CC BY
20
https://doi.org/! 0.1 7116/molgen201 9370119
Три новых интегрона класса 1, обнаруженных в полирезистентных госпитальных штаммах Pseudomonas aeruginosa
Е.И. АСТАШКИН1, А.И. ЛЕВ1, О.Н. ЕРШОВА2, Т.С. НОВИКОВА1, Е.Н. АГЕЕВА1, Г.Н. ФЕДЮКИНА1, Э.А. СВЕТОЧ1, Н.К. ФУРСОВА1
]ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Оболенск, Серпуховский район, Московская область, Россия, 142279; 2ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» Минздрава РФ, 4-я Тверская-Ямская улица, 16, Москва, Россия, 125047
Антибиотикорезистентность возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), является важной проблемой здравоохранения во всем мире. Pseudomonas aeruginosa — один из основных возбудителей ИСМП, особенно в отделениях реанимации и интенсивной терапии. Данное исследование посвящено идентификации генетических детерминант антибиотикорезистентности и определению структуры мобильных генетических элементов — новых интегронов класса 1 — у P. aeruginosa. Штаммы P. aeruginosa (n=105) выделены в отделении нейрореанимации Москвы в 2013—201 6 гг. из органов дыхания (60,0%), мочи (28,6%), хирургических ран (5,7%), крови (2,9%) и цереброспинальной жидкости (2,9%). Большинство (92,4%) штаммов характеризовались множественной антибиотикорезистентностью. В ходе исследования выявлены гены бета-лактамаз: b/a |ike (37,7% штаммов) — широко распространенный в России, и blaCr (3,0% штаммов) — впервые идентифицированный у штаммов P. aeruginosa, выделенных в России. Интегроны класса 1 обнаружены у 63,0% штаммов, из которых 36,7% штаммов несли наборы генных кассет 7 видов: (b/a like), (aadA6-gcuö), (aacA7-b/a like), (aac(3')Ic-cm/A5), (aadA6A3::ISPa21e-gcuö), (gcu87-aadB-aphA15d-aadA1a) и (b/apBL 1-aacA4). Последние 3 набора генных кассет являются новыми для интегронов класса 1. В специализированной базе данных INTEGRAL новым интегронам присвоены идентификационные номера In1379, In1 360 и In1375. Идентифицированы новые генетические структуры: генная кассета aadA6 с интеркалированным ISPa21e элементом (In1 379); генная кассета gsu87, кодирующая гипотетический белок, не представленный в базе данных GenBank (In1360); новая аллель генной кассеты aphA15d и генная кассета b/a , кодирующая не описанную ранее бета-лактамазу класса А (In1375). Выявление новых генетических структур антибиотикорезистентности у штаммов P. aeruginosa, выделенных в течение 3 лет, свидетельствует об активности генетических процессов, ассоциированных с формированием множественной лекарственной устойчивости у госпитальных патогенов.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, новые интегроны класса 1, новые генные кассеты, b/a , множественная лекарственная устойчивость.
Three novel class 1 integrons detected in multi drug resistant Pseudomonas aeruginosa hospital strains
E.I. ASTASHKIN1, A.I. LEV1, O.N. ERSHOVA2, T.S. NOVIKOVA1, E.N. AGEEVA1, G.N. FEDYUKINA1, E.A. SVETOCH1, N.K. FURSOVA1
]FBIS «State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology», Rospotrebnadzor, Obolensk, Serpukhov district, Moscow region, Russia, 142279; 2FSAI «National Medical Research Center of Neurosurgery named after academician NN. Burdenko» Ministry of Health, Russian Federation 4-rd Tverskaya-Yamskaya street, 16, Moscow, Russia, 125047
Antibacterial resistance of Healthcare-Associated Infection (HAI) agents is a major public health problem world wide. Pseudomonas aeruginosa is one of the main HAI agents especially in intensive care units (ICUs). The present study focuses on the identification of antibacterial resistance genetic determinants and on determining the structure of mobile genetic elements — novel class 1 integrons of P. aeruginosa. P. aeruginosa strains (n=105) were collected in the department of Moscow neurosurgery ICU in 201 3—2016 from respiratory system (60.0%), urine (28.6%), surgical wounds (5.7%), blood (2.9%), and cerebrospinal fluid (2.9%). Major (92.4%) strains characterized by the phenotype of multi drug resistance. Beta-lactamase genes bla likc which are widely distributed in Russia were identified in 37.7% strains. The blaCT gene was carried by 3.0% strains that is the first report of such gene identification in P. aeruginosa in Russia. Class 1 integrons were detected in 63.0% strains, of which 36.7% strains carried 7 types of gene cassette
© Коллектив авторов, 201 9
Для корреспонденции: Фурсова Надежда Константиновна, канд. биол. наук, зав. лабораторией антимикробных препаратов, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Оболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org
For correspondence: Nadezhda K. Fursova, PhD, head of Antimicrobial Agents Lab., State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Rospotrebnadzor, 142279 Obolensk, Serpukhov district, Moscow region, Russian Federation; e-mail: fursova@obolensk.org
arrays: (blaVIM-2-like), (aadAô-gcuD), (aacA7-blaVIM-2-like), (aac(3')Ic-cmlA5), (aadA6Â3::ISPa21e-gcuD), (gcu87-aadB-aphA15d-aadA1a), and (blapBL 1-aacA4). The last three gene cassette arrays are new for class 1 intégrons. The identification numbers have been assigned to novel integrons:In1379, In1360, and In1375. New genetic structures were described: the aadA6 gene cassette with inserted ISPa21ye element (In1379); the gsu87 gene cassette coding hypothetical protein which is not represented in GenBank database (In1360); novel allele of aphA15d gene cassette and the blapBL 1 gene cassette coding new, not previously described, beta-lactamase of class A (In1375). Identification of novel genetic structures of antibacterial resistance in P. aeruginosa strains isolated during three years indicates activity of genetic processes, associated with antibiotic resistance in hospital pathogens in the department of neurore-animation indicates the activity of genetic processes associated with the formation of multiple drug resistance of hospital pathogens.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, novel class 1 intégrons, novel gene cassettes, blaC 15, multi drug resistance.
