде помещали в ячейку, содержавшую раствор осадителя (например, система кристаллизации в капиллярах «Granada Crystallization Box»). Благодаря диффузии осадителя через слой геля внутрь капилляра создается градиент концентрации от одного конца капилляра до другого. Одновременно, хотя и с меньшей
скоростью, чем диффузия раствора осадите -ля, происходит встречная диффузия из раствора белка в гель, в результате чего градиент концентрации белка формируется вдоль всего капилляра.
Для оптимизации условий кристаллизации было приготовлено несколько образцов кристаллизуемых белков в диапазоне концентраций 5—20 мг/мл.
Помимо чистого белка были использованы также комплексы белка со стабилизирующими субстратами АТФ, АДФ, АТФ-гаммаS, VER 155008 и пептидом-3.
Все белковые растворы и растворы оса-дителя содержали буферный раствор 100 мМ HEPES pH 7,5 с добавлением MgCl2.
В качестве осадителя во все противо-растворы добавляли полиэтиленгликоль разной длины (PEG 2000, PEG 3350, PEG 10000) до конечной концентрации 15—30%. Перед началом эксперимента растворы белков и противорастворы были дегазированы.
Кристаллизация белка проводилась в термостате при температуре +20 °С.
В результате выполненных экспериментов в отдельных капиллярах были получены микрокристаллы, пример которых представлен на рисунке 7.
Наиболее оптимальные композиционные составы белковых растворов и противо-растворов были выбраны для эксперимента по кристаллизации в капиллярах на МКС.
Кристаллизация БТШ70 и НСД в капиллярах в наземных условиях и на
Рис. 6. Кварцевые капилляры с внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 60 мм («Confocal Sciense», Япония)
Рис. 7. Кристалл БТШ70 с субстратами (АДФ + MgCl2 + пептид-3), полученный методом встречной диффузии в капилляре, противораствор 20% PEG 3350
Съемку кристаллов проводили на микроскопе Carl Zeiss Axio Observer
МКС. В настоящее время для кристаллизации на МКС применяется технология с использованием капилляров. Для проведения эксперимента по кристаллизации в условиях микрогравитации на МКС 16 капилляров фирмы «Confocal Science» с внутренним диаметром 0,5 мм и длиной 4 см быши заполнены растворами, содержавшими различные комплексы БТШ70 и НСД с лигандами, состав которых приведен в таблице. Помимо указанных в таблице компонентов все белковые растворы и растворы осадителя содержали 100 мМ HEPES, 10 мМ MgCl2, 4 мМ K2HPO4, 1 мМ KH2PO4, pH 7,5. КЭ проводили с дублированием на Земле, таким образом, общее количество капилляров составило 32 шт.
Капилляры были упакованы в ячейки («Confocal Science»), наполненные раствором осадителя объемом 1 мл. Космический набор из 16 капилляров отправлен на космодром «Байконур» за 6 дней до запуска на МКС, а дублирующий идентичный набор оставлен в лабораторных условиях и помещен в качестве земного контроля в термостат при температуре +20 °С.
Эксперимент продолжался в течение 7 недель, и после его окончания формирование кристаллов фиксировали с помощью фотографирования под микроскопом. Их наличие и внешний вид описаны в таблице.
Поведение рентгеноструктурного анализа. За 2 дня до проведения рентгеноструктурного анализа капилляры были вскрыты с помощью стеклореза («Hamilton») и кристаллы извлечены из них для подготовки к съемке на синхротроне. Для этого при наблюдении через микроскоп раствор с кристаллами вытесняли с помощью пипетки из капилляров в соответствующий данному капилляру раствор осадителя. Сразу после этого кристаллы извлекали из раствора осадителя с помощью криопетель «Hampton Reseаrch» диаметром 100-200, 200-300 и 400-500 мкм и переносили в криораствор, который представлял собой соответствующий каждому капилляру раствор осадителя, приготовленный на 20% растворе глицерина. Манипуляции с петлей осуществляли с помощью специального магнитного держателя («Hampton Reseаrch»). Петли с кристаллами вымачивали в криорастворе в течение 10-20 сек и бы-
стро перемещали в пенопластовую емкость с жидким азотом («Molecular Dimentions»), где устанавливали их в одну из лунок предварительно охлажденной специальной кассеты вместимостью 16 криопетель. Данная кассета предназначена для использования в роботизированные системах монтирования кристаллов на линиях вывода синхротронного излучения. Рентгеноструктурный анализ проводили на источнике синхротронного излучения «Spring-8» (Япония). Дифракционные картины быши получены на синхротронной линии BL 41XU, оснащенной двумерным детектором рентгеновского излучения «Pilatus6M». Предварительную обработку данных проводили на линии с использованием программного обеспечения HKL2000 («HKL Research, Inc.»). При проведении эксперимента по дифракции кристаллов варьировались такие параметры, как расстояние между кристаллом и детектором, пространственная ориентация образца (угол вращения), длина волны, геометрия сечения пучка (средний размер 5х 10 мкм2), угол качания, время экспозиции, аттенюация. Для каждого образца быши получены наборы дифракционных картин для разные точек кристалла. Пример результатов представлен на рисунке 8.
