ИНТЕГРОНЫ КЛАССОВ 1 И 2 В ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММАХ ГРАМ-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ В МОСКВЕ И РЕГИОНАХ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

https://doi.org/10.1 7116/molgen201 9370111 7

Интегроны классов 1 и 2 в госпитальных штаммах грамотрицательных бактерий, выделенных в Москве и регионах Российской Федерации

Е.С. КУЗИНА, Е.И. АСТАШКИН, А.И. ЛЕВ, Е.Н. АГЕЕВА, Н.Н. КАРЦЕВ, Э.А. СВЕТОЧ, Н.К. ФУРСОВА

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, Московская обл., п. Оболенск, Россия

Природные системы клонирования и экспрессии мобильных генных кассет, улавливаемых с помощью сайтспецифиче-ской рекомбинации, интегроны классов 1 и 2 играют большую роль в мобилизации и распространении генетических детерминант антибиотикорезистентности у грамотрицательных бактерий возбудителей инфекций человека, особенно в госпитальной среде. Генные кассеты, локализованные в вариабельной части интегронов, детерминируют устойчивость к антибактериальным препаратам (АП) разных функциональных классов. Цель работы — детекция и характеристика инте-гронов классов 1 и 2 у грамотрицательных бактерий, выделенных в многопрофильных стационарах Москвы и других регионах РФ в 2003—2015 гг. Клинические штаммы грамотрицательных бактерий (л=1248) обладали преимущественно фенотипом множественной лекарственной устойчивости (94%) — 10% штаммов были устойчивы к АП трех функциональных групп, 1 9% — четырех, 42% — пяти, 1 7% — шести, 7% — семи. Высокий уровень устойчивости изучаемых штаммов к бета-лактамам ассоциирован с наличием у них генов бета-лактамаз типов blat, (35% штаммов), blaCLJt,(25%), bla„„,, (38%),

I ' ILM SHV CIX-M

blaOXA (31 %), blaV|M (3%) и blaNDM (2%), а к АП других функциональных групп — с наличием интегронов класса 1 (59%) и интегронов класса 2 (8%). Большая часть интегронов класса 1 (54%) и интегронов класса 2 (88%) содержали в своей вариабельной части 22 варианта наборов генных кассет в интегронах класса 1 и 4 варианта — в интегронах класса 2. В ходе исследования идентифицированы генные кассеты 31 типа (в том числе наиболее распространенные aadB, aacA4, aacCI, aadAI, aadA2, aadA5, blaVIM-2, dfrAI, dfrA7, dfrA12, orfC, orfE, orfY и satl), ассоциированные с устойчивостью штаммов к аминогликозидам, хлорамфениколу, сульфаниламидам и бета-лактамам, а также кассеты orf, кодирующие белки с неизвестными функциями. Идентифицированы новые наборы генных кассет: dfrA12s-orfF-aadA2 (In1249) и dfrA1-IS911-sat1-aadAI (not numbered).

Ключевые слова: грамотрицательные бактерии, множественная антибиотикорезистентность, мобильные генетические элементы, интегроны класса 1, интегроны класса 2, генные кассеты.

Class 1 and class 2 integrons in hospital strains of gramnegative bacteria isolated in Moscow and other regions of the Russian Federation

L.S. KUZINA, L.I. ASTASHKIN, A.I. LLV, L.N. AGLLVA, N.N. KARTSLV, L.A. SVLTOCH, N.K. FURSOVA

State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, 142279, Moscow region, Obolensk, Russia

Natural cloning and expression systems of mobile gene cassettes of class 1 and class 2 integrons play an important role in the mobilization and dissemination of antibiotic resistance genetic determinants in gram-negative bacterial human pathogens, especially in the hospital environment. Gene cassettes located in integron variable region determine the resistance to antibacterials (AB) of different functional classes. The purpose of the work is the detection and characterization of class 1 and class 2 integrons in gram-negative bacteria isolated in Moscow hospitals and other regions of the Russian Federation in 2003—2015. Clinical strains of gram-negative bacteria (n=1248) had predominantly the phenotype of multiple drug resistance (94% strains). Ten percent of strains were resistant to three AB functional groups, 19% — to four groups, 42% — to five groups, 17% — to six groups, 7% — to seven groups. A high level of resistance to beta-lactams is associated with beta-lactamase genes of blaTLM- (35% strains), blacw - (25% strains), bla,.TV „- (38% strains), bla_„.- (31% strains), bla^„ - (3% strains) и bla^n„-types (2% strains). Resistance to

SHV CTX-M OXA VIM NDM

other ABs is associated with class 1 (59%) and class 2 (8%) integrons. Most of class 1 integrons (54%) and class 2 integrons (88%)