Введение
Pseudomonas aeruginosa является одним из основных госпитальных патогенов во всем мире, данный вид бактерий включен в группу ESKAPE патогенов, «избегающих» действия антибиотиков благодаря наличию у них разнообразных механизмов антибиотикорезистентности [1]. Полирезистентные P. aeruginosa занимают значимое место среди госпитальных бактериальных патогенов, выделяемых в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), часто они являются причиной инфекций дыхательной [2] и мочевыводящей систем [3], а также инфекций кровотока и хирургических ран [4]. Основными молекулярными механизмами множественной лекарственной устойчивости (МЛУ, MDR) у клинических изолятов псевдомонад являются наличие гиперэкспрессируемых эффлюксных насосов семейства RND (Resistance Nodulation Cell Division) [5—7] и приобретение интегронов класса 1, несущих генные кассеты устойчивости к аминогликозидам, бета-лак-тамам, хлорамфениколу, карбапенемам и макролидам [8].
Большая часть госпитальных штаммов P. aeruginosa обладает устойчивостью к бета-лактамам, в том числе к карбапенемам, что связано с наличием у них генов бета-метал-
ло-лактамаз, особенно bla„„ - и bla,„„-типов в составе инте' VIM IMP
гронов [9]. Гены бета-лактамаз класса А (blaKpc-, blaGES- и blaCTX м-типов) и класса D (bla^-типа) встречаются в геномах P. aeruginosa сравнительно реже [10, 11]. Первый случай обнаружения гена blaCTX м-типа в Pseudomonas sp. описан в Нидерландах [12], а ранее был впервые обнаружен в штаммах энтеробактерий, выделенных в Индии в 1999 г. [13]. В России ген blaCTX в P. aeruginosa как в бактериальном хозяине описан не был, хотя широко распространен среди госпитальных штаммов Enterobacteriaceae [14].
В ОРИТ из-за масштабного использования антибактериальных препаратов создаются условия для селекции MDR генетических линий патогенов. P. aeruginosa обладают большим набором механизмов распространения анти-биотикорезистентности по вертикальному и горизонтальному типу: гены, интегроны, транспозоны, плазмиды, про-фаги, острова резистентности [15]. Мобильные генетические элементы интегроны являются не только инструментом мобилизации генетических детерминант антибиотикорезистентности у бактерий, но также представляют собой своеобразные «депо» генов лекарственной устойчивости, так как могут одновременно нести большое количество генных кассет, определяющих устойчивость не только к отдельным антибиотикам, но и к разным классам антибактериальных препаратов. Приобретение бактериальной клеткой интегрона с большим набором генных кассет может обеспечить ей быстрое превращение в MDR МЛУ организм [16].
Данная работа посвящена идентификации генетических детерминант антибиотикорезистентности и определению структуры мобильных генетических элементов — новых интегронов класса 1 — у P. aeruginosa, выделенных от пациентов в отделении нейрореанимации в 2013—2016 гг.
Материал и методы
Биоэтические требования
Материалы, использованные в работе, не содержат персональных данных пациентов. Полученные от них клинические изоляты промаркированы без указания фамилии, даты рождения, адреса проживания, номера истории болезни и личных документов и других именных материалов. В то же время, в соответствии с требованиями биоэтического комитета Российской Федерации, каждый пациент при поступлении в клинику заключил договор с лечебным учреждением, содержащий согласие пациента на проведение лечения и лабораторного обследования, в том числе на углубленное обследование с использованием инструментальных методов.
Штаммы бактерий и культивирование
Антибиотикорезистентные изоляты P. aeruginosa (n=105) выделены от 67 пациентов, находившихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ) и с установленными уретральными катетерами в отделении нейрореанимации Москвы в период с сентября 2013 г. по сентябрь 2016 г. Видовую идентификацию бактерий осуществляли с помощью приборов VITEK-2 («Biomerieux», Франция) и MALDI-TOF Biotyper («Bruker», Германия). Бактерии культивировали на питательных средах: «Питательная среда №1 ГРМ» (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия), LuriaBertanibroth («Difco», США) и Muller-Hinton («Himedia», Индия). Хранение бактериальных культур осуществляли в 10% глицерине при температуре минус 70 °C.
Чувствительность к антибактериальным препаратам
Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибактериальных препаратов 9 функциональных классов: бета-лактамов (амоксициллин/клавулановая кислота, амок-сициллин/сульбактам, цефуроксим, цефокситин, цефотак-сим, цефтриаксон, цефтазидим, цефоперазон/сульбактам, цефепим, имипенем, меропенем); тетрациклинов (тетрациклин, тигециклин), хинолонов (ципрофлоксацин), фени-колов (хлорамфеникол), аминогликозидов (гентамицин, не-тилмицин, амикацин), сульфаниламидов (триметоприм, ко-тримоксазол), нитрофуранов (нитрофурантоин), фосфо-мицинов (фосфомицин) и полимиксинов (колистин) опре-
деляли с помощью прибора Vitek-2 («Biomerieux», Франция). Результаты интерпретировали в соответствии с рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) (http://www.eucast.org/clinical_ breakpoints/). В качестве контролей использовали штаммы E. coli ATCC 25922 и E. coli ATCC 35218.