С помощью пакета компьютерные программ CCP4i было проведено предварительное определение симметрии кристалла, которое необходимо для поиска оптимальных параметров съемки. Получение дифракционные картин проводили при длине волны рентгеновского излучения 1 ангстрем, кристалл вращали с помощью гониометра в диапазоне 0—360°, угол качания (Oscillation range) — 0,3°. В рамках съемки одного кристалла получался набор из 1200 дифракционные картин. Время экспозиции каждого снимка составляло 0,1 сек. В зависимости от качества кристалла и его устойчивости к рентгеновскому излучению путем установки различных толщин аттенюатора (830, 850, 910, 930, 1030 мкм) подбирали интенсивность падающего пучка. Также подбирали расстояние между кристаллом и детектором (интервал 300—600 мм). При излишней интенсивности излучения кристалл деградировал, а при недостаточной дифракционный сигнал быш слишком слабым для накопления в детекторе.
Результаты кристаллизации комплексов БТШ70 и НСД, отправленных на МКС
№ ^нил-ляpa Бeлoк (кoнцeнтpaция, cocтaв бyфepнoгo pacтвopa) Раствор осадителя, состав, концентрация Фopмиpoвaниe кpиcтaллoв в кocмoce Фopмиpoвaниe кpиcтaллoв нa Зeмлe
1 Б™70 10 мг/мл, 5 мM AДФ, TOrn^,^ 1 мг/мл 25% PEG 3350, 1 мМ АДФ, пептид-3 0,5 мг/мл Шт Heт
2 Б™70 15 мг/мл, 5 мM AДФ, пeптид-3 1 мг/мл 25% PEG 3350, 1 мМ АДФ, пептид-3 0,5 мг/мл Шт Heт
3 Б™70 20 мг/мл, 5 мM AДФ, пeптид-3 1 мг/мл 25% PEG 3350, 1 мМ АДФ, пептид-3 0,5 мг/мл 3 мoнoкpиcтaллa 0,1—0,2 мм 2 клacтepa кpиcтaллoв 0,1—0,2 мм
4 БTШ70 20 мг/мл, 5 мM ATФ, пeптид-3 1 мг/мл 25% PEG 10000, 1 мМ АТФ, пептид-3 0,5 мг/мл ^т Heт
5 БTШ70 20 мг/мл, 5 мM ATФ-гaммaS, пeптид-3 1 мг/мл 25% PEG 10000, 1 мМ АТФ-гаммаБ, пептид-3 0,5 мг/мл 3 ^aCTepa кpиcтaллoв 0,3—0,4 мм 3 ^aCT'epa кpиcтaллoв 0,3—0,5 мм
б БTШ70 10 мг/мл, 5 мM VER 155008, rnern^-3 1 мг/мл 25% PEG 3350, пептид-3 0,5 мг/мл 4 кpиcтaллa oramRoro нa вид кaчecтвa 0,2—0,3 мм 2 ^a^epa кpиcтaллoв 0,4—0,5 мм
7 Б™70 15 мг/мл, 5 мM VER 155008, rnern^-3 1 мг/мл 25% PEG 3350, пептид-3 0,5 мг/мл ^т Heт
8 Б™70 20 мг/мл, 5 мM VER 155008, rnern^-3 1 мг/мл 25% PEG 10000, пептид-3 0,5 мг/мл ^т Шт
9 HQO, 10 мг/мл, 5 мM AДФ 25% PEG 3350, 1 мМ АДФ 7 кpиcтaллoв 0,4—0,б мм 7 кpиcтaллoв 0,4—0,б мм
10 HCД б мг/мл, 5 мM AДФ 25% PEG 3350, 1 мМ АДФ 3 мoнoкpиcтaллa 0,2—0,4 мм, 1 raacrep 0,2—0,4 мм 3 ^acrepa кpиcтaллoв 0,2—0,4 мм, 2 мoнoкpиcтaллa 0,05 мм
11 HCД 8 мг/мл, 5 мM AДФ 25% PEG 10000, 1 мМ АДФ 2 кpиcтaллa 0,4—0,5 мм, 1 ^aCTep кpиcтaллoв 0,5 мм 10 кpиcтaллoв 0,3—0,5 мм