© Коллектив авторов, 201 9

Для корреспонденции: Кузина Екатерина Сергеевна, аспирант ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279 Оболенск, Сер-пуховский район, Московская область, Российская Федерация; e-mail: [email protected]

For correspondence: Kuzina Ekaterina Sergeevna, PhD student of State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Rospo-trebnadzor, 142279 Obolensk, Serpukhov district, Moscow region, Russian Federation; e-mail: [email protected]

contain integron insertions in their variable regions: 22 variants of gene cassette arrays in class 1 integrons and 4 variants in class 2 integrons. Gene cassettes of 31 types were identified during the study including the most common aadB, aacA4, aacC1, aadA1, aadA2, aadA5, blaVIM-2, dfrA1, dfrA7, dfrA12, orfC, orfE, orfY and sat1 cassettes associated with the resistance to aminoglycosides, chloramphenicol, sulfonamides and beta-lactams, as well as orf cassettes encoding proteins with unknown functions. Novel gene cassette arrays have been identified: dfrA12s-orfF-aadA2 (In1249) and dfrA1-IS911 -sat1-aadA1 (not numbered).

Keywords: gram-negative bacteria, multi drug resistance, mobile genetic elements, class 1 integron, class 2 integron, gene cassette.

В настоящее время госпитальные инфекции представляют собой большую проблему для здравоохранения во всем мире [1—3]. В России доля изолятов грамотрицатель-ных бактерий среди бактериальных возбудителей нозоко-миальных инфекций (НИ) в 2013—2014 гг. составила 76,5% [4—6]. В последние 2 десятилетия среди возбудителей НИ отмечается тенденция к увеличению доли множественно лекарственно-устойчивых (МЛУ), экстремально устойчивых (ЭУ) и пан-устойчивых (ПУ) бактерий [7].

Большую роль в мобилизации и распространении генетических детерминант антибиотикорезистентности у бактерий играют мобильные генетические элементы (МГЭ): плаз-миды, бактериофаги, транспозоны, IS-элементы [8]. Инте-гроны — природные системы клонирования и экспрессии мобильных генных кассет, улавливаемых с помощью сайт-специфической рекомбинации, распространяются с помощью МГЭ и играют особую роль, поскольку являются «депо генов антибиотикорезистентности», аккумулирующим эти гены в виде генных кассет [9] и обеспечивающим их экспрессию с сильного интегронного промотора [10]. Интегроны широко распространены в геномах бактерий, выделяемых в разных экологических нишах: в госпитальной среде, в объектах внешней среды, в организмах человека и животных [11—14].

К настоящему времени на основании различий в первичной структуре гена интегразы описаны 5 классов инте-гронов, наиболее распространенными среди которых являются интегроны классов 1 и 2 [15]. В базе данных GenBank NCBI на дату 14.02.18 представлено 31 078 интегронов класса 1 и 27 624 интегронов класса 2 (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/). Описано более 130 генных кассет, более 80 наборов генных кассет в интегронах класса 1 и 6 типов наборов генных кассет в интегронах класса 2 [16]. В Российской Федерации также широко распространены интегроны классов 1 и 2 в геномах мультирезистентных штаммов грам-отрицательных бактерий [ 17—21 ].

Цель данной работы — детекция и характеристика ин-тегронов классов 1 и 2 в геномах грамотрицательных бактерий, выделенных в Москве и в других регионах РФ в 2003—2015 гг.

Материал и методы

Этические требования

Наша лаборатория не имела непосредственного контакта с пациентами лечебных учреждений. Изучаемые штаммы бактерий были получены в ходе сотрудничества с микробиологическими лабораториями ООО «Национальное агентство клинической фармакологии и фармации», Москва; ФГБУ «Детский научно-клинический центр инфекционных болезней Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург; ФГАУ «Национальный

научно-практическии центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России, Москва; ГБУЗ «Инфекционная клиническая больница № 1 Департамента здравоохранения Москвы». Изучаемые штаммы в своих названиях не содержат персональных данных о пациентах, таких как фамилия, имя, этническая принадлежность, возраст, религия, гендерная принадлежность и др. В соответствии с законодательством Российской Федерации каждый пациент при поступлении в лечебное учреждение подписывал информированное согласие на проведение медицинских процедур и диагностических тестов.

Штаммы бактерий и культивирование

Антибиотикорезистентные клинические штаммы грам-отрицательных бактерий выделены в Москве и других регионах России (n=1248) в 2003—2015 гг., в том числе штаммы семейства Enterobacteriaceae (n=694) и группы неферменти-рующих грамотрицательных бактерий (и=552). Бактерии культивировали при температуре 37 °С на питательных средах бульон и агар Мюллера—Хинтон («Himedia», Мумбаи, Индия). Видовую идентификацию бактерий проводили на приборах Vitek-2 Compact («Biomerieux», Лион, Франция) и MALDI-TOF Biotyper («Bruker», Карлсруэ, Германия). Бактериальные изоляты хранили в 40% глицерине при температуре —70 °С.