Детекция генетических детерминант
антибиотикорезистентности
Для ПЦР-детекции детерминант антибиотикорезистентности использовали праймеры на гены бета-лактамаз
WaTEM [П], WûSHV [14], «ÛCTX-M [U], bl«OXA-48-Hke [19Ь b^NDM [20]
и blaVlM [21], интегронов класса 1 [22] и класса 2 [22, 23]. Для секвенирования полноразмерной копии гена WaCTX-M-|5 использовали 2 пары праймеров: (ISEcp1U1 — CTX-M-R1) и (CTX-M-Fext — P2D) [24]. В качестве матрицы для амплификации использовали термолизаты [14]. ПЦР проводили в приборах Gradient Palm Cycler («Corbert Research», Австралия) и Терцик («ДНК-Технология», Россия) с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации в 1,5% агарозном геле.
Секвенирование ДНК
Секвенирование ПЦР-продуктов осуществляли с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 kit, анализировали на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant в фирме «Syntol» (Москва, Россия).
Биоинформационный анализ
Анализ первичных последовательностей ДНК проводили с помощью программ Vector NTI9 («Invitrogen», США), CHROMAS («Technelysium», США) и веб-ресурса BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Анализ структуры интегронов проводили с помощью веб-ресурса INTEGRAL (http://integrall.bio.ua.pt). Анализ последовательностей IS-элементов проводили с помощью веб-ресурса ISfinder (https://www-is.biotoul.fr/index.php).
Депонирование последовательностей ДНК
В базе данных GenBank размещены секвенированные нуклеотидные последовательности P. aeruginosa: ген blaCTX M 15 (KU926353, KX944738); ген blaVIM 2 (KF971881, KJ363322, KJ363324, KJ469367, KM009109, KP455672, KP713394, KP713395, KX216849, KX896437, KX896438); на-
бор генных кассет aadA6-orfD (KP713392, KU870999, KU901705); набор генных кассет aac(3)lc-cmlA5 (KU901704); набор генных кассет gcu87-aadB-aphA15d-aadA1a (KX218442); blarüL]-aacA4 (KY171972), aadA6A3::lS-Pa21e-gcuD (KY870013).
Результаты
Антибиотикорезистентность штаммов P. aeruginosa
Антибиотикорезистентные госпитальные штаммы P. aeruginosa (n=105) выделены в отделении нейрореанимации Москвы с сентября 2013 г. по сентябрь 2016 г. преимущественно из органов дыхания (60,0%) и мочи (28,6%), а также из хирургических ран (5,7%), крови (2,9%) и цереброспинальной жидкости (2,9%). Изучение чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам 9 функциональных классов показало, что к бета-лактамам и сульфаниламидам устойчивы 100% штаммов, к тетрациклинам — 96,8%, к нитрофуранам — 91,0%, к фениколам — 88,1%, к фторхинолонам — 73,3%, к аминогликозидам — 71,3%, к фосфомицинам — 67,9%, к по-лимиксинам — 8,3% штаммов. Большинство штаммов характеризовалось фенотипом множественной антибиотикорези-стентности — к 3 и более классам препаратов были устойчивы 92,4% штаммов, причем 62,7% штаммов были устойчивы к 5—6 функциональным классам препаратов (рис. 1).
Детекция генов бета-лактамаз
Для расшифровки молекулярно-генетических механизмов антибиотикорезистентности у исследуемых штаммов осуществляли ПЦР-детекцию генов бета-лактамаз, интегронов классов 1 и 2 и определяли первичную структуру наборов генных кассет интегронов. Гены бета-лактамаз TEM-, SHV- и NDM-типов не обнаружены. Гены карба-пенемаз VIM-типа (blaV|M 2) выявлены в составе интегро-нов класса 1 у 37,7% штаммов.
В двух штаммах, P. aeruginosa t9P1 и P. aeruginosa B-971/16, выделенных из трахеи пациентов, находящихся на искусственной вентиляции легких, 13.11.15 и 22.06.16 был детектирован ген бета-лактамазы расширенного спектра blaCTX M . Полная нуклеотидная последовательность этого гена и его ближайшее генетическое окружение были размещены в базе данных GenBank [KU926353 и KX944738]. Данные штаммы обладали устойчивостью к 6 функцио-
Рис. 1. Доля штаммов Р. аeruginosa (п=105), устойчивых одновременно к нескольким функциональным классам антибактериальных препаратов.
Рис. 2. Схема расположения двух пар праймеров (ISEcp1 U1 — CTX-M-R1) и (CTX-M-Fext — P2D), использованных для секвенирования гена blaCTX-M-15 и его генетического окружения в штамме P. aeruginosa t9P1 [GenBank KU926353].
Рис. 3. Структура нового интегрона In1379 в штамме P. aeruginosa B-2113P/15 [GenBankKX870013].
нальным классам антибактериальных препаратов: бета-лак-тамам (амоксициллину/клавулановой кислоте, амоксицил-лину/сульбактаму, цефуроксиму, цефокситину, цефотак-симу, цефтриаксону, цефтазидиму, цефоперазону/суль-бактаму, цефепиму), фторхинолонам (ципрофлоксацин), аминогликозидам (гентамицину, нетилмицину), сульфаниламидам (триметоприму и котримоксазолу), нитрофу-рантоину, фосфомицину; и были чувствительны к карба-пенемам (имипенему и меропенему), к амикацину и коли-стину. Анализ секвенированных последовательностей ДНК показал, что перед геном blaCTX M |5 располагаются мобильный генетический элемент ISEcpl и межгенный спейсер (48 п.н.), характерный для гена blaCTX M 15, а после гена — участок ДНК, часто обнаруживаемый на плазмидах энте-робактерий, несущих ген blaCTX M 15 (рис. 2).
