CC BY
65
КМАХ
www.antibiotic.ru/cmac/
КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И АНТИМИКРОБНАЯ ХИМИОТЕРАПИЯ
¡МиПШ
2017
Молекулярная характеристика антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных в травматологических стационарах
Гординская Н.А.1, Бруснигина Н.Ф.2, Алексеева А.Е.2, Солнцев Л.А.2, Савочкина Ю.А.3, Сабирова Е.В.1, Абрамова Н.В.1, Карасева Г.Н.1
1 ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
2 ФБУН «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора, Нижний Новгород, Россия
3 ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия
Контактный адрес:
Наталья Александровна Гординская
Эл. почта: info@nniito.ru
Ключевые слова: раневая инфекция, Klebsiella pneumoniae, антибиотикоре-зистентность, бета-лактамазы расширенного спектра, карбапенемазы.
В работе проанализирована распространенность карбапенеморезистентных штаммов Klebsiella pneumoniae в стационарах Приволжского федерального медицинского исследовательского центра, и изучены механизмы антибиотикорезистентности. За исследуемый год частота выделения K. pneumoniae в разных отделениях центра была практически равна таковой Pseudomonas aeruginosa. В ожоговых отделениях частота выделения штаммов K. pneumoniae, резистентных к карбапенемам, составила в среднем 53,5%, в отделении гнойной остеологии - 2,6%. ПЦР анализ показал, что у 100% карбапенеморезистентных штаммов имеются гены бета-лактамаз расширенного спектра СТХ-М групп, у 79,6% изолятов - гены ОХА-48 карбапенемаз; генов металло^-лактамаз выявлено не было. При полногеномном секвенировании у всех штаммов были выявлены blaSHV и разнообразие сиквенс-типов среди штаммов K. pneumoniae, при этом преобладающим был ST395. Во всех отделениях центра обнаружены штаммы K. pneumoniae, резистентные к полимиксину Е (колистину), их количество у взрослых пациентов с термической травмой достигло 6,6%.
The molecular characteristics of antibiotic-resistant strains of Klebsiella pneumoniae isolated in traumatology hospitals
Gordinskaya N.A.1, Brusnigina N.F.2, Alekseeva A.E.2, Solntzev L.A.2, Savochkina Yu.A.3, Sabirova E.V.1, Abramova N.V.1, Karaseva G.N.1
1 Privolzhsky Federal Medical Research Centre, Nizhny Novgorod, Russia
2 Nizhny Novgorod Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after I.N. Blokhina, Nizhny Novgorod, Russia
3 Central Research Institute of Epidemiology, Moscow, Russia
Contacts:
Nataliya A. Gordinskaya E-mail: info@nniito.ru
Key words: wound infection, Klebsiella pneumoniae, antibiotic resistance, extended spectrum ß-lactamases, carbapenemases.
This study analyzed a prevalence of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains obtained in the Privolzhsky Federal Medical Research Center units and their antibiotic resistance mechanisms. During the study year, the incidence of K. pneumoniae in different units was equal to that of Pseudomonas aeruginosa. The carbapenem-resistant strains of K. pneumoniae were isolated in the average of 53.5% of patients in the burn units and 2.6% of patients in the purulent osteology unit. PCR testing showed that 100% of carbapenem-resistant strains had extended spectrum p-lactamase CTX-M genes, 79.6% of isolates carried genes of OXA-48 carbapenemase; and metallo-p-lactamase genes were not found. A whole genome sequencing detected blaSHV in all of the strains tested and a diversity of sequence types among K. pneumoniae strains, with ST395 being predominant. K. pneumoniae strains resistant to polymyxin E (colistin) were detected in all units, and their prevalence in adult patients with a burn trauma was 6.6%.
Введение
Несмотря на значительное разнообразие возбудителей раневой инфекции в травматологических стационарах, можно выделить довольно ограниченную группу микроорганизмов, на которую приходится подавляющая часть этиологии гнойно-воспалительных процессов. Группу ведущих патогенов составляют как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, при этом последнее десятилетие характеризуется ростом числа грамотрицательных возбудителей, характеризующихся множественной устойчивостью к антимикробным препаратам. Проблема антибиотикорезистентности грамотри-цательных микроорганизмов в настоящее время актуальна во
Гординская Н.А. и соавт.