12 HCД 8 мг/мл, 5 мM ATФ 25% PEG 10000, 1 мМ АТФ Kpиcтaллы были видны то o^rna-нии НЭ, oднaкo к мoмeнтy PCA pacтвopилиcь 2 кpиcтaллa или 2 ^a^epa кpиcтaллoв 0,3—0,5 мм
13 HCД 8 мг/мл, 5 мM ATФ-гaммaS 25% PEG 10000, 1 мМ АТФ-гаммаБ 3 ^a^epa кpиcтaллoв 0,2—0,3 мм, 1 мoнoкpиcтaлл 0,2 мм 4 мoнoкpиcтaллa 0,05 мм, 1 caблeвидный кpиcтaлл 0,2 мм
14 HQO, 10 мг/мл, 5 мM VER 155008 25% PEG 3350 2 мoнoкpиcтaллa, 2 клacтepa кpиcтaллoв 0,2—0,3 мм б мeлкиx кpиcтaллoв 0,05—0,15 мм
15 HQO, б мг/мл, 5 мM VER 155008 25% PEG 3350 M^œe^bo пaлoчкoвидныx кpиcтaллoв длишж 0,7—1,5 мм 2 кpиcтaллa 0,2—0,3 мм
1б HCД 8 мг/мл, 5 мM VER 155008 25% PEG 10000 1 кpиcтaлл 0,2—0,4 мм 3 мaлeнькиx кpиcтaллa 0,05 мм
Примечание: PCA — pern're^^py^^^^ aнaлиз.
Рис. 8. Пример дифракционной картины, снятой с кристаллов, выросших в условиях микрогравитации на МКС
А - БТШ70, пептид и АДФ (1.65 А); Б - БТШ70 и VER 155008 (2.00 А); В - НСД и АДФ (1.65 А); Г - НСД и VER 155008 (1.7 А). Измерение проводили на синхротроне «Spring-8» (Япония). Изображение получено с помощью программы для интегрирования
рентгеностуктурных данных iMOSFLM из пакета программ CCP4i
Полученные наборы рефлексов при дифракции на кристаллах были проанализированы визуально и с помощью пакета компьютерных программ CCP4i. Проведена оценка разрешения и на ее основе отобраны наиболее качественные наборы. На данном этапе работы были собраны дифракционные данные хорошего качества (разрешение 1,5—3,0 ангстрем) для следующих комплексов: БТШ70 с АДФ, БТШ70 с VER 155008, НСД с АДФ, НСД с VER 155008.
Для интегрирования картин рассеяния была использована программа XDS. Определение фазы было произведено с помощью метода молекулярного замещения, для этого была использована структура из Protein Data Bank с именем 2E8A. Для вписывания аминокислотной последовательности в распределение электронной плотности и последующего уточнения структуры использовали пакет программ PHENIX. В результате расшифровки дифракционных экспериментальные данных были получены структуры высокого разрешения (рис. 9).
В результате рентгеноструктурного анализа кристаллов, выращенных из растворов различные комплексов БТШ70 и НСД, выявлено, что во всех случаях кристаллы были образованы только N-концевым фрагментом БТШ70, соответствующим НСД.
Обсуждение результатов исследования
Эксперимент по кристаллизации БТШ70 на МКС проводили в течение 7 недель — с 23 июля 2015 г., вместе с запуском космического корабля Союз ТМА-17М, по 12 сентября 2015 г.
В данном исследовании ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России впервые были опробованы подходы космической биологии для исследования структуры белков.