Детекция интегронов класса 1
В изучаемой коллекции P. aeruginosa большинство штаммов несли интегроны класса 1 (63,0% штаммов), а ин-тегроны класса 2 не обнаружены. У 36,7% интегронов класса 1 выявлены вставки, представленные наборами генных кассет 7 видов: (blaV|M_2_|ikc), (aadA6-gcuD), (aacA7-blavm_2hJ, (aac(3')Ic-cmlA5), (aadA6A3::ISPa21e-gcuD), (gcu87-aadB-aphA15d-aadA1a) и (b/apBL 1-aacA4). В составе выявленных кассет присутствуют гены, обеспечивающие устойчивость к антибактериальным препаратам разных функциональных классов: бета-лактамам (blaV|M 2 |ikc и blapBL 1), аминогликозидам (aadA6, aacA7, aac(3')Ic, aadB, aphA15d, aadAla и aacA4), фениколам (cmlA5), а также гены, кодирующие гипотетические белки с неизвестными функциями (gcuDw%cu87). Интересно, что первые 4 набора генных кассет были ранее описаны у P. aeruginosa, в то время как остальные 3 набора ранее в интегронных структурах бактерий не были обнаружены. Впервые они идентифицированы нами в клетках P. aeruginosa.
Новый интегрон In1379
В геноме штамма P. aeruginosa t9P1, несущего ген bla,., описанного выше, выявлен также новый инте-
C 1 A- IV1 -15
грон класса 1 с набором генных кассет (aadA6:ISPa21-orfD), в котором в генную кассету аминогликозидаденилил-транс-феразы aadA6 встроился IS элемент ISPa21 в ориентации, противоположной направлению транскрипции поврежденного гена (рис. 3). Этому новому интегрону специализированной базой данных INTEGRAL присвоен индивидуальный номер In1379.
Новый интегрон In1360
В штамме P. aeruginosa B-1384P/15, выделенном из эн-дотрахеального аспирата от пациента нейрохирургического ОРИТ 27.07.15, описан новый интегрон класса 1, которому базой INTEGRAL присвоен номер In1360. Вариабельная часть этого интегрона состоит из набора четырех генных кассет: новой генной кассеты orfNC с неизвестной функцией, которой в базе данных INTEGRAL присвоено наименование gcu87; генной кассеты aadB, кодирующей аминоглико-зид-2'-аденилтрансферазу (aminoglycoside 2'-adenyltransfer-ase); нового аллеля aphA15d генной кассеты aphA15 (по данным базы данных INTEGRAL), детерминирующей аминогликозидфосфо-трансферазу (aminoglycosidephos-pho-transferase), и генной кассеты aadA1a, кодирующей ами-ногликозид аденилтрансферазу (aminoglycosideadenyltrans-ferase) (рис. 4). Видимо, данный интегрон внес свой вклад в фенотип антибиотикорезистентности штамма P. aeruginosa B-1384P/15, который характеризовался устойчивостью к 7 функциональным классам антибактериальных препаратов: бета-лактамам (амоксициллину/клавулановой кислоте, амоксициллину/сульбактаму, цефуроксиму, цефотаксиму), фторхинолонам (ципрофлоксацин), аминогликозидам (гентамицину), сульфаниламидам (триметоприму и котримоксазолу), тетрациклинам (тигециклин), нитрофурантоину и
Рис. 4. Структура нового интегрона In1360 в штамме P. aeruginosa B-1384P/15 [GenBankKX218442]: набор генных кассет (А); первичная нуклеотидная последовательность новой генной кассеты gcu87 (В); аминокислотная последовательность гипотетического белка — продукта генной кассеты gcu87 (С).
In1360
5'.
gcii87 40? bp
aadB ЯН bp
aphAlid 795 bp
аигаддидтиф-
aud i la 792 bp
■У
В gggeccaa a ec ATG ATA AAGGC CATGC GCC ACATTACTATAGC T AC АЛС AATCGCCATCGTTGCTCTCGGC T GCGCTCTTGCATGGTCATATAACTTCGGCACTGAAGCTGAACGAACCGCGTTCATTCCTGCCAAGTGG AAAGAAAGAGCTAATGTCTATCK^TTACAGCAACGATCCCGGATGCATTCGTGGAGACATGGCCCTCGA С ATAG TTGC AAC AGA TATGCTTATTGGC A AAACGGTTACAG ACACAAGGGCGCTGCTTGGCG AGCC АА ATAAG AGC AGTG CTG ACGCTTTATATTATG AGC TAGG TCAGTGTTCTGGCTTrGGGTG GT ACG AATC CG AGCTGGTCGT/\j\CTTTCAGT/VVi\TCTCAGCGCGCATC/V\.'\GACAGi\v\ATTACGCGAGCiV\CCCCT.-\AC TAfileellcnngtcgllcgcllcBtlcacllcgBJCglccJaJagctBCBCIIilgBcccccjcllaaccaajg
С." MIKAMRHITIATriAIVALGCALAWS^'NFGTEAERTAFIPAKWKERANV^'AVSNDPGClRGDMALDIVATD i\n.lGKT\TDTRA[.LGF.PN'KSSADAL^"i'ELGQCSGFGWYESEL\'\TFSKSQRASKTF.ITRATPN
хлорамфениколу; был чувствителен к бета-лактамам (цеф-тазидиму, цефоперазону/сульбактаму, цефепиму и имипе-нему), к аминогликозидам (амикацину) и полимиксинам (колистину).
Новая генная кассета gcu87 (487 п.н.) занимает первое место в наборе генных кассет вариабельного участка инте-грона, содержит открытую рамку считывания размером 405 п.н., которая не имеет аналогов в базе данных GenBank. Трансляция нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания in silico позволила определить аминокислотную последовательность (134 а.к.) нового гипотетического белка. Наибольшая степень идентичности данной белковой последовательности в базе данных белковых последовательностей GenBank обнаружена с последовательностями гипотетических белков псевдомонад P. hussainii (55%), P. cae-ni (43%) и P. pohangensis (43%). Для вида P. aeruginosa подобных белковых последовательностей не обнаружено.