всем мире [1-3]. Массовое применение в качестве эмпирической терапии ß-лактамов широкого спектра привело к селекции штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), а затем и штаммов, продуцирующих карба-пенемазы. Локализация генов БЛРС и карбапенемаз на подвижных генетических элементах способствовала быстрому внутривидовому и межвидовому переносу этих ферментов [4, 5]. Особенно большое число антибиотикорезистентных штаммов отмечается среди Klebsiella pneumoniae [6]. Распространение полирезистентных нозокомиальных штаммов K. pneumoniae приобретает эпидемический характер, при этом отмечают-
ся региональные особенности доминирования определенных геновариантов, отличающихся по характеру фенотипических проявлений [7]. Так, в ряде клиник США, Франции, Англии, Италии пандемическое распространение получила генетическая линия K. pneumoniae, относящаяся к сиквенс-типу 258 [8, 9]. В странах Прибалтийского региона и Санкт-Петербурге распространены штаммы K. pneumoniae, продуцирующие NDM-1 металло^-лактамазу и относящиеся к сиквенс-типу 340 [10]. Следует отметить, что информация о циркуляции определенных генотипов K. pneumoniae в большинстве регионов России практически отсутствует.
Целью данной работы явился анализ распространенности карбапенеморезистентных штаммов K. pneumoniae в отделениях ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России и определение их моле-кулярно-генетических особенностей.
Материалы и методы
В работе проанализированы штаммы K. pneumoniae (201 штамм), выделенные у пациентов ожоговых стационаров и отделения гнойной остеологии в 2016 г. Биоптаты и соскобы раневого отделяемого засевали на колумбийский агар с 5% бараньей крови (Sredoff, Россия). Видовая идентификация микроорганизмов проводилась на масс-спектрометре Autoflex (Bruker Daltonics, Германия). Антибиотикорезистентность оценивалась c помощью SENSI-LAtest (Erba Mannheim, Германия), к отдельным препаратам определялась на анализаторе VITEC-2 (BioMerieux, Франция) и диско-диффузионным методом на агаре Мюлле-ра-Хинтон (Oxoid, Англия) с помощью сенси-дисков (Oxoid, Англия) в соответствии с методическими указаниями [11].
Детекцию генов металло^-лактамаз групп VIM, IMP, NDM, карбапенемаз групп КРС и ОХА-48 подобных у клебсиелл осуществляли методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ПЦР-РВ) c помощью коммерческих наборов реагентов «АмплиСенс MDR-MBL-FL», «АмплиСенс MDR-KPC/OXA-48-FL» на приборе «Rotor Gene» (Corbett Research, Австралия). Выделение ДНК из штаммов проводили согласно инструкции к набору «ДНК-Сорб-АМ» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия).
Выявление генов БЛРС групп СТХ осуществляли методом ПЦР-РВ с использованием методики, разработанной ФБУН ЦНИИЭ, позволяющей выявлять гены ß-лактамаз групп CTX-M-1-, CTX-M-2-, CTX-M-8/25- и CTX-M-9-подобных, как описано ранее [12].
Полногеномное секвенирование 5 карбапенеморезистент-ных штаммов K. pneumoniae было проведено на базе Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной с использованием секвенатора MiSeq (Illumina, США). ДНК чистых культур K. pneumoniae выделялись с помощью набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). При подготовке библиотеки ДНК для секвенирования использовали набор Nextera XT Sample Preparation kit, секвенирова-ние проводили с использованием набора MiSeq reagent kit v2 (Illumina, США) на 500 циклов.
Выравнивание и сборку полученных коротких чтений относительно референса проводили с использованием встроенного в секвенатор программного обеспечения. Референсом являлась нуклеотидная последовательность штамма K. pneumoniae HS11286 (номер GenBank CP003200.1). С целью поиска ну-клеотидных последовательностей, принадлежащих мобильным элементам (плазмиды, транспозоны, интроны и т.д.) дополни-
тельно проводили сборку полученных чтений de novo c помощью программного обеспечения SPAdes, версия 3.9.1 (http:// spades.bioinf.spbau.ru/release3.9.1/manual.html).
Для аннотации нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов K. pneumoniae использовали программу NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) (http://ncbi.nlm. nih.gov/genome/annotation_prok). Определение сиквенс-типов и поиск детерминант антибиотикорезистентности осуществляли с использованием специализированной для K. pneumoniae базы данных Klebsiella Sequence Typing (http://bigsdb.pasteur. fr/klebsiella/klebsiella.html).
Результаты исследования
Анализ этиологической структуры раневой инфекции в стационарах центра показал практически равное соотношение грамотрицательной и грамположительной микрофлоры в ожоговых отделениях и преобладание грамположительной в отделении гнойной остеологии (таблица 1).