Определение чувствительности к антибактериальным

препаратам

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибактериальных препаратов: ампициллин (AMP); амокси-циллин/клавулановая кислота (AMC); амоксициллин-суль-бактам (AMS); цефуроксим (CXM); цефокситин (CEX); це-фотаксим (CTX); цефтриаксон (CRO); цефтазидим (CAZ); цефоперазон-сульбактам (CFP); цефепим (FEP); имипенем (IPM); меропенем (MEM); доксициклин (DOC); тигециклин (TGC); ципрофлоксацин (CIP); хлорамфеникол (CHL); ген-тамицин (GEN); тобрамицин (TOB); амикацин (AMK); три-метоприм (TMP); котримоксазол (CTZ); нитрофурантоин (NIT); колистин (CST) определяли на приборе Vitek-2 Compact (Biomerieux, Лион, Франция). Интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с указаниями Европейского комитета по тестированию антимикробной чувствительности «The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 7.1, 2017-03-10» (http://www.eucast. org). В качестве внутренних стандартов использовали чувствительный штамм E. coli ATCC 25922 и высокоустойчивый штамм E. coli ATCC 35218.

Детекция генов антибиотикорезистентности

Методом ПЦР со специфичными праймерами определяли гены, кодирующие бета-лактамазы 5 типов: blaCTXM

[Щ [23], blaSHV [I9], WaOXA [24], blav,M [25], [26L

а также интегразы класса 1 [27] и класса 2 [28], и наборы кассет интегронов классов 1 и 2 [29]. Состав реакционной смеси и режимы амплификации соответствовали ранее описанным для обозначенных праймеров. В качестве матрицы для амплификации использовали термолизаты [19]. ПЦР проводили в приборах GradientPalmCycler («Corbertt Research», Мортлейк, Австралия) и Терцик («ДНК-Технология», Протвино, Россия) с последующей электрофоре-тической детекцией продуктов амплификации в 1,5% ага-розном геле.

Секвенирование ДНК

Реакцию секвенирования осуществляли с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 kit («Thermo Fisher Scientific», Уолтем, США) на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3100-Avant (SYNTOL, Москва, Россия).

Биоинформационный анализ

Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с помощью программ Vector NTI9 («Invitrogen», Уо-

Таблииа 1. Наборы генных кассет интегронов классов 1 и 2, идентифицированных в клинических штаммах грамотри-цательных бактерий, в базе данных GenBank

Класс интегрона

Набор генных кассет

Интегрон (база данных INTEGRAL)

Номер размещенной нуклеотидной последовательности набора генных кассет в базе данных GenBank

Количество ссылок на интегрон в базе данных GenBank на 10.03.18

aacA4 aacA4-cmlA1j aacA4-orfD aacA 7-smr2-orfD aacCl-oifX-oifY-aadA 1 aadAl

aadA2 aadA7 aadA6-orfD

aadB aadB-aadA ly aadB-catB3 blaOXA30-aadA1

blaPSEl dfrA 12-orfF-aadA2

dfrA 12s-orfF-aadA2 dfrA17-aadA5

dfrAl-aadAl dfrAl-orfC dfrA5-ereA2 dfrA7 estX

orfD2-aacA4'-17-

oifE14-catB8 dfrA 12-sat2-aadA 1 dfrA 1-IS911-sat1-aadA 1 dfrA1-sat2 dfrA 1-sat2-aadA 1

ln46 HQ832472, HQ832473, JN003857

ln838 HM043570, HM043571, HM569733

ND GQ924771

ln673 HQ832478, HQ832479

ln561 KM009103, KM009104, KM009105, KR610434

ln2 GQ924774, GQ924775, GQ924776, GQ924777, KP789949,

KP902674, KU 860564 ln 127 GU001948

ln142 —

ln51 HQ832477, KP713392, KU870999

ln7 GQ924772, GQ924773

ln822 HQ914241, KU901703, KY885012

ln299 HQ914240

ln322 GQ924769, JN003856

ln 167 HQ832476

ln27 GQ924762, GQ924763, GQ924764, GQ924765, GQ924766, GQ924767, GU001949, HM043572, HM043573, HM043574, HM569734, KJ363320, KM009101, KM236804, KP789948, KP796139, KP902672, KP965723, KR610433 ln1249 KT316808

ln54 GQ896493, GQ896494, GQ896495, GQ896496, GQ896497, GQ896498, GQ896499, GQ896500, GQ896501, GU055937, KF952266, KJ579283, KM009102, KM085438, KP713389, KP713390, KP713391, KP789947, KP789950, KP902673, KR610432, KT175892, KT175893, KT175894, KT175895, KT305944, KT305945, KT305943, KT316804, KT316805, KU860565

ln369 GQ924770, KR610435, KT305946

ln363 KC862254, KC862255, KC862256, KF971879

ln398 GQ924768

ln22 KP789951

ND KP965724

ln609 HM485586

ln-2-4 KJ579284

ND HM592262

ln2-3 KP796141, KP796142

ln-2-4 HM043575, HM043576, HM043577, KJ633801, KM009106, KM009107, KM085439, KM085440, KP271998, KP713393, KP796140, KP965725, KT175896, KT316806, KT316807, KX274124

5960 5960 39 3

45

6652

4993 151 39 14597 14597 42

6543 0

196

214 1220

4 77 16 918 3298 482

13 2

1302 1093

Примечание. ND — номер интегрона не определен.