Новый интегрон ln1375
В штамме P. aeruginosa В-2175P/15, выделенном 30.11.15 из мочи пациента, идентифицирован новый интегрон класса 1. Секвенирование вариабельного участка интегрона показало, что в его составе находятся 2 генные кассеты: ранее не описанная кассета (1236 п.н.) с неизвестной функцией и кассета аминогликозидацетилтрансферазы aacA4 (639 п.н.), определяющая устойчивость к аминогликозидам. Поиск в базе данных GenBank не выявил гомологичных последовательностей ДНК с первичной последовательностью новой кассеты. Поиск по аминокислотной последовательности, кодируемой данным геном, показал, что в базе данных белковых последовательностей присутствуют 5 бета-лактамаз класса A с идентичностью более 70%: в штамме Cellvibrio sp. (GB WP_087466909.1) — 83% идентичности, в штамме Cellvibrio sp. (GB PSBB023) — 82% идентичности, в штамме Pseudoxanthomonassuwonensis (GB WP_052629552.1) — 78%, в штамме Alishewanellaaestuarii (GB WP_008607360.1) — 72% и в штамме Alishewanella sp.
HH-ZS (GB WP_065956549.1) — 71% идентичности. Результат поиска позволил сделать вывод, что новая генная кассета содержит ген новой бета-лактамазы класса А, который нами был обозначен blaPBL|. Новый интегрон размещен в базе данных GenBank (GenBank KY171972) и в специализированной базе данных INTEGRAL, где интегрону присвоен идентификационный номер In1375, подтверждено наличие новой генной кассеты и утверждено ее наименование blaPBL 1 (рис. 5). Фенотип штамма P. aeruginosa ß-2175P/15 характеризуется устойчивостью к 6 функциональным классам антибактериальных препаратов — ко всем использованным бета-лактамам, фторхинолонам (ципро-флоксацину), аминогликозидам (гентамицину, нетилми-цину, амикацину), сульфаниламидам (триметоприму, ко-тримоксазолу), нитрофурантоину, фосфомицину, и чувствительностью только к колистину.
Новая кассета содержит рамку считывания размером 903 п.н., которая кодирует белковую последовательность 300 а.к. Сравнение аминокислотной последовательности, транслируемой с гена bla PBL 1, с наиболее близкой последовательностью бета-лактамазы класса А с 83% идентичности показало, что они отличаются по 52 аминокислотам, локализованным практически по всей длине последовательностей, что указывает на существенные различия этих структур (рис. 6).
Таким образом, в госпитальном штамме P. aeruginosa идентифицирован новый интегрон класса 1, несущий новую, не описанную ранее генную кассету, которая кодирует новую бета-лактамазу класса А. Предметом дальнейшего исследования являются характеристика данного фермента и определение его вклада в формирование фенотипа антибиотикорезистентности.
Обсуждение
При изучении коллекции антибиотикорезистентных госпитальных изолятов P. aeruginosa, выделенных в Москве в
In1375
Ыа pBL-l aacA4
903 bp 555 bp
caaicagcacatcatgtga cciiai gtmcttgaaacaaacai aigcacgtcaiaicecggigttcatagacaaica iiaangeaaggaaaiaEgaATGGTTACAA GGCGAGATTTTTTGATTGCTTCAGCGGCAAC GGCCGC TCTTCT A AC*] TTGCCAG CTACTGCAAAAGTTC В С CTCG CGTCGCTTTGACGC АТС AGCG A AGC TTC AG TCG CTTGA AGC'GGG AC AGGCG CGCCTTGG T G TT TGCTTCCTCG АТАС G GTTACTGG TGAAGTC AGCGGTAACCGT ATCGAGG AG CGCTTTGC AATGTGCTC G ACGG TC AAG CTGGC A AT AGTTGCCGCC TG CTTG CG CG AGGC AG AT A AGGCG CGCTTG AATCTCG AGG AGATACTGACCTATTCAGAGGCGGATCTTCTTCCrTGGGCGCCAGTGACGCGCAAGAATCTCGCCAAA G GCGGTC TGAGTATTTCCGCTCTGG CG С AAG CGG CTC AAGAAATG AGCGATGGTGTTG CCGC TAACCT TTTAATC AAAC GCCTAGGCGGTCC'TGCCGCCG TCACCGCG AAGTTCCGAG AAATGGG CG ATTC G GTG A CCCGCCTTG АТС GTT ATG AGCC AG ACTTAGG G TTAGTTC TTTC AG CCG ATGTTCG CG ACACC ACCACGC CCCTTGCTTATGCGCAACTTGTCCG TCG А АТС ACG ACTGGC CGTGTTTTGTCGCACG G ATCGCGGGAAC AACTTTTAG AG TG GATGC GAAATACAGTCACAGGCGCCAGTCG G CTGCGAGC С GGCCTCCC С ACTG AA TG GCGTACTGGGA AC AAGACAGGG ACTGGGCGCG AC GAAGGG ACG ACC AACAAGTOCAATOACOTC G CTATTACTTTTCCG С CAAGCAAG AACCCAАТС ATCATTG С AGCCTATTTCGAC AGCGGC G AATACAC AG AAA AG GTAG AGGCGAGG CATG AGGCTGTCCTCGCTG AAGTGGG AA AG ATTGCTG CCGAATGGGGC GAGaeiiaatBlgceaaciacacaaicacmailiaaaaaaltaeaatciaegiagaiactlaca^^
giaagcclaacaaatcgctcaagcaccgcaeacnGgtgtgCgggacagntttaagtcgcagltltgtggtttlgctgcgcaaaattattccacaaaaccgcaacltaaaaac tgccecttaectcgecg
Рис. 5. Структура нового интегрона In1375 в штамме P. aeruginosa В-2175P/15 [GenBank KY171972]: набор генных кассет (А); первичная нуклеотидная последовательность новой генной кассеты blaPBL-1 (В). Последовательность гена бе-та-лактамазы выделена заглавными буквами.