Кристаллизацию биомолекул используют для определения их пространственной структуры методом рентгеноструктур-ного анализа и установления участков белка, ответственных за взаимодействие с другими функционально важными молекулами. Данные о пространственной структуре позволяют определить механизмы действия белков на молекулярном уровне и способству-
ют разработке эффективных лекарственных средств нового поколения, изучению механизмов развития заболеваний, используются в сельском хозяйстве и пищевой индустрии. Все это определяет важность данного направления современной биологии.
Проведение экспериментов по кристаллизации в космических условиях представляет особый интерес и перспективу, поскольку в этом случае минимизированы гравитация и конвекционные потоки в растворе, мешающие формированию идеальной кристаллической структуры белков в наземных условиях.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последнее время в разработке методик получения пригодных для рентгено-структурного анализа белковых кристаллов, именно стадия кристаллизации до сих пор
Рис. 9. Третичная структура молекулы НСД в комплексе с лигандом АДФ
А - ленточная модель, изображение получено с помощью программы визуализации биологических макромолекул PYMOL; Б - атомарная модель: фиолетовой сеткой представлена электронная плотность, рассчитанная после обработки дифракционных экспериментальных данных интегрирования с помощью программы XDS, определения фазы методом молекулярного замещения; зеленым цветом обозначена полипептидная цепь белка, которая была вписана в электронную плотность с помощью пакета программ PHENIX; розовыми перекрестиями представлены молекулы воды, которые фиксированы в кристалле белка. В центре изображения можно видеть электронную плотность аминокислотного остатка тирозина с провалом в центре кольца, что свидетельствует о сверхвысоком разрешении структуры
остается наименее предсказуемой и нередко определяет время, затрачиваемое на рентгеновское исследование пространственной структуры белка, поэтому развитие экспериментальных подходов, позволяющих улучшить дифракционные свойства кристаллов, остается актуальной задачей.
Множество исследовательских групп в мире пытались вырастить кристаллы полноразмерного БТШ70, однако до сих пор никому не удалось это сделать из-за молекулярных свойств данного белка.
Проведенные нами исследования структуры молекулы БТШ70 методами трипто-фановой флуоресценции, дифференциальной сканирующей калориметрии и малоуглового рентгеновского рассеяния позволили определить условия стабилизации молекулы. На основании полученных результатов и накопленного опыта в получении особо чистых препаратов различных белков, а также с учетом литературных данных нами были отобраны условия для проведения экспериментов по кристаллизации БТШ70 на Земле и в космосе.
В результате детальной работы по подбору оптимальных условий кристаллизации были получены белковые кристаллы в лабораторных условиях на Земле. После отправки на МКС, в условиях невесомости, на японском научно-исследовательском модуле «Кибо» также удалось получить монокристаллы белка.
Иногда для кристаллов, выросших из одного раствора в капиллярах-дублерах в космосе и на Земле, наблюдалась значительная разница в морфологии. Так, в результате инкубации комплекса НСД и VER 155008 в условиях микрогравитации на МКС форми-
ровались кристаллы стержневидной формы, в то время как в дублирующем его земном варианте кристаллы имели округлую форму (рис. 10).
Как правило, при соблюдении равных условий рост кристаллов наблюдался как на Земле, так и на МКС. Однако их качество было различным. Статистического исследования по этому вопросу не проводилось, однако расшифровка данных рентгеноструктур-ного анализа показала, что кристаллы, выращенные на борту МКС, чаще позволяли получить пространственную структуру белка более высокого разрешения, чем кристаллы, выращенные на Земле. В отдельных капиллярах образования кристаллов не происходило, причем это не было связано с местом кристаллизации (Земля, МКС).
Рентгеноструктурный анализ проводили в Японии с использованием синхротрона 3-го поколения «Spring-8», который не имеет аналогов в мире и позволяет получать дифракционные картины с наибольшим разрешением.
Важно отметить, что после заполнения капилляров препаратом белка и погружения их в раствор осадителя в некоторых случаях уже через 3 дня под микроскопом можно было наблюдать появление маленьких кристаллов. Это говорит о необходимости минимизировать время от завершения работ по заполнению капилляров до их запуска на МКС. В последующих экспериментах целесообразно проводить предварительные работы непосредственно на космодроме.