а

б

Рис. 1. Фенотипы антибиотикорезистентности штаммов грамотрицательных бактерий.

а — чувствительность к антибактериальным препаратам: AMP — ампициллин; AMC — амоксициллин/клавулановая кислота; AMS — амоксициллин-сульбактам; CXM — цефуроксим; CEX — цефокситин; CTX — цефотаксим; CRO — цефтриаксон; CAZ — цефтазидим; CFP — цефоперазон-сульбакта; FEP — цефепим; 1PM — имипенем; MEM — меропенем; DOC — доксициклин; TGC — тигециклин; C1P — ципрофлоксацин; CHL — хлорамфеникол; GEN — гентамицин; TOB — тобрамицин; AMK — амикацин; TMP — триметоприм; CTZ — котримоксазол; N1T — нитрофурантоин; CST — колистин; б — доля штаммов, устойчивых одновременно к нескольким функциональным классам: АП — антибактериальные препараты; ЭБ — энтеробактерии, НГОБ — неферментирующие грамотрицательные бактерии.

лтем, США), CHROMAS (Technelysium Pty Ltd.; http:// technelysium.com.au) и веб-ресурса BLAST (http://blast.nc-bi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Анализ структуры интегронов проводили с помощью веб-ресурса INTEGRAL (http://integrall. bio.ua.pt/?).

Подсчет количества ссылок на интегроны в базе данных GenBank осуществляли на дату 10.03.18, производя поиск по названиям генных кассет в разделе «Nucleotide» веб-ресурса NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Депонирование последовательностей ДНК в базе

данных GenBank

В базе данных GenBank размещены 95 нуклеотидных последовательностей интегронных наборов кассет 22 интегронов класса 1 и 20 нуклеотидных последовательностей интегронных наборов кассет 4 интегронов класса 2 (табл. 1).

Результаты и обсуждение

Коллекция изучаемых штаммов и их чувствительность к антибактериальным препаратам

Клинические штаммы грамотрицательных бактерий (n=1248), в том числе Pseudomonas aeruginosa (n=320), Klebsiella pneumoniae (n=271), Acinetobacter baumannii (n=232), Escherichia coli (n=191), Enterobacter spp. (n=132), Proteus spp. (n=67), Citrobacter freundii (n=13), Serratia spp. (n=8), Morganella morganii (n=7), Salmonella enterica (n=2), Achromo-bacter xylosoxidans (n=2), Providencia spp. (n=2), Shigella flexneri (n=1), выделены из дыхательной системы (n=493), мочевыделительной системы (n=379), хирургических ран (n=159), пищеварительного тракта (n=77), крови (n=60), нервной системы (n=28), кожи и слизистых оболочек (n=15) от пациентов многопрофильных стационаров Мо-

Таблица 2. Представленность интегронов классов 1 и 2 у грамотрииательных бактерий

Виды бактерий

Количество штаммов, шт.

Количество штаммов, несущих интегроны (доля, %)

класс 1 класс 2

E. coli 191 131(69) 22 (12)

K. pneumoniae 267 140 (52) 10 (4)

P. mirabilis 64 27 (42) 48 (75)

Другие энтеробактерии 172 129 (75) 22 (13)

A. baumannii 228 113 (50) 1 (0,4)

P. aeruginosa 320 196 (61) 1 (0,3)

Другие НГОБ 6 1 (17) 0 (0)

Всего 1248 737 (59) 105 (8)

Рис. 2. Представленность генов бета-лактамаз в штаммах грамотрииательных бактерий.

* — гены bla^-типа выявлены только у K. pneumoniae; ** — гены Ь1аУ1М-типа выявлены только у P. aeruginosa; *** — гены blaOXA (blaOXA -blaOXA - и blaOXA 5|- типов) выявлены только у A. baumannii; ЭБ — энтеробактерии, НГОБ — неферментирующие грамотрицательные бактерии.