PBL-1 1 MVTRRD F LIASAATAALLTLPATAKVPSRRFDASAKLQSLEAGQARLGVCFLDTVTGEVS £0
WP_ 087466909 1 MFTRRDFLITSMAASSLLAMPAAAEPATRRFDAhEBLRALEVGHARLGVCFLDTVTGEIS 60
PBL-1 61 GNRIEERFAMCSTVKLAXVAACLREADKARLNLEEILTYSEADLLPWAPVTRKNLAKGGL 120
WP .087466909 61 GNRIE£RFA^STFKXAMVAACIJi£ADNGHXJiLEEXLPYSEADLLPWA 120
PBL-1 121 SISALAQAAQEMSDGVAAHLLIKRLGGPAAVTAKFREMGDSVTRLDRYEPDLGLVLSADV ieo
WP. .087466909 121 SI ATIAi^QEMSDGVAAHLLVKRLGGP^VTTKFREMGDT\miLDRYEPDLGLVLSADT 180
PBL-1 181 RDTTT P LAYAQLVRRITTGKVLSHGSREQLLEWMRHTVTGASRLRAGLPTEWRTGNKTGT 240
WP .087466909 1S1 RDTTSPJLAYAELVRQI LTGSILRMSREQIJ^WTRNTATGARRLRAGLPPEVfRTGNKTCT 240
PBL-1 241 GRDEGTTNKCNDVAITF PPSKNPIIIAAYFDSGEYTEKVEARHEAVLAEVGKIAAEWGES 300
WP „087466909 241 GRDEGTTNKCNDVAITFPPSKNPIIIAAYFDSGEYTEKTEERKDAVLAEVGКIAAEWAIS 300
Рис. 6. Сравнение аминокислотной последовательности, транслируемой с гена Ыа^^, с наиболее близкой последовательности бета-лактамазы класса А.
2013—2016 гг., показано, что большинство из них являются полирезистентными — 92,4% устойчивы к 3 и более классам антибактериальных препаратов (MDR-фенотип), а 62,7% устойчивы к 5—6 функциональным классам препаратов. Настораживает тот факт, что к каждому из 4 функциональных классов — нитрофуранов, тетрациклинов, сульфаниламидов и бета-лактамов — резистентны 90—100% штаммов, а 8% штаммов из коллекции устойчивы даже к полимикси-нам (резервному антибиотику колистину). Большая часть изолятов были выделены из дыхательной и мочевыводящей систем, что указывает на то, что инфицирование пациентов ассоциировано с использованием системы искусственной вентиляции легких и наличием уретрального катетера.
В ходе определения молекулярно-генетических механизмов антибиотикорезистентности у P. aeruginosa, одного из ведущих патогенов, вызывающих ИСМП в отделении нейрореанимации, выявлены генетические детерминанты, кодирующие устойчивость к антибактериальным препаратам. В штаммах нашей коллекции P. aeruginosa идентифицированы гены бета-лактамаз WaVIM-2-Hkc и b/aCTX_M_|5, а также интегроны класса 1, что указывает на важность данных генетических детерминант для формирования фенотипа полирезистентности данного патогена. Известно, что ген b/a^-типа широко распространен среди госпитальных штаммов P. aeruginosa в разных регионах мира [25, 26] и в Российской Федерации [27]. В нашей коллекции ген blaVlM2
присутствует у 37,7% штаммов. Гены blaCTX м-типа у P. aeruginosa идентифицируются крайне редко. В данной работе описан первый случай выявления гена этого типа (blaCTX M ) у P. aeruginosa в России. На момент проведения анализа (16.03.16) в базе данных GenBank полная копия гена blaCTX M (876 п.н.) не была представлена; были размещены только 4 последовательности, представляющие собой фрагменты данного гена: 318 п.н. (Иран, 2015) [GenBank KP780166], 500 п.н. (Индия, 2015) [GenBank: KR824154], 614 п.н. (Индия, 2015) [GenBank: KR824153] и 551 п.н. (Швейцария, 2015) [GenBank: KP172296], что не позволяет с уверенностью утверждать о принадлежности этих последовательностей гену blaCTX M , поскольку не исключена возможность наличия мутаций в несеквенирован-ных участках гена. Полная копия гена blaCTX M размещена нами в базе данных GenBank 14.03.16, что позволяет утверждать, что на территории России был идентифицирован новый бактериальный хозяин гена blaCTX 5 — P. aeruginosa. Аналогичная выявленной нами структура гена blaCTX и его генетическое окружение ранее описаны для широкого круга энтеробактерий [24], а также были выявлены нами ранее в данном нейрохирургическом ОРИТ в госпитальных штаммах Klebsiella pneumoniae [KC817480; KU360116] и Proteus mirabilis [KC822920; KT175890] [28], что указывает на энтеробактерии как на возможный источник получения гена blaCTX M клетками P. aeruginosa.