Кроме того, в ряде капилляров рост и появление кристаллов продолжались в период после возвращения контейнера с капиллярами на Землю и до проведения рентгенострук-турного анализа. Вскрытие капилляров про-
Рис. 10. Сравнение внешнего вида кристаллов, выращенных в космических и земных условиях
А, Б - кристаллы комплекса НСД и VER 155008, выращенные в космосе (А) и на Земле (Б); В, Г - кристаллы комплекса НСД и АДФ, выращенные в космосе (В) и на Земле (Г)
водили через 20 дней после окончания КЭ, непосредственно перед съемкой на синхротроне. Поскольку синхротрон является прибором повышенной загруженности и нет возможности выбирать для работы предпочтительные даты, для повышения чистоты экспериментов в дальнейшем будет целесообразно проводить подготовку кристаллов к съемке сразу по возвращении капилляров с МКС в лабораторию.
Рентгеноструктурный анализ выявил, что при попытке кристаллизации цельной молекулы БТШ70 за время многодневной инкубации раствора при +20 °С происходит распад белка в линкерной области с образованием НСД. Данные результаты могут объяснить причину долгого формирования кристаллов из раствора, содержащего БТШ70 (от 30 дней), по сравнению с кристаллами, получаемыми из раствора НСД (4—10 дней): для прохождения гидролиза молекул БТШ70 требуется дополнительное время. Сегодня мы проводим поиск вспомогательных молекул и условий, которые могут стабилизировать структуру БТШ70 и предотвратить ее распад.
В заключение хотелось бы отметить, что данная работа — это наши первые шаги по апробации методов космической биологии для получения кристаллов белка теплового шока. Предполагается продолжить работу по поиску условий кристаллизации полноразмерной молекулы БТШ70, поскольку новые данные будут способствовать получению информации о взаимодействии этого белка с другими молекулами, что необходимо для разработки инновационных препаратов для лечения рака.
Литература
1. Аого P.C., Ta D.T., Cupp-Vickery J.R., Vickery L.E. X-ray diffraction analysis of a crystal of ШсА from Escherichia coli // А^ Crystallographica. 2005. F61. P. 715-717.
2. Freeman B.C., Michels А., Song J. et al. Analysis of molecular chaperone activities using in vitro and in vivo approaches // Methods in Molecular Biology. 2000. Vol. 99. P. 393-419.
3. Goloudina А^., Demidov O.N., Garrido C. Inhibition of HSP70: a challenging anticancer strategy // Cancer Letters. 2012. Vol. 325 (2). Р. 117-124.
4. Guzhova I.V., Shevtsov M.A., Abkin S.V. et al. Intracellular and extracellular Hsp70 chaperone as a target for cancer therapy // International Journal of Hyperthermia.
2013. Vol. 29 (5). P. 399-408.
5. Mayer M.P., Bukau B. Hsp70 chaperones: Cellular functions and molecular mechanism. Review // Cellular and Molecular Life Sciences. 2005. Vol. 62 (6). P. 670-684.
6. Patury S., Miyata Y., Gestwicki J.E. Pharmacological targeting of the Hsp70 chaperone // Current Topics in Medicinal Chemistry. 2009. Vol. 9 (15). P. 1337-1351.
7. Schmitt E., Gehrmann M., Brunet M. et al. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy // Journal of Leukocyte Biology. 2007. Vol. 81. P. 15-25.
8. Shevtsov M.A., Kim A.V., Samochernych K.A. et al. Pilot study of intratumoral injection of recombinant heat shock protein 70 in the treatment of malignant brain tumors in children // Onco Targets and Therapy. 2014. Vol. 7. P. 1071-1081. Published online Jun 18, 2014. DOI: 10.2147/0TT.S62764.
9. Shevtsov M.A., Nikolaev B.P., Yakovle-va L. Y. et al. 70-kDa heat shock protein coated magnetic nanoparticles as a nanovaccine for induction of anti-tumor immune response in experimental glioma // Journal of Controlled Release. 2015 (accepted for publication).
10. Shevtsov M.A., Pozdnyakov A.V., Mikhri-na A.L. et al. Effective immunotherapy of rat glioblastoma with prolonged intratumoral delivery of exogenous heat shock protein Hsp70 // International Journal of Cancer.
2014. In Press.
11. Young J.C., Barral J.M., Hartl F.U. More than folding: localized functions of cytosolic chaperones // Trends in Biochemical Sciences. 2003. Vol. 28. P. 541-547.
Контакты:
Злобина Ольга Владимировна,
младший научный сотрудник лаборатории биохимии белка ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России. Тел. раб.: (812) 499 16 62, доб. 2162. E-mail: [email protected]