сквы и других регионов РФ в 2003—2015 гг., а также из госпитальной среды (п=37). Анализ чувствительности к антимикробным препаратам показал преобладание штаммов, устойчивых к бета-лактамам, в том числе к пенициллинам (99% штаммов), цефалоспоринам (95%) и карбапенемам (20%); к аминогликозидам (87%), хлорамфениколу (74%) и сульфаниламидам (72%) (рис. 1, а). У 94% штаммов коллекции был выявлен фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) — устойчивость к антимикробным препаратам 3 и более функциональных классов, в соответствии с классификацией А.Р. Mаgюrаkos и соавт. [8]. Среди МЛУ штаммов 10% были устойчивы к 3 функциональным группам препаратов, 19% — к 4, 42% — к 5, 17% — к 6, 7% — к 7 (см. рис. 1, б).

Генетические детерминанты устойчивости к бета-

лактамам

Высокий уровень устойчивости изучаемых штаммов к бета-лактамам — пенициллинам, цефалоспоринам и карбапенемам — ассоциирован с наличием у них генов бе-

та-лактамаз типов blaTEM (35% штаммов), blaSHV (25%), WaCTX-M (38%), blaaxA (31%), Wav|M (3%) и WaNDM (2%) (рис. 2). Стоит подчеркнуть, что для разных видов бактерий характерны разные гены бета-лактамаз. Так, гены bla^-типа детектированы только у K. pneumoniae (92% штаммов); гены bla^-типа выявлены только у P. aeruginosa (17%); гены bla-OXA (blaOXA-4l)- blaOXA-23- и bla^^-типов) выявлены только у A. baumannii (88%).

Интегроны классов 1 и 2

В ходе исследования выявлено 842 интегрона, в том числе класса 1 — 737 интегронов (59% штаммов) и класса 2 — 105 интегронов (8% штаммов). При этом интегроны детектированы в 43% штаммов энтеробактерий и в 25% штаммов неферментирующих грамотрицательных бактерий. Наибольшее количество интегронов класса 1 выявлено у E. coli, P. aeruginosa и K. pneumoniae, а интегронов класса 2 — у P. mirabilis (табл. 2). Большая часть интегронов класса 1 (54%) и интегронов класса 2 (88%) содержали в своей вариабельной части наборы генных кассет, ассоци-

Таблица 3. Генные кассеты антибиотикорезистентности интегронов классов 1 и 2, идентифицированные в клинических штаммах грамотрицательных бактерий

Генная Синонимы Кодируемый фермент Устойчивость Представлен-

кассета ность в базе данных GenBank на 10.03.18

aacAl aac(6')-la Аминогликозид (6') ацетилтрансфераза AG 116

aacA4 aac(6')-lb Аминогликозид (6') ацетилтрансфераза AG 8151

aacA7 aac(6')-ll Аминогликозид (6') ацетилтрансфераза AG 666

aacCl aac(3)-la Аминогликозид (3) ацетилтрансфераза AG 1836

aadAl ant(3")-la Аминогликозид (3) аденилилтрансфераза STR, SPE 6699

aadA2 — Аминогликозид (3) аденилилтрансфераза STR, SPE 5092

aadA5 — Аминогликозид (3) аденилилтрансфераза STR, SPE 1438

aadA6 aadAll Аминогликозид (3) аденилилтрансфераза STR, SPE 261

aadA7 — Аминогликозид (3) аденилилтрансфераза STR, SPE 149

aadB ant(2")-la Аминогликозид (2'') аденилилтрансфераза STR, SPE 14597

blaOXA-1 b/a0XA-30 Бета-лактамаза класса D ОХА-типа BL 391

b/aPSE1 — Металло-бета-лактамаза класса В PSE-типа BL 25

b/aVlM-2 — Металло-бета-лактамаза класса В У1М-типа BL 7589

catB3 — Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза СМ 685

catB8 — Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза СМ 700

cmlAl — Хлорамфеникол-экспортер СМ 939

dfrAl dhfrlb, dfrl, dhfrl Дигидрофолат-редуктаза тип А THR 4295

dfrA5 dhfrV, dfrV Дигидрофолат-редуктаза тип А THR 447

dfrA7 dhfrVll, dfrVll, dfrAl7 Дигидрофолат-редуктаза тип А THR 2398

dfrAl2 dhfrXll, dfrl2 Дигидрофолат-редуктаза тип А THR 2666

dfrB4 dhfr2, dfr2b Дигидрофолат-редуктаза тип В THR 58

ereA2 — Эритромицин-эстераза ERI 36

orfC gcuC, orfX Гипотетический белок НИ 6550

orfD gcuD Гипотетический белок НИ 952

orfE gcuE Гипотетический белок НИ 1556

orfF gcuF Гипотетический белок НИ 960

orfY gcuQ, orfX\orfXB, orflO Гипотетический белок НИ 3955

satl sat2 Стрептотрицин-ацетилаза STT 4632

estX — Эстераза Инсектициды 3298

smr2 smr, orfO Небольшой белок множественной резистентности BL, AG, CM, THR, QNL 191

dfrAl2s — Дигидрофолат-редуктаза тип А THR 0

Примечание. AG — аминогликозиды, BL — бета-лактамы, СМ — хлорамфеникол, ERI — эритромицин, НИ — неизвестно, SPE — спек-тиномицин, STR — стрептомицин, STT — стрептотрицин, THR — триметоприм, QNL — фторхинолоны.