В большинстве исследованных штаммов выявлены ин-тегроны класса 1, которые, как известно, наряду с эффлюкс-ными насосами, отвечают за формирование полирезистентности P. aeruginosa [8]. Среди 7 типов наборов генных кассет 3 набора являются новыми для интегронов класса 1, на основании чего специализированной базой данных INTEGRAL присвоены идентификационные номера новым интегронам (In1360, In1375 и In1379). Генная кассета (aadA6A3::ISPa21e-gcuD) является уникальной структурой благодаря инсерции ISPa21e элемента в генную кассету aadA6 (новый интегрон In1379). Набор (gcu87-aadB-aphA15d-aadAla) (новый интегрон In1360) включает в себя 3 описанные ранее генные кассеты, кодирующие аминогликозид-мо-дифицирующие ферменты, а первая кассета этого набора представляет собой ранее не описанный ген, кодирующий гипотетический белок, не представленный в базе данных GenBank (новый интегрон In1375). Набор генных кассет
(blapBL -aacA4) уникален тем, что на первом месте в нем находится генная кассета новой бета-лактамазы bla , не описанная в базе данных GenBank (новый интегрон In1378), но имеющая 72—83% гомологии с 4 последовательностями генов бета-лактамаз класса A из базы данных GenBank.Таким образом, у госпитальных штаммов P. aeruginosa в течение достаточно короткого периода времени наблюдения (3 лет) в отделении нейрореанимации идентифицировано появление новых генетических структур — интегронов класса 1.
Заключение
Впервые в России в полирезистентных госпитальных штаммах P. aeruginosa был идентифицирован ген бета-лак-тамазы расширенного спектра blaCTXM1. с генетическим окружением, характерным для семейства Enterobacteriace-ae. Полученные данные подтверждают продолжающееся распространение эпидемически значимого гена blacCTX_M_15 в новые виды госпитальных патогенных бактерий.
В ходе исследования описаны 3 новых интегрона класса 1 — In1379, In1360 и In1375, в которых идентифицированы новые генетические структуры: генная кассета aadA6 с ISPa21e элементом, генная кассета gsu87, генная кассета aphA15d и генная кассета b/aPBL_p кодирующая не описанную ранее бета-лактамазу класса А.
Наблюдаемое появление новых генетических структур антибиотикорезистентности у штаммов P. aeruginosa свидетельствует об активности генетических процессов, ассоциированных с формированием множественной лекарственной устойчивости у госпитальных патогенов.
Данная работа выполнена при финансировании в рамках НИР 049 Роспотребнадзора.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Этические требования/Ethicalapproval
Все процедуры получения бактериальных штаммов от пациентов в данном исследовании соответствовали «Положению о локальном этическом комитете в Национальном медицинском исследовательском центре нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко Минздрава РФ» от 10.11.15, Национальному стандарту РФ ГОСТ-Р 523 79-2005 «Надлежащая клиническая практика», а также Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. с внесенными в нее изменениями 1975—2013 гг.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
Santajit S, Indrawattana N. Mechanisms of Antimicrobial Resistance in ES-KAPE Pathogens. Biomed Res Int. 2016;2475067. https://doi.org/10.1155/2016/2475067
Rodrigo-Troyano A, Sibila O. The respiratory threat posed by multidrug resistant Gram-negative bacteria. Respirology. 2017;22(7):1288-1299. https://doi.org/10.1111/resp.13115
Valadbeigi H, Sadeghifard N, Salehi MB. The Prevalence ofpilA and algD Virulence Genes in Pseudomonas aeruginosa Urinary Tract and Tracheal Isolates. Infect Disord. Drug Targets. 2017;104:28-31. https://doi.org/10.2174/1871526517666170427121956 Dortet L, Poirel L, Nordmann P. Rapid identification of carbapenemase types in Enterobacteriaceae and Pseudomonas spp. by using a biochemical test. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(12):6437-6440. https://doi.org/10.1128/AAC.01395-12
Shahcheraghi F, Badmasti F, Feizabadi MM. Molecular characterization of class1 integrons in MDR Pseudomonas aeruginosa isolated from clinical settings inIran, Tehran. FEMS Immunol. Med Microbiol. 2010;58:421-425.
10.
Terzi HA, Kulah C, Ciftci'IH. The effects of active efflux pumps on antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa. World J Microbiol Biotechnol. 2014;30:2681-2687.
Goudarzi SM, Eftekhar F. Multidrug resistance and integron carriage in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in Tehran, Iran. Turk J Med Sci. 2015;45:789-793.
Chen J, Su Z, Liu Y, Wang S, Dai X, Li Y, et al. Identification and characterizationof class 1 integrons among Pseudomonas aeruginosa isolates from patients in Zhenjiang, China. Int J Infect Dis. 2009;13:717-721. Shamaeva SK, Portnyagina US, Edelstein MV, Kuzmina AA, Maloguloval S, Varfolomeeva NA. Results of monitoring metallo-beta-lactamase-producing strains of Pseudomonas aeruginosa in a multi-profile hospital. Wiad Lek. 2015;68(4):546-548.
Miriagou V, Cornaglia G, Edelstein M, Galani I, Giske CG, Gniadkowski M, et al. Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial pathogens: detection and surveillance issues. Clin Microbiol Infect. 2010; 16(2):112-122. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2009.03116.x
6.
7
2.
8
3.
9.
4.
5.
11. Hong JS, Yoon EJ, Lee H, Jeong SH, Lee K. Clonal Dissemination of Pseudomonas aeruginosa Sequence Type 235 Isolates Carrying blaIMP-6 and Emergence of blaGES 24 and Ь/о[МР ю on Novel Genomic Islands PAGI-15 and -16 in South Korea. Antimicrob Agents Chemother. 2016;60(12):7216_7223. https://doi.org/10.1128/AAC.01601_16
12. alNaiemi N, Duim B, Bart A. A CTX-M extended-spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonasmaltophilia. J Med Microbiol. 2006;55(Pt 11): 1607-1608. https://doi.oiE/10.1099/jmm.0.46704-0
13. Karim A, Poirel L, Nagarajan S, Nordmann P. Plasmid-mediated extended-spectrum beta-lactamase (CTX-M-3 like) from India and gene association with insertion sequence IS Ecp1. FEMS Microbiol Lett. 2001 ;201 (2):237-241.