В отделении термической травмы у взрослых пациентов P. aeruginosa, A. baumannii и K. pneumoniae в сумме составили 36,5% раневой микрофлоры, в детском ожоговом отделении -33,1%, а в отделении гнойной остеологии - 12,8%.
В 2016 г. в отделениях центра количество выделенных штаммов K. pneumoniae составило в среднем 12,8% от всей микрофлоры, при этом большая часть клебсиелл обнаружена в ожоговых отделениях. Частота выделения раневых K. pneumoniae в ожоговых отделениях была равна таковой P. aeruginosa, а в отделении гнойной остеологии - A. baumannii. Среди возбудителей инфекций K. pneumoniae становится одним из самых «проблемных» микроорганизмов, как по частоте выделения,
Таблица 1. Частота обнаружения основных возбудителей раневой инфекции в различных отделениях
Микроорганизм Отделение
Ожоги взрослых (%) Детские ожоги (%) Гнойная остеология (%)
Pseudomonas spp. (P. aeruginosa) 13,9 (10,1) 11,4 (9,4) 6,7 (6,1)
Acinetobacter spp. (A. baumannii) 16,1 (15,9) 14,9 (14,6) 3,8 (3,2)
Klebsiella spp. (K. pneumoniae) 10,9 (10,5) 9,4 (9,1) 4,0 (3,5)
Staphylococcus spp. (S. aureus) 32,5 (17,0) 35,2 (14,3) 57,0 (36,4)
Таблица 2. Резистентность K. pneumoniae в различных отделениях
Препарат Отделение
Ожоги взрослых (%) Детские ожоги (%) Гнойная остеология (%)
Имипенем 35,6 33,4 0
Меропенем 54,6 40,9 2,6
Дорипенем 58,1 76,2 5,2
Эртапенем 57,2 72,6 2,6
Амикацин 46,6 52,9 48,8
Нетилмицин 73,0 63,9 41,7
Полимиксин Е 6,6 4,1 2,5
Тигециклин 52,6 55,0 19,6
Цефоперазон/сульбактам 89,9 81,0 35,0
Тикарциллин/клавуланат 85,7 92,8 65,2
Гординская Н.А. и соавт.
КМАХ . 2017 . Том 19 . №3
Таблица 3. Основные результаты полногеномного секвенирования штаммов K. pneumoniae
АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ
Характеристика Номер штамма
№59 №254 №314 №339 №1083
Размер генома (п.н.) 5 139 940 4 872 766 5 138 885 5 067 508 5 169 366
ГЦ, % 57,8 58 57,8 57,8 57,8
Количество тРНК 83 86 80 111 87
Количество рРНК 32 28 34 27
Количество белок-кодирующих последовательностей 4713 4654 4926 4850 4969
Наличие профагов 2 1 2 2 2
так и в силу высокого уровня приобретенной резистентности в отношении разных классов антимикробных препаратов. В отношении цефалоспоринов III-IV поколений и фторхинолонов во всех отделениях 97-100% штаммов клебсиелл были устойчивы, фенотип резистентности к антибиотикам других классов представлен в таблице 2.
У пациентов отделения гнойной остеологии по сравнению с пациентами в отделениях термической травмы процент выделения клебсиелл был ниже, а также выявлено значительно меньшее количество полирезистентных штаммов. В ожоговых отделениях обнаружено большее число антибиотикорезистент-ных изолятов K. pneumoniae, причем в детском отделении к ряду препаратов резистентность была выше, чем в отделении взрослых пациентов с термической травмой. За исследуемый период самым активным препаратом среди карбапенемов в отношении клебсиелл во всех отделениях был имипенем.
Методом ПЦР у 78 карбапенеморезистентных штаммов (100%) были обнаружены гены БЛРС СТХ-М группы. Генов, кодирующих металло^-лактамазы, не было выявлено ни у одного штамма. У 62 карбапенеморезистентных изолятов (79,6%) K. pneumoniae обнаружены гены ОХА-48-подобных карбапе-немаз и только у 3 штаммов (3,8%) - наличие blaKpc.
Проведено полногеномное секвенирование 5 полирезистентных штаммов K. pneumoniae (4 штамма из ожоговых отделений и 1 штамм из отделения гнойной остеологии). Основные результаты полногеномного секвенирования и аннотирования клебсиелл представлены в таблице 3.