ированных с устойчивостью штаммов к антибактериальным препаратам разных функциональных групп (амино-гликозидам, хлорамфениколу, сульфаниламидам и бе-та-лактамам), а также кассеты о/, кодирующие белки с неизвестными функциями.

Наборы генных кассет интегронов классов 1 и 2

В ходе исследования выявлено 22 варианта наборов генных кассет в интегронах класса 1 и 4 варианта — в ин-тегронах класса 2 (рис. 3). Интегроны класса 1 имели наборы, состоящие из 1 генной кассеты (аасА4; aadA1; aadA2; ааёБ; blaPSE1; ё/гА 7; estX), из 2 генных кассет (аасА4-ст1АУ; aacA4-orfD; aadA6-oгfD; ааёБ-ааёА1у; ааёБ-са1Б3; Ыа-ОХА30-ааёА1; ё/гА17-ааёА5; ё/гА1-ааёА1; ё/гА1-ог/С; ё/гА5-егеА2), из 3 генных кассет (aacA7-smr2-orfD; ё/гА12-о^-ааёА2; dfrA12s-orfF-aadA2) и из 4 генных кассет (аасС1-ог/Х-ог/У-ааёА1; о^2-аасА4'-17-ог/Е14-са1Б8). Интегроны класса 2 содержали наборы из 2 генных кассет (ё/гА1^12) и 3 генных кассет (dfrA12-sat2-aadA1; dfrA1-IS911-sat1-

aadAl; dfrAl-sat2-aadAl). Оценка распространенности наборов генных кассет, идентифицированных в данном исследовании, на основании представленности аннотированных последовательностей интегронов в геномах бактерий в базе данных GenBank, показала, что интегроны класса 1 (n=62 597) существенно более распространены по сравнению с интегронами класса 2 (n=2410). Среди идентифицированных нами интегронов класса 1 наиболее представлены в базе данных GenBank на дату 10.03.18 интегроны, несущие 1 генную кассету (n=33 120) и 2 генные кассеты (n=28 537), а менее представлены интегроны с 3 кассетами (n=413) и 4 кассетами (n=527). У интегронов класса 2 описаны наборы с 2 генными кассетами (n=1302) и с 3 генными кассетами (n=1108) (см. табл. 1).

Идентификация новых генных наборов интегронов

В клиническом штамме E. coli 1-7433, выделенном из мочи пациента в стационаре Москвы в 2014 г., идентифицирован новый интегрон класса 1, которому в базе данных

Рис. 3. Варианты наборов генных кассет в интегронах классов 1 и 2 в штаммах грамотрицательных бактерий.

аМ1 — первичный сайт рекомбинации интегронов; а^С — сайт рекомбинации генных кассет; х — нуклеотидная замена Т305-С, которая привела к аминокислотной замене УаП02-А!а в составе кодируемого фермента генной кассеты dfrA12s.

INTEGRAL присвоен номер In1249. Секвенирование вариабельной части этого интегрона выявило наличие 3 генных кассет (dfrA12s-orfF-aadA2), причем генная кассета dfrA12s [GenBank KT316808] является новым аллелем гена, кодирующего дигидрофолат-редуктазу, которая обеспечивает устойчивость к триметоприму. Анализ первичной структуры гена показал наличие значимой нуклеотидной замены Т305-С, которая привела к аминокислотной замене Val102-Ala в составе кодируемого фермента.

В клиническом штамме S. flexneri Y-5, выделенном во время вспышки дизентерии в Якутске в 2010 г., идентифицирован новый интегрон класса 2, в котором структура генной кассеты dfrAl нарушена вставкой последовательности 1S911 (1256 п.н.). Данная структура генетической кассеты (dfrA1-lS911-sat1-aadA1) не была описана ранее и депонирована нами в базе GenBank под номером HM592262. Уникальность структуры и присутствие во всех изолятах S. flexneri, выделенных при вспышке дизентерии, позволили использовать интегрон класса 2 в качестве мо-лекулярно-генетического маркера для эпидемиологического анализа и сделать вывод о клональности данной вспышки.