14. Прямчук С.Д., Фурсова Н.К., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И. и др. Генетические детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам в нозокомиальных штаммах Escherichia coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., выделенных в России в 2003— 2007 гг. Антибиот и химиотер. 2010;55(9-10):3-10. [Priamchuk SD, Fursova NK, Abaev IV, Kovalev YuN, Shishkova NA, Pecherskikh EI, et al. [Genetic determinants of antibacterial resistance among nosocomial Escherichia coli, Klebsiella spp., and Enterobacter spp. isolates collected in Russia within 2003—2007]. Antibiot Khimioter. 2010;55(9_10):3_10. (In Russ.)].
15. Botel ho J, Grosso F, Peixe L. Characterization of the pJB12 Plasmid from Pseudomonas aeruginosa Reveals Tn6352, a Novel Putative Transposon Associated with Mobilization of the bla^,^ 2-Harboring In58 Integron. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61(5):pii: e02532-16. https://doi.org/10.1128/AAC.02532-16
16. Li J, Zou M, Dou Q, Hu Y, Wang H, Yan Q, et al. Characterization of clinical extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa in the Hunan province of China. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2016;15(1):35. https://doi.oiE/10.1186/s12941-016-0148-y
17. Rasheed JK, Jay C, Metchock B, Berkowitz F, Weigel L, Crellin J, et al. Evolution of extended-spectrum beta-lactam resistance (SHV-8) in a strain of Escherichia coli during multiple episodes of bacteremia. Antimicrob Agents Chemother. 1997;41(3):647-653.
18. Edelstein M, Pimkin M, Palagin I, Edelstein I, Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum beta-lact-amase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(12):3724-3732.
19. Poirel L, Bonnin RA, Nordmann P. Genetic features of the widespread plas-mid coding for the carbapenemase OXA-48. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(1):559-562.
20. Yang J, Chen Y, Jia X, Luo Y, Song Q, Zhao W, et al. Dissemination and characterization of NDM-1 -producing Acinetobacterpittii in an intensive care unit in China. Clin Microbiol Infect. 2012;18(12):506-513. https://doi.org/10.1111/1469-0691.12035
21. Dallenne C, Da Costa A, Decre D, Favier C, Arlet G. Development of a set of multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important beta-lact-amases in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother. 2010;65:490-495.
22. Jiang X, Ni Y, Jiang Y, Yuan F, Han L, Li M, et al. Outbreak of infection caused by Enterobacter cloacae producing the novel VEB-3 beta-lactamase in China. J Clin Microbiol. 2005;43(2):826-831.
23. Skurnik D, Le Menac'h A, Zurakowski D, Mazel D, Courvalin P, Denamur E, et al. Integron-associated antibiotic resistance and phylogenetic grouping of Escherichia coli isolates from healthy subjects free of recent antibiotic exposure. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(7):3062-3065.
24. Eckert C, Gautier V, Arlet G. DNA sequence analysis of the genetic environment of various blaCTX M genes. J Antimicrob Chemother. 2006;57(1): 14-23. https://doi.org/10.1093/jac/dki398
25. Feng W, Sun F, Wang Q, Xiong W, Qiu X, Dai X, et al. Epidemiology and resistance characteristics of Pseudomonas aeruginosa isolates from the respiratory department of a hospital in China. J Glob Antimicrob Resist. 2017;8:142-147.
26. Acharya M, Joshi PR, Thapa K, Aryal R, Kakshapati T, Sharma S. Detection of metallo-ß-lactamases-encoding genes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in a tertiary care hospital, Kathmandu, Nepal. BMC Res Notes. 2017; 10(1 ):718.
27. Edelstein MV, Skleenova EN, Shevchenko OV, D'souza JW, Tapalski DV, Azizov IS, et al. Spread of extensively resistant VIM-2-positive ST235 Pseudomonas aeruginosa in Belarus, Kazakhstan, and Russia: a longitudinal epidemiological and clinical study. Lancet Infect Dis. 2013;13(10):867-876. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70168-3
28. Fursova NK, Astashkin EI, Knyazeva AI, Kartsev NN, Leonova ES, Ersho-va ON, et al. The spread of bla0XA 4X and bla0XA 244 carbapenemase genes among Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Enterobacter spp. isolated in Moscow, Russia. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2015;14:46. https://doi.org/10.1186/s12941_015_0108_y
Поступила в редакцию 13.02.18 После доработки 15.02.18 Принята к публикации 29.03.18
Сведения об авторах:
Асташкин Евгений Ильич [Astashkin Evgeny IliichJ, канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора; 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0002-3559-9071
Лев Анастасия Игоревна [Lev Anastasia IgorevnaJ, младший научный сотрудник ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора; 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0002-0502-4218
Ершова Ольга Николаевна [Ershova Olga NikolaevnaJ, д-р мед. наук, доцент, заместитель главного врача по эпидемиологической работе ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава РФ; 4-я Тверская-Ямская улица, 16, 125047 Москва, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org
Новикова Татьяна Сергеевна [Novikova Tatiana SergeevnaJ, стажер-исследователь ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора; 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0002-1683-4814
Агеева Екатерина Николаевна [Ageeva Ekaterina NikolaevnaJ, младший научный сотрудник ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0002-2976-2813
Федюкина Галина Николаевна [Fedyukina Galina NikolaevnaJ, канд. хим. наук, старший научный сотрудник ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0002-7737-9413
Светоч Эдуард Арсеньевич [Svetoch Edward ArsenievichJ, д-р ветеринар. наук, проф., главный научный сотрудник ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0002-3185-1954
Фурсова Надежда Константиновна [Fursova Nadezhda KonstantinovnaJ, канд. биол. наук, зав. лабораторией ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Oболенск, Серпуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: fursova@obolensk.org; https://orcid.org/0000-0001-6053-2621