Типирование штаммов по схеме K. pneumoniae Multilocus Sequence Typing позволило определить принадлежность 3-х штаммов K. pneumoniae (N°N° 1083, 314, 59) к сиквенс-ти-пу ST395, одного штамма (№ 254) - к ST23. Сиквенс-тип K. pneumoniae №339 установить не удалось. Результаты поиска
Таблица 4. Детерминанты антибиотикорезистентности штаммов
K. pneumoniae
Штаммы K. pneumoniae
№59 №254 №314 №339 №1083
blaSHV-11 blaSHV-1 blaSHV-11 blaSHV-11 blaSHV-11
blaCTX-M-15 blaCTX-M-55 blaCTX-M-15 blaCTX-M-15 blaCTX-M-15
blaOXA-1 blaOXA-1 blaOXA-1 blaOXA-1 blaOXA-1
blaOXA-48 blaOXA-48 blaOXA-48 blaOXA-48
blaTEM-1 blaTEM-1 blaTEM-1
qnrS aac(6')-Ib-cr qnrS aac(6')-Ib-cr qnrS aac(6')-Ib-cr aac(6')-Ib-cr qnrS aac(6')-Ib-cr
aac(6')-Ib-cr aac(6')-Ib-cr aac(6')-Ib-cr aac(6')-Ib-cr aph(3')-Ia aac(6')-Ib-cr ant(2")-Ia ant(3")-Ia armA
Гординская Н.А. и соавт.
детерминант антибиотикорезистентности с использованием базы данных Klebsiella Sequence Typing представлены в таблице 4.
У всех 5 штаммов K. pneumoniae обнаружены гены, кодирующие бета-лактамазы SHV-1 функциональной группы 2b и имеющие хромосомную локализацию. Генов металло^-лакта-маз при полногеномном секвенировании клебсиелл выявлено не было. Как следует из данных, представленных в таблице 4, проявление множественной лекарственной устойчивости к различным группам антибактериальных препаратов связано, в первую очередь, с детерминантами, находящимися на мобильных элементах, и является приобретенным признаком.
Обсуждение результатов
Среди возбудителей раневых инфекций K. pneumoniae становится одним из самых «проблемных» микроорганизмов из-за высокого уровня резистентности к разным классам антимикробных препаратов. Проведенные исследования позволили определить природу и механизмы антибиотикорезистентности клинических изолятов K. pneumoniae, выделенных у пациентов ожоговых отделений и отделения гнойной остеологии.
Наиболее частым механизмом резистентности к карбапене-мам у K. pneumoniae, по данным иностранной литературы, является наличие blaKPC [2, 9]. Однако в Санкт-Петербурге blaKPC выявлены только у 2 из 754 штаммов K. pneumoniae [1]. По нашим данным, почти у 80% проанализированных штаммов K. pneumoniae обнаружен ген ОХА-48-подобных карбапенемаз, и только у 3 штаммов - blaKpc. Наличие гена blaOXA48 у российских штаммов K. pneumoniae, продуцирующих карбапенемазы, подтверждается результатами многоцентрового исследования «МАРАФОН» [6]. Распространение штаммов K. pneumoniae, продуцирующих ОХА-48 карбапенемазы, зарегистрировано также во Франции [13]. Основной причиной резистентности K. pneumoniae к карбапенемам, циркулирующих в Санкт-Петербурге, как и в ряде стран мира, Баранцевич Е.П. и соавт. называют наличие гена металло^-лактамаз группы NDM-1 и отмечают принадлежность штаммов к одному сиквенс-типу -ST340. Нами же за исследуемый период не выявлено NDM-1 ни у одного штамма. Следует также отметить, что раневые инфекции, вызванные K. pneumoniae, в стационарах нашего центра не носили эпидемического характера. Несмотря на ограниченное число штаммов, у которых выполнено MLST-генотипирова-ние, можно отметить, что набор детерминант антибиотикорези-стентности и их аллотипов у исследуемых штаммов во многом совпадал. Так, у двух штаммов K. pneumoniae (N°N° 59, 314) наблюдалось полное совпадение. Клинический изолят № 254, относящийся к ST23, отличался как по количеству детерминант, так и по аллельным вариантам.
Плазмиды всех 5 штаммов содержали гены, кодирующие оксациллиназу OXA-1. У 3 штаммов, относящихся к ST395,
обнаружены гены, кодирующие карбапенемазу OXA-48. В исследованиях Ageevets и соавт. (2014), Баранцевич Е.П. и со-авт. (2016) российские штаммы K. pneumoniae, имеющие ген OXA-48, также относились к сиквенс-типу 395.