Генные кассеты антибиотикорезистентности

В ходе исследования идентифицированы генные кассеты 31 типа. Анализ представленности этих типов кассет в базе данных GenBank показал, что более распространенными у бактерий на дату 10.03.18 являлись генные кассеты aadB, aacA4, aacCl, aadAl, aadA2, aadA5, blaVlM-2, dfrAl, dfrA 7, dfrA12, orfC, orfE, orfY и satl, а менее распространенными — aacAl, aadA6, aadA7, blaPSE1, dfrB4, ereA2, smr2и dfrA12s (табл. 3). В исследовании итальянских авторов 2009 г. наиболее представленными генными кассетами были:

aadAl (259 ссылок), aacA4 (204 ссылки), dfrAl (162 ссылки), aadA2 (150 ссылок) и aadB (89 ссылок) [16]. За прошедшие 9 лет представленность этих генных кассет в базе данных GenBank увеличилась в 25, 40, 27, 34 и 164 раза соответственно.

Заключение

Интегроны классов 1 и 2 являются важным молеку-лярно-генетическим механизмом формирования фенотипа МЛУ у грамотрицательных бактерий, выделенных от пациентов и из госпитальной среды многопрофильных стационаров Москвы и других регионов Российской Федерации в 2003—2015 гг. В ходе исследования подтверждена общепризнанная роль интегронов в качестве своеобразного «депо» генетических детерминант анти-биотикоустойчивости и «резерва» для создания новых комбинаций генных кассет. Описанные новые модификации генных кассет (dfrA12s и dfrA1-lS911) могут служить полезными молекулярно-генетическими маркерами для отслеживания распространенности кассет, эволюции наборов генных кассет и при эпидемиологическом анализе. Проведенный анализ генных кассет на основании представленности в базе данных GenBank и идентифицированных в ходе исследования указывает на широкую распространенность интегронов классов 1 и 2 в геномах клинических штаммов бактерий, выделенных в разных регионах мира.

Авторы благодарны за предоставленные для исследования клинические штаммы бактерий к.б.н. А.Н. Круглову, с.н.с. (ООО «НАКФФ», Москва), д.б.н., проф. С.В. Сидоренко (ФГБУ «ДНКЦ ИБ ФМБА», Санкт-Петербург), д.м.н., доценту О.Н. Ершовой (ФГАУ «ННПЦН им. акад. Н.Н. Бур-

денко» Минздрава России, Москва), к.м.н. В.Е. Маликову (ГБУЗ «ИКБ №1ДЗМ»).

Работа выполнена в рамках Федеральной темы НИР 049 Роспотребнадзора «Мониторинг и изучение свойств возбудителей пищевых и госпитальных инфекций, разработка средств их диагностики» (2016—2020 гг.).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014. Geneva, April 30, 2014. Geneva, 2014.

2. Harbarth S, Balkhy HH, Goossens H, Jarlier V, Kluytmans J, Laxminarayan R, et al. Antimicrobial resistance: one world, one fight! Antimicrob Resist Infect Control. 2015;4:49.

3. Эйдельштейн М.В., Сухорукова М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Шек E. А. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013—2014. Клин микробиол, антимикробхимиотер. 2017;19(1):42-48. [Eidelshtein MV, Sukhorukova MV, Skleenova EYu, Ivanchik NV, Shek EA, et al. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Acinetobacter spp. in hospitals in Russia: the results of a multicenter epidemiological study «MARATHON» 2013— 2014. Clin Microbiol Antimicrobial Chemother. 2017;19(1):42-48. (In Russ.)].

4. Эйдельштейн М.В., Сухорукова М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Микотина А.В. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013—2014. Клин микробиол антимикроб химиотер. 2017; 19(1 ):37-41. [Eidelshtein MV, Sukhorukova MV, Skleenova EYu, Ivanchik NV, Mikoti-na AV. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in Russian hospitals: results of a multicentre epidemiological study «MARATHON» 2013—2014. Clin Microbiol Antimicrobial Chemother. 2017;19(1):37-41. (In Russ.)].

5. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Микотина А.В. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013— 2014. Клин микробиол антимикроб химиотер. 2017; 19(1 ):49-56. [Sukhorukova MV, Eidelshtein MV, Skleenova EYu, Ivanchik NV, Mikotina AV. Antibiotic resistance of nosocomial strains of Enterobacteriaceae in Russian hospitals: results of a multicentre epidemiological study «MARATHON» 2013—2014. Clin Microbiol Antimicrobial Chemother. 2017;19(1):49-56. (In Russ.)].

6. Magiorakos AP, Srinivasan A, Carey RB, Carmeli Y, Falagas ME, Giske CG, at al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 2012;18(3):268-281.

7. Hall JPJ, Brockhurst MA, Harrison E. Sampling the mobile gene pool: innovation via horizontal gene transfer in bacteria. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2017;372(1735):pii 20160424.