У всех исследуемых изолятов были обнаружены гены, кодирующие БЛРС группы CTX-M цефалоспориназ. Четыре штамма K. pneumoniae несли широко распространенный аллотип blactxm 15, относящийся к эволюционной группе CTX-M-1. Литературных данных о наличии аллотипа bla^Mss' относящегося к группе CTX-M-9 (изолят № 254), среди российских изолятов K. pneumoniae нами не обнаружено.
Дополнительно в структуре мобильных элементов 4 штаммов был обнаружен ген дпгв-1, детерминирующий устойчивость к фторхинолонам. У всех штаммов присутствовал ген аас(6')-1Ь-сг, кодирующий аминогликозид ацетилтрансферазу, являющуюся бифункциональным ферментом, способствующим проявлению устойчивости как к фторхинолонам, так и к ами-ногликозидам. У двух изолятов выявлены гены, кодирующие аминогликозидмодифицирующие ферменты: фосфотрансфера-зу (изолят № 339) и аденилилтрансферазу (изолят № 1083). Также у изолята № 1083 обнаружен ген агтА, кодирующий метилазу 165 рРНК.
Литература
1. Barancevich E.P., Barancevich N.E., Shljahto E.V. Production of carbapenemases by nosocomial strains of K. pneumoniae in St. Petersburg. Klinicheskaja mikrobiologija i antimikrobnaja himioterapija. 2016;18:196-200. Russian. (Баранцевич Е.П., Баранцевич Н.Е., Шляхто Е.В. Продукция карбапенемаз нозокомиальными штаммами K. pneumoniae в Санкт-Петербурге. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2016;18:196-200.).
2. Borges C.A., de Cassia de Andrade M.R., Vieira M.A., Souza L.A. Multidrug resistance genes, including blakps and bla^m 2, among Klebsiella pneumoniae isolated in Recife, Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. 2012;45:572-578.
3. Yamamoto M., Pop-Vicas A.E. Treatment for Infections with Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: what options do we still have? Crit Care. 2014;18:229.
4. Ageevec V.A., Partina I.V., Lisicyna E.S., et al. Sensitivity of gram-negative bacteria, producers of carbapenemases, to antibiotics of various groups. Antibiotiki i himioterapija. 2013;58(3-4):10-13. Russian. (Агеевец В.А., Партина И.В., Лисицына Е.С. и соавт. Чувствительность грамотрица-тельных бактерий, продуцентов карбапенемаз, к антибиотикам различных групп. Антибиотики и химиотерапия. 2013;58(3-4):10-13.).
5. Bush K., Jacoby G.A. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2010;54:969-976.
6. Sukhorukova M.V., Edelstein M.V., Skleenova E.Ju., et al. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Enterobacteriaceae in Russian hospitals: results of the MARATHON multi-centre epidemiological survey in 2011 -2012. Klinicheskaja mikrobiologija i antimikrobnaja himioterapija. 2014;16:254-265. Russian. (Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю. и соавт. Анти-биотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011-2012 гг. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2014;16:254-265.).
7. Munoz-Price L.S., Poirel L., Bonomo R.A., et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases. Lancet Infect Dis. 2013;13:785-796.
8. Bialek-Davenet S., Criscuolo A., Ailloud F., et al. Genomic definition of hypervirulent and multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clonal groups. Emerg Infect Dis. 2014;20:1812-1820.
9. Monaco M., Giani T., Raffone M., et al. Colistin resistance superimposed to endemic carbapenemresistand Klebsiella pneumoniae: a rapidly evolving problem in Italy November 2013 to April 2014. Euro Surveill. 2014;19(42):14-18.
10. Ageevets V.A., Partina I.V., Lisitsyna E.S., et al. Emergence of carbapenemase-producing gram-negative bacteria in Saint Petersburg, Russia. Int J Antimicrob
Agents. 2014;44:152-155.
11. Susceptibility testing of microorganisms to antibacterial drugs. Interregional Association for Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. Clinical guidelines. Version 2014-11. Russian. (Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. Клинические рекомендации. Версия 2014-11.).
12. Sabirova E.V., Gordinskaja N.A., Abramova N.V., Karaseva G.N., Savochkina Ju.A. Microecology of the burn hospitals. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2017;62(5):310-312. Russian. (Сабирова Е.В., Гординская Н.А., Абрамова Н.В., Карасева Г.Н., Савочкина Ю.А. Микроэкология ожоговых стационаров. Клиническая лабораторная диагностика. 2017;62(5):310-312.).
13. Cuzon G., Ouanich J., Gondret T., Naas T., Nordmann P. Outbreak of OXA-48-positive carbapenevem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates in France. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55:2420-2423.
Гординская Н.А. и соавт.