8. Tsafnat G, Copty J, Partridge SR. RAC: Repository of Antibiotic resistance Cassettes. Database (Oxford). 2011;bar054.

9. Michael CA, Labbate M. Gene cassette transcription in a large integronas-sociated array. BMC Genetics 2010; 11:82.

10. Graham DW, Knapp CW, Christensen BT, McCluskey S, Dolfing J. Appearance of ß-lactam Resistance Genes in Agricultural Soils and Clinical Isolates over the 20(th) Century Sci Rep. 2016;6:21550.

11. Wu RB, Alexander TW, Li JQ, Munns K, Sharma R, McAllister TA. Prevalence and diversity of class 1 integrons and resistance genes in antimicrobial-resistant Escherichia coli originating from beef cattle administered subtherapeutic antimicrobials. J Appl Microbiol. 2011;111 (2):511 -523.

12. Koczura R, Semkowska A, Mokracka J. Integron-bearing Gram-negative bacteria in lake waters. Lett Appl Microbiol. 2014;59(5):514-519.

13. Deng Y, Bao X, Ji L, Chen L, Liu J, Miao J, et al. Resistance integrons: class 1, 2 and 3 integrons. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2015;14:45.

14. Michael R. Gillings Integrons: Past, Present, and Future Microbiol. Mol Biol Rev. 2014;78(2):257.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

15. Partridge SR, Tsafnat G, Coiera E, Iredell JR. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol Rev. 2009;33(4):757-

784.

16. Egorova S, Kaftyreva L, Grimont PA, Weill FX. Prevalence and characterization of extended-spectrum cephalosporin-resistant nontyphoidal Salmonella isolates in adults in Saint Petersburg, Russia (2002—2005). Microb Drug Resist. 2007;13(2):102-107.

17. Toleman MA, Vinodh H, Sekar U, Kamat V, Walsh TR. blaV1M-2-harbor-ing integrons isolated in India, Russia, and the United States arise from an ancestral class 1 integron predating the formation of the 3' conserved sequence. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51(7):2636-2638.

18. Priamchuk SD, Fursova NK, Abaev IV, Kovalev luN, Shishkova NA, Pech-erskikh El, et al. Genetic determinants of antibacterial resistance among nosocomial Escherichia coli, Klebsiella spp., and Enterobacter spp. isolates collected in Russia within 2003—2007. [Article in Russian]. Antibiot Khimioter. 2010;55(9-10):3-10.

19. Edelstein MV, Skleenova EN, Shevchenko OV, D'souza JW, Tapalski DV, et al. Spread of extensively resistant V1M-2-positive ST235 Pseudomonas aeruginosa in Belarus, Kazakhstan, and Russia: a longitudinal epidemiological and clinical study. Lancet infect Dis. 2013;13(10):867-876.

20. Solomennyi A, Goncharov A, Zueva L. Extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii belonging to the international clonal lineage 1 in a Russian burn intensive care unit. int J Antimicrob Agents. 2015;45(5):525-528.

21. Edelstein M, Pimkin M, Palagin 1, Edelstein 1, Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of CTX-M extended-spectrum beta-lact-amase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47(12):3724-3732.

22. Rasheed JK, Biddle JW, Anderson KF, Washer L, Chenoweth C, Perrin J, et al. Detection of the Klebsiella pneumoniae carbapenemase type 2 Car-bapenem-hydrolyzing enzyme in clinical isolates of Citrobacterfreundii and K. oxytoca carrying a common plasmid. J Clin Microbiol. 2008;46(6):2066-2069.

23. Poirel L, Carbonnelle E, Bernabeu S, Gutmann L, Rotimi V, at al. 1mpor-tation of OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae from Kuwait. J Antimicrob Chemother. 2012;67(8):2051-2052.

24. Dallenne C, Da Costa A, Decré D, Favier C, Arlet G. Development of a set of multiplex PCR assays for the detection of genes encoding important be-ta-lactamases in Enterobacteriaceae. J Antimicrob Chemother. 2010;65(3):490-495.

25. Yang J, Chen Y, Jia X, Luo Y, Song Q, Zhao W, et al. Dissemination and characterization of N DM-1 -producing Acinetobacterpittii in an intensive care unit in China. Clin Microbiol infect. 2012;18(12):506-513.

26. Machado E, Cantón R, Baquero F, Galán JC, Rollán A, et al. 1ntegron content of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli strains over 12 years in a single hospital in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(5):1823-1829.

27. Skurnik M, Hyytiäinen HJ, Happonen LJ, Kiljunen S, Datta N, et al. Characterization of the Genome, Proteome, and Structure of Yersiniophage фR1-37. J Virol. 2012;86(23): 12625-12642.

28. Jiang X, Ni Y, Jiang Y, Yuan F, Han L, et al. Outbreak of infection caused by Enterobacter cloacae producing the novel VEB-3 beta-lactamase in China. J Cli. Microbiol. 2005;43(2):826-831.

Поступила в редакцию 10.04.18 После доработки 23.04.18 Принята к публикации 15.11.18